このプロトコルは、嚢胞性線維症(CF)の新しい診断アッセイである直腸オルガノイド形態分析(ROMA)について説明しています。形態学的特徴、すなわち真円度(円形度指数、CI)および内腔の存在(強度比、IR)は、CFTR機能の尺度である。189人の被験者の分析は、CFと非CFの間の完全な識別を示しました。
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この記事について
サマリー
要約
嚢胞性線維症(CF)の診断は、特に汗の塩化物濃度が中程度である場合、および/または2つ未満の疾患の原因となる CFTR 変異を特定できる場合、必ずしも簡単ではありません。生理学的CFTRアッセイ(鼻電位差、腸電流測定)は診断アルゴリズムに含まれていますが、必ずしも容易に利用可能または実行可能であるとは限りません(例:乳児)。直腸オルガノイドは、特定の条件下で培養した場合に直腸生検の陰窩から分離された幹細胞から成長する3D構造です。非CF被験者からのオルガノイドは、CFTRを介した塩化物輸送が水を内腔に送り込むため、丸い形状と液体で満たされた内腔を有する。CFTR機能に欠陥のあるオルガノイドは膨潤せず、不規則な形状を保ち、目に見える内腔を持たない。CFオルガノイドと非CFオルガノイドの形態の違いは、新しいCFTR生理学的アッセイとして「直腸オルガノイド形態分析」(ROMA)で定量化されています。ROMAアッセイでは、オルガノイドを96ウェルプレートにプレーティングし、カルセインで染色し、共焦点顕微鏡でイメージングします。形態学的差異は、2つの指標を使用して定量化されます:円形度指数(CI)はオルガノイドの真円度を定量化し、強度比(IR)は中心内腔の存在の尺度です。非CFオルガノイドは、CFオルガノイドと比較してCIが高く、IRが低い。ROMAインデックスは、CFの167人の被験者とCFのない22人の被験者を完全に区別し、ROMAをCF診断に役立つ魅力的な生理学的CFTRアッセイにしました。直腸生検は、ほとんどの病院ですべての年齢層で日常的に行うことができ、組織はオルガノイド培養とROMAのために中央研究所に送ることができます。将来的には、ROMAはCFTRモジュレーターの有効性を in vitroで試験するためにも適用される可能性があります。本レポートの目的は、ROMAに使用される方法を完全に説明し、他のラボでの複製を可能にすることです。
概要
嚢胞性線維症(CF)は、CF膜貫通コンダクタンス制御因子(CFTR)遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患です。CFTRタンパク質は塩化物および重炭酸塩チャネルであり、いくつかの上皮1の水和を確実にする。CFは、主に呼吸器疾患として現れるだけでなく、胃腸管、膵臓、肝臓、および生殖管にも影響を与える、高負荷で寿命を縮める多系統疾患です2。
病気の原因となるCFTR変異は、 CFTR の量または機能の低下につながり、粘液脱水を引き起こします。 CFTR 遺伝子には2,000を超える変異体が記載されており3、そのうち466のみが完全に特徴付けられています4。
CFの診断は、汗塩化物濃度(SCC)が60 mmol / Lのしきい値を超えている場合、または2つの疾患の原因となるCFTR変異(CFTR2データベースによる)が特定された場合に行うことができます4,5。汗検査の約4%〜5%で発生する中程度に上昇した(30〜60 mmol / L)SC....
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プロトコル
ヒト組織に関わるすべての手順について、倫理委員会研究UZ/KUルーヴェン(EC研究)の承認を取得しました。すべての研究は、親、代表者、および/または患者からのインフォームドコンセントおよび/または同意を得て実施されました。
注:直腸生検およびオルガノイドを含むすべての手順は、研究者を生物学的危険から保護し、培養物の汚染のリスクを最小限に抑えるために、層流で実行する必要があります。ラボの手順に関しては、研究者は常にサンプルを操作するために白衣、手袋、および安全ゴーグルを着用する必要があります。
1.直腸生検、陰窩からの成体幹細胞の分離、およびオルガノイド培養
- 培地の製造と使用、オルガノイド培養、分割、拡張、およびバイオバンキングのための凍結を含むプロトコルのこの最初の部分については、以前に公開された2つのプロトコル8,12に従います。
- つまり、次の手順を実行する必要があります。
- 鉗子または吸引装置を使用して3〜4回の直腸生検を行い、滅菌容器(例:.、1.5 mLマイクロ遠心チューブ)に、上記のプロトコルに記載されているAd-DF + ++培地で収集します。
- 生検を氷上または4°Cで中央ラボに輸送しま....
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結果
212人の被験者からのオルガノイドは、定期的な臨床訪問中に収集されました。直腸生検処置中または直腸生検後に有害事象は発生しなかった。オルガノイドは、遺伝子型や臨床情報などの被験者の特徴を知らされていない1人の研究者によって画像化されました。画像の品質が低いため、23人の被験者が除外されました。オルガノイド培養と画像取得の成功例と失敗例を 図2に示します。
CFおよび2つの疾患の原因となるCFTR変異を有する167人の被験者( CFTR2 データベース4で定義)および22人の非CF被験者のオルガノイドを分析した。培養物あたりのオルガノイドの平均量は1,519個(ウェルあたり約40〜50個のオルガノイド)でした。分析に含まれる培養物あたりのオルガノイドの平均量は77%でした(構造の数≥60 μmを構造の数で割ったもの≥40 μm、典型的なCFまたは非CFの形態を反映するのに十分な大きさのオルガノイドの割合に相当)。
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ディスカッション
直腸オルガノイド形態解析(ROMA)のための詳細なプロトコルを提供します。ROMA、IR、およびCIで計算された2つの指標は、CFのある被験者とCFのない被験者のオルガノイドを完全な精度で区別しました。したがって、ROMAは、SCCおよび他の現在利用可能な試験を補完する新しい生理学的CFTRアッセイとして機能する可能性がある13、14、15。
このプロトコルは、10,11の前に説明したように、CFTRが機能しているときに丸い形状と中心内腔を持つ腸オルガノイドの使用に依存しています。オルガノイドは、新規CF治療の評価においてますます使用されている(例えば、FISアッセイ8)。ROMAプロトコルはFISアッセイプロトコルと統合することがで.......
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開示事項
この研究は、ベルギーのCF患者協会「Mucovereniging/Association Muco」、ベルギー小児科学会BVK-SBP 2019の研究助成金、およびUZルーヴェントランスレーショナル生物医学研究基金からの助成金によって資金提供されました。著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
この研究に参加した患者と保護者に感謝します。オルガノイドを使ったすべての培養作業について、アビダビビに感謝します。エルス・アールトゲルツ、カロリアン・ブルニール、クレア・コラード、リリアン・コリニョン、モニーク・デルフォス、アニヤ・デルポルト、ナタリー・フェイヤールツ、セシル・ランブルモン、ルート・ニューボルグ、ナタリー・ピーターズ、アン・ラマン、ピム・サンセン、ヒルデ・スティーブンス、マリアンヌ・シュルテ、エルス・ヴァン・ランズビーク、クリステル・ヴァン・デ・ブランデ、グリート・ヴァン・デン・アインデ、マーリーン・ヴァンデルケルケン、インゲ・ヴァン・ダイク、オードリー・ワグネル、モニカ・ワスキエヴィッチ、バーナード・ウェンデリックスの後方支援に感謝します。また、Mucovereniging/Association Muco、特にStefan JorisとJan Vanleeuwe博士の支援と資金提供にも感謝します。ヘドウィゲ・ボボリ(CHRシタデル、リエージュ、ベルギー)、リンダ・ブーランジェ(ベルギー、ルーヴェン大学病院)、ジョルジュ・カシミール(HUDERF、ブリュッセル、ベルギー)、ベネディクト・デ・マイエール(ゲント大学病院、ベルギー)、エルケ・デ・ワクター(ベルギー、ブリュッセル大学病院)、ダニー・デ・ルーズ(ゲント大学病院、ベルギー)、イザベル・エティエンヌ(CHUエラスム、ブリュッセル、ベルギー)、ローレンス・ハンセンス(HUDERF、 ブリュッセル)、クリスティアーネ・クヌープ(CHUエラスム、ブリュッセル、ベル....
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量遠心チューブ | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL コニカルチューブ | VWR | 525-0605 | |
| 24 ウェルプレート | Corning | 3526 | |
| 96 ウェルプレート | Greiner | 655101 | |
| 明視野顕微鏡 | Zeiss | Axiovert 40C | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5702 | |
| CO2インキュベーター | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| 共焦点顕微鏡 | ツァイス | LSM 800 | |
| 層流フード | サーモフィッシャー | 51025413 | |
| 以前のプロトコルで詳述したオルガノイド培養用の材料10 | |||
| マイクロピペット (20、200、1000 µ左) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | イメージングソフトウェア |
| ピペットチップ(20、200、および1000 µL) | Greiner | 774288、775353、750288 | |
| Zeiss Zen Blueソフトウェア | Zeiss | v2.6 | イメージングソフトウェア |
参考文献
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal....
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再版と許可
