方法論記事

心臓胸部手術のための思春期前のマウスの子犬の麻酔と挿管

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DOI：

10.3791/64004

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2022年6月2日

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1Molecular Cardiology and Biophysics Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent’s Clinical School, University of New South Wales Sydney, 3Department of Anaesthesia, The Children’s Hospital at Westmead, 4School of Child and Adolescent Health, University of Sydney

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

マウスの心臓胸部外科モデル>7日齢は挿管が必要ですが、これは思春期前(8〜14日齢)のマウスの子犬にとっては困難であり、挿管のための麻酔レジメンに関する情報はほとんどありません。ここでは、動物の死亡率を最小限に抑えながら気管内挿管を可能にする10日齢のC57BL / 6Jマウスの子犬におけるケタミン/キシラジン/アトロピンの投与計画を示します。

要約

マウス手術モデルは、前臨床研究において重要な役割を果たします。心筋損傷後の心筋再生に関する機構的洞察は、成人とは異なり増殖能力を保持している心筋細胞である0〜14日齢のマウスの心臓胸部手術モデルから得られる可能性があります。生後7日までのマウスの子犬は低体温によって効果的に固定され、心臓胸部手術のための挿管を必要としません。ただし、思春期前(8〜14日齢)のマウスの子犬は挿管が必要ですが、これは困難であり、挿管を容易にするための麻酔に関する情報はほとんどありません。ここでは、動物の死亡率を最小限に抑えながら気管内挿管を可能にする10日齢のC57BL / 6Jマウスの子犬におけるケタミン/キシラジン/アトロピンの投与計画を示します。体重に対するケタミン/キシラジン/アトロピン投与レジメンの経験的滴定は、異なる体重のマウス子犬の麻酔に対する反応が非線形であることを示し、それによって20/4/0.12mg/kg、30/4/0.12mg/kg、および50/6/0.18mg/kgの用量は、3.15〜4.49g(n = 22)、4.50〜5.49g(n = 20)、および5.50〜8.10g(n = 20)の仔の挿管を容易にした。 それぞれ。体重の少ない子犬は、重い子犬よりも多くの挿管試行を必要としました(p < 0.001)。挿管後の生存率は体重と相関していた(低体重群、中体重群、高体重群でそれぞれ59%、70%、80%、R2 = 0.995)。挿管後の心筋梗塞手術では,100%酸素中4.5%イソフルランで麻酔面を誘導し,酸素100%中2%イソフルランで維持した。術後の生存率は、92%、86%、88%の3つの体重群で同程度であった(p = 0.91)。挿管と手術のための動物の取り扱い慣行の改良、および手術後のダムによる共食いの最小化とともに、手順全体(挿管と手術)の全生存は体重と相関しました(低、中、高体重のグループでそれぞれ55%、60%、70%、R2 = 0.978)。10日齢の子犬の挿管で遭遇する困難とそれに伴う高い死亡率を考えると、10日齢の子犬の心臓胸部手術は少なくとも5.5gの子犬に制限することをお勧めします。

概要

マウスモデルは、特に遺伝子操作されたマウス系統を簡単に生成できること、およびマウスを外科的に操作して、たとえば心筋損傷後の心筋再生の研究を可能にする病理学的疾患モデルを提供することが容易であるため、前臨床心臓胸部研究において非常に貴重なツールです1。.これに関して、心筋細胞が細胞周期から離脱した成体マウスとは異なり、0〜2日齢の新生児マウスの心臓は、根尖切除または心筋梗塞の誘発後に最小限の瘢痕化で修復されることが興味深い2,3,4。対照的に、生後7日目の新生児心臓は不完全に再生し、瘢痕化の発生率が高くなります2,3。左心室の頂点にある心筋細胞は、生後2週間まで増殖能を保持するため、0〜14日齢のマウスにおける心臓損傷後の再生の機構研究は、損傷した成人心臓の再生の治療標的を特定するために有益である可能性があります5。

心臓損傷のマウスモデルの開発には、麻酔下での外科的操作が含まれます。これには、心臓にアクセスするために胸郭を開く必要があり、一般的に挿管と機械的換気が必要です。マウスの系統、体重、年齢は麻酔薬に対する感受性に影響します6.成体マウスは広範囲の薬剤で麻酔することができ、挿管の一般的なレジメンは100/13/0.5 mg / kg 6,7のケタミン/キシラジン/アトロピンである。新生児マウス(0〜7日齢)は中枢性疼痛反射を欠いており、氷上で効果的に固定化して挿管なしで手術を受けることができる6,8,9。思春期前(8〜14日齢)のマウスの子犬は、低体温症9,10で麻酔をかけることはできません。心臓胸部手術には挿管が必要です。生後14日未満の思春期前のマウスにおける心臓胸部手術に関する以前の研究はありません。.私たちの経験では、14日齢未満のイソフルラン麻酔をかけた思春期前マウスの挿管は困難です。7日以上経過したマウスに報告された推奨される注射可能な麻酔レジメンは、50〜150 mg / kgのケタミンと5〜10 mg / kgキシラジンです10。.思春期前のマウスはまだ神経学的に発達しており、薬物や薬物代謝に対する反応は成体動物とは大きく異なります6。これは、限られたエネルギー貯蔵を急速に枯渇させる代謝率が高いだけでなく、体温調節の未熟さのために、体液、電解質、酸塩基の不均衡、ならびに低血糖および低体温のリスクを高めます6,11,12。したがって、挿管を容易にし、思春期前のマウスの生存を最大化する麻酔レジメンに関する情報はほとんどありません。

ここでは、体重3〜8 gの10日齢C57BL / 6Jマウスの子犬のケタミン/キシラジン/アトロピンの投与計画を経験的に滴定し、動物の死亡率を最小限に抑えながら、その後の心臓胸部手術のための気管内挿管を可能にするのに十分な麻酔面を達成しました。また、挿管、手術、術後の母親の共食いによる死亡率を減らすために、動物の取り扱い慣行を改善しました。

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プロトコル

記載されているすべての動物実験は、科学的目的のための動物の世話と使用に関するオーストラリアの行動規範とARRIVEガイドラインに従って、Garvan/St Vincent's Hospital動物倫理委員会によって承認され、すべての実験は経験豊富な小動物外科医(JW)によって実施されました小児麻酔科医(JJS)の指導を受けた。

1.楽器の準備

  1. 手術当日、生後10日齢の子犬の挿管用の専用機器を設置します(図1A、B)。これには、保温ランプ、挿管プラットフォーム、光ファイバーライト、小さな鉗子、直径0.02 mmの銅線から作られた喉頭鏡が含まれます(長さ60 mm、ワイヤーの端は175°の角度で直径3 mmの円に成形されています。 図1B)、および気管内チューブとして使用される24ゲージのプラスチック製静脈内(i.v.)カニューレ。
  2. カニューレが長さ19 mmのプラスチックチューブ(外径0.7 mm)で構成され、21 mmのプラスチック製メスルアーロックアダプターで取り付けられていることを確認します(図1B)。ルアーロックアダプターを介して銅線を挿入することにより、カニューレのチューブを補強します。一回換気量が~8 μL/g 13,14のマウスには、総容量130 μLのカニューレを使用してください。

2. 10日齢マウスの麻酔

  1. 手術当日、生後10日目のC57BL/6Jの仔のケージからダムを取り出し、ケージを加温パッド(37°C)の上に置きます。
  2. 0.5 mLのインスリン注射器とケタミン/キシラジン/アトロピンを含む29 Gの針を使用して、体重1gあたり10 μLの腹腔内注射で子犬を麻酔し、さまざまな体重グループについて 表1 に詳述されています。.
  3. 注射直後に、37%酸素で事前に酸素化された温めた(100°C)プレキシガラスチャンバーに子犬を置きます。

3. 10日齢マウスの挿管

  1. 3〜4分の酸素化の後、基本的に成体マウスの場合と同様に、挿管用のプラットフォームに子犬を移します。子犬を仰臥位(図1C)にするか、45°の角度で吊り下げてこれを実行します15。温暖化ランプで温度を維持します。
    1. 挿管の前に、足のピンチ反射によって麻酔の深さを評価します。最適な挿管のためには、足のピンチ反射がまだ存在しなければなりませんが、意識のある動物のそれより著しく減少しなければなりません。
  2. 麻酔をかけた子犬を挿管プラットフォームに固定した後(図1C)、小さな鉗子で舌を持ち、銅線で作られた喉頭鏡(図1B)を使用して声門と声帯を露出させます。柔軟な光ファイバーライトによるトランスイルミネーションによる声帯の視覚化を支援します(図1D)。
  3. 硬化したカニューレを使用して、ルアーロックの端が先端よりわずかに低くなる(~10°)ようにカニューレを傾け、声帯が離れたらすぐにカニューレを挿入し、ルアーロックアダプターが口のすぐ外になるまで進めます。挿管後すぐにワイヤーを取り外します。
    注:この年齢のマウスでは、カニューレが進みすぎてカリーナから抵抗が感じられない限り、挿管中の抵抗は予想されません。
    1. 挿管後の麻酔の深さを、動物が自発的に呼吸する能力によって評価する。自発呼吸の子犬の気管挿管が成功したことを確認するために、挿管カテーテルを短時間ブロックして、胸の動きが妨げられることを確認します。
  4. 挿管された子犬をすぐに加温パッド(37°C)に移し、気管内カニューレを人工呼吸器に接続し、1 L/minの流量で100%酸素を供給し、それぞれ30 μL /ストローク、40 μL /ストローク、または50 μL /ストロークで、それぞれ3.15-4.59 g、4.50-5.49 g、または5.50-8.10 gの子犬、および150ストローク/分。
  5. 再呼吸を最小限に抑えるために、<15秒以内にこれらの手順を迅速に実行してください。

4. 10日齢マウスの心筋梗塞手術

  1. 手術用の麻酔の手術面を誘発するには、人工呼吸器に流入するガスを酸素中の100%酸素から4.5%イソフルラン(イソフルラン濃度は気化器によって決定される)に4〜5分間切り替えます。
    1. イソフルランに切り替えた後、胸壁の動きの頻度が人工呼吸器の頻度と一致することを確認して、気管挿管を再度確認します。自発呼吸の喪失とそれに続く尾または足のピンチ反射の欠如は、麻酔の手術面に達したことを示す(4〜5分後)。
  2. 酸素中の2%イソフルランで麻酔を維持する。
  3. 16に記載の手術用顕微鏡(10倍および16倍対物レンズ)下で心筋梗塞手術を行う。
    1. ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブと70%アルコールを交互に使用して、円を描くように数回皮膚を消毒します。細かいハサミを使用して、胸の左側壁の3番目と4番目の肋骨(4番目の肋間腔)の間に水平方向の皮膚切開を行います。細かい鉗子を使用して、肋間腔の鈍的解剖によって胸部を開き、開創器を使用して空間を開いたままにします。
    2. 9-0ポリプロピレンモノフィラメント縫合糸を用いて左心房付属器のすぐ遠位の左冠状動脈を結紮することにより心筋梗塞を誘発する。~10分の梗塞手術後、7-0プロレンで皮膚を閉じ、切開部をベタジンで消毒します。70%エタノールまたは生理食塩水で子犬の血液をきれいにします。
      注:思春期前の子犬の左冠状動脈の結紮は、成人の結紮と同様に、本質的に無血です。
    3. 鎮静、鎮痛(ブプレノルフィン、0.075 mg / kg、10 μL、皮下)、生理食塩水(50 μL、腹腔内)からの迅速な回復のために、0.5 mLインスリンシリンジと29 G針で次々に投与します:アチパメゾール(1-5 mg / kg、10 μL、腹腔内)。.
  4. イソフルランを中止して動物を回復させます。.その後数分以内に自発呼吸が再開することを確認してください。
    1. 子犬を温めた酸素化チャンバーに戻し、回復中は右反射が回復するまで継続的に監視し、その時点で子犬を抜管します。
    2. 家庭用ケージの寝具で子犬をそっとこすり、子犬を暖かく保ち、呼吸が規則的であること、および子犬が自発的に動くことができることを確認します。これにより、ダムによる術後の共食いが減少します。
  5. すべての子犬が麻酔から完全に回復したら、ダムをケージに戻します。
    注:1匹の子犬の準備、麻酔、挿管、手術、および回復にかかる時間は、40〜60分の範囲です。
  6. ハウスダムと子犬は、37°Cの加温パッドの半分/半分を置いたケージで一晩過ごします。

5.梗塞サイズの術後評価

  1. 術後3日目に 、1 mL /分の流量で酸素中の4.5%イソフルランで事前に平衡化されたプレキシガラスチャンバーに子犬を入れて麻酔をかけます。
  2. 足のピンチ反射によって評価された麻酔の手術面に達したら(4〜5分後)、子犬をチャンバーから取り出し、尾をテーピングして加温パッド上で仰臥位で固定する。
  3. 切歯の上に糸を置き、頭を伸ばしたまま所定の位置にテープで固定し、人工呼吸器に接続されたノーズコーンに頭を置き、200μL/ストローク、150ストローク/分で酸素中に4.5%イソフルランを供給します。酸素中の2%イソフルランで麻酔の手術面を維持する。
  4. 70%エタノールで皮膚を消毒します。細ハサミを用いて、気管に沿って右総頸動脈上の皮膚を1cm切開し、露出した血管を単一のルーメンポリエチレンチューブ(OD0.61mm、ID0.28mm)でカニューレ挿入し、血液凝固を防ぐために0.2mLのヘパリン化生理食塩水(200U)を1分間投与します。
  5. イソフルランを酸素中で4.5%に1分間増加させてから、2秒以内に0.2mLの3.3 M KClを迅速に投与して、拡張期の心臓を阻止します。.
  6. 同じ切開 部で 右頸静脈を解剖し、それを横断します。0.2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で心臓を灌流し、次に0.1mLの0.2%アルシアンブルーで灌流して、梗塞していない遠隔心筋を染色します。血液、PBS、次に頸静脈 を介した アルシアンブルーの洗い流しによって証明される灌流の成功を確認します。
  7. 胸部を開き、周囲の結合組織と血管を解剖して心臓を解放して心臓を切除します。心臓をPBSですすぎ、必要に応じて心房を取り除き、10倍対物レンズを使用して手術用顕微鏡に取り付けられたカメラで心臓を撮影します。

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結果

10日齢マウスの麻酔。10日齢の子犬は、4.5〜5分で4.5%イソフルランで麻酔することができます。しかし、挿管の準備の過程で麻酔から回復します。サイズが小さいため、標準的なノーズコーンによるイソフルラン麻酔下での挿管は実行可能ではありません。.私たちは以前、15日齢と21日齢の子犬と成人4,7の心臓胸部手術にそれぞれ100/13/0.5 mg / kgのケタミン/キシラジン/アトロピン麻酔レジメンを使用しました。酸素補給を含む予備実験では、50〜150 mg / kgのケタミンと5〜10 mg / kgキシラジン10の推奨される注射可能なレジメンは、10日齢の子犬で許容できない死亡率をもたらすことがわかりました。.10日齢の仔の体重と同腹児サイズの逆相関を考えると(R2 = 0.250、p < 0.0001;図2)を体重群に従って麻酔レジメンを滴定した...

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ディスカッション

現在、心臓胸部手術のための10日齢マウスの麻酔および挿管のための十分に文書化された方法はありません。この目的のために、ケタミン/キシラジン/アトロピンの投与計画を体重に滴定し、20/4 / 0.12 mg / kg、30/4 / 0.12 mg / kg、および50/6 / 0.18 mg / kgの用量は、それぞれ低体重(3.15-4.49 g)、中(4.50-5.49 g)、および高(5.50-8.10 g)の子犬の挿管を容易にしました。挿管後の生存率は体重と相関していた(低体重群、中体重群、高体重群でそれぞれ59%、70%、80%)。10日齢の子犬の挿管で遭遇する困難とそれに伴う高い死亡率を考えると、10日齢の子犬の心臓胸部手術は体重5.50g以上の動物に制限することをお勧めします。この挿管技術の制限は、オペレーターのスキルと経験、およびオペレーターがどれだけ早く習得できるかに依存することです。ただし、成人の挿管を経験したオペレーターは、7〜8匹の子犬を10リットル練習した後、思春期前の挿管に習熟できると予想されます。別の制限は、挿管および心筋梗塞手術後の子犬の全体的な生存率が55%(最低体重群)から70%(最高体重群)の範囲であ...

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開示事項

著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、NHMRC Program Grant [ID 1074386]、Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research grant [RMG]、および RT Hall Trust [RMG & SEI] からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アティパメゾール (アンチセダン)Provet (NSW) Pty LtdATIP I
アトロピン 600 mcg/mLClifford Hallam Healthcare Pty Ptd1957699 PFIZER-0143386
BetadineLivingstone InternationalBU0520
Buprenorphine (Temgesic)Provet (NSW) Pty LtdTEMG I
光ファイバーライトライカ 3011350CLS 150X
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCバージョン 9.1.2
挿管プラットフォーム --おおよその寸法が12(L)×8.5×(W)×7.5cm(H)の頑丈な箱(例えばプラスチック製のチップボックス)
IsofluraneProvet (NSW) Pty LtdISOF 07
Ketamine 100 mg/mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1
プラスチック製静脈カニューレ 24ゲージPolywin Safety BDインサイト CE0086長さ 19 mm のプラスチック チューブ (外径 0.7 mm) を 21 mm のプラスチック製メス ルアー ロック アダプターに取り付けました。アニュラの総体積 130 μL
シングルルーメン ポリエチレンチューブCritchley Electrical Products Pty Ltd オーバーン NSW外径 0.61 mm、内径 0.28 mm
小型鉗子F.S.T.NO 11051-10
手術用顕微鏡(カメラオプション)ライカ M651 (ライカ IC80 HD カメラ)10x および 16x 対物
合糸 7-0 proleneEthicon8708H
縫合糸 9-0 ポリプロピレンモノフィラメントEthicon2813
V-1 アクティブ掃気イソフルラン麻酔システム付き卓上VetEquip901820
通気式 2 リットルプレキシガラス誘導チャンバーVetQuip Pty Ltd94210225 cm (L) x 13 cm (W)x 11 cm (H)
温暖化ランプBrilant Lighting99223
XylazineProvet (NSW) Pty LtdXYLA Z 2
レンズ縫

参考文献

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