ミクロゲルロッドからの連結マクロポーラス3D足場

3Dコンストラクトにおける複雑な協調的な細胞挙動を研究するために、足場プラットフォームは、再現性において一貫した性能を示し、細胞移動に適した形状を有し、同時に、生体組織への影響を調査するためのパラメータ変更に関して一定の柔軟性を可能にする必要があります¹。近年、Seguraらによって最初に記述されたマクロポーラスアニール粒子(MAP)の概念は、3D足場製造のための効率的で汎用性の高いプラットフォームに発展しました²。最終的な3D足場の構成要素であるミクロゲルのテーラード組成は、構築物の剛性、ゲルネットワークの選択的化学反応性、足場の最終的な細孔サイズなどの特性を事前に定義します2,3,4,5,6。足場-細胞相互作用の手がかりとしての細胞接着ペプチドは、細胞接着を可能にするためにミクロゲルのポリマーネットワークに組み込まれ、培養中の細胞に対するそれらの特異的効果を調べるために変化させることができる。3Dスキャフォールドは、共有結合または超分子結合によるアニールされた注射用ミクロゲルの相互連結によって安定化され、細胞培養のための堅牢で定義された構築物をもたらします^2,3,5,7,8。

マイクロフルイディクスは、定義された粒状ヒドロゲルを調製するための最も正確で適応可能な方法の1つとしての地位を確立しています⁹。化学的、機械的、および物理的単分散性を維持しながら、連続プロセスで必要なビルディングブロックを大量に生産する可能性は、このプロセスの適合性に大きく貢献します。さらに、製造されたミクロゲルのサイズおよび形状は、バッチエマルジョン、マイクロ流体工学、リソグラフィー、電気力学的噴霧、または機械的断片化などの様々な方法によって操作することができ、これらはビルディングブロックの形状を決定し、したがって、最終的な足場^1,10の3D構造を決定する。

最近、さらなる添加剤なしで水溶液中で急速に連結する官能化されたミクロゲルロッドで構成されるマクロポーラス3D足場の概念が報告されている¹¹。ミクロゲルロッドの異方性は、この研究で球状ミクロゲルを使用した場合と比較して、より高い気孔率とより大きな細孔サイズを持つ細孔分布をもたらしました¹¹。このようにして、材料が少ないほど、3D足場の安定性を維持しながら、さまざまな異なる細孔形状でより大きな細孔が作成されます。このシステムは、互いに接触したときに相互結合反応内で消費される相補的な第一級アミンおよびエポキシ官能基を有する2種類のミクロゲルロッドからなる。インターリンクプロセスに関与しない官能基は活性を維持し、細胞接着ペプチドまたは他の生理活性因子による選択的な後修飾に使用できます。線維芽細胞は、3D足場内で培養すると付着、拡散、増殖し、最初にミクロゲル表面で成長し、5日後にマクロ孔の大部分を満たします。ヒト線維芽細胞とヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の予備共培養研究は、連結された3D足場内に血管様構造を形成するための有望な結果を示した¹¹。

1. マイクロフルイディクスに必要な材料と調製物

1. 記載されたマイクロ流体手順には、1mLおよび5mLのガラスシリンジおよびシリンジポンプを使用する。オンチップ液滴の形成は、高速度カメラを搭載した倒立顕微鏡で観察されます。
2. コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用してマイクロ流体チップ設計(図1B)を作成し、すでに報告されているようにマスターテンプレートを作成します¹²。
3. 厚さ0.13mmのカバーガラスを通して957mW/^cm2の放射照度を提供する自作UV-LED(λ=365nm、スポット直径~4.7mm)を使用して、制御されたUV照射を実現します。
   注意: 照射中のUV-LEDによる局所的な発熱の可能性を考慮してください。この場合、外部の空気の流れによって十分な冷却を確保してください。

2. マイクロ流体デバイスの作製

注:マイクロ流体デバイスの製造は、以前の出版物^{に基づいています13}。

1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)と硬化剤の10:1(質量)混合物20 gを準備します。3分間激しく混ぜます。
2. 60 mgのオイルレッドOを2.0 gのトルエンに混ぜます。トルエン溶液中のオイルレッドO50μLをPDMS混合物に加える。均一な色分布が得られるまで混合して、望ましくない光散乱を減らし、オンチップゲル化中にスポットサイズに焦点を合わせ続けます。
3. 真空ポンプを備えたデシケーターに混合物を入れて気泡を取り除きます。
4. PDMS混合物をマスターテンプレートに5〜5.5 mmの高さまでキャストし、再度脱気します。
5. PDMSを室温で18時間硬化させて、ジアゾ色素の劣化を防ぎます。
6. PDMS構造を切り取り、ラインコアサンプリングツール(内径0.77 mm、外径1.07 mm)を使用して、構造に入口と出口の穴を開けます。
7. PDMSとカバーガラスをイソプロパノールと脱イオン水で5回繰り返し洗浄し、その後、各洗浄ステップの後に加圧空気または窒素流を介して液体を除去します。
8. ドライガラスとPDMSを0.2 mbarのプラズマオーブンで一緒に処理し、酸素流量を20 mL/minで100 Wで60秒間処理し、直接接続してガラスとPDMSを結合してマイクロ流体デバイスを形成します。
   注: チャネル構造の変形を最小限に抑えるために、バインドプロセス中にPDMS構造を曲げないでください。
9. マイクロ流体チップのチャネルを疎水性にするには、50 μLのトリクロロ-(1 H,1 H,2H,2 H-パーフルオロクチル)-シランと一緒に、真空下でデシケーターに一晩置きます(蒸気圧を下げた後、ポンプへの接続を閉じます)。デバイスの外側をハイドロフルオロエーテルですすいでください。
   注意: これらの手順はドラフト内で実行し、パーフルオロシランとの接触を避けてください。グリースで密封されたガラス真空デシケーターを使用してください。他の目的に使用する前に、デシケーターを完全に清掃してください。

3. マイクロフルイディクスの溶液調製

1. 連続油相の場合は、パラフィンオイルとヘキサデカン(1:1 v / v)を混合し、8%(w / w)の非イオン性界面活性剤を追加します。1 mL (第 1 オイル、図 1) と 5 mL (第 2 オイル、図 1) ガラスシリンジ 1 本を満たします。
2. 茶色のガラスバイアルに分散相用のプレポリマー溶液を調製して、光開始剤の分解や意図しないゲル化を防ぎます。
   1. GRGDS-PCを含むアミン成分プレポリマー溶液
      1. 300 μL溶液の場合、33.3 mgのスターポリエチレングリコールアクリレート(sPEG-AC)と3.03 mgのフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)を計量します。
      2. 18.74 mgの2-アミノエチルメタクリレート塩酸塩(AMA)を1.5 mLの脱イオン水に溶解し、溶液をシリンジフィルター(孔径0.20 μm)に通します。
         注意: AMAは吸湿性があり、固形物が保管容器に塊を形成したらすぐに廃棄する必要があります。
      3. 滅菌済みの36 mM GRGDS-PCアリコートを水中で調製し、使用するまで-20°Cに保ちます。
      4. 291.7 μLのAMA溶液を使用してsPEG-ACおよびLAPを溶解し、8.3 μLのGRGDS-PC溶液を追加します。1 mLのガラスシリンジで溶液を取り上げ、アルミホイルを使用して光から保護します。
   2. エポキシ成分プレポリマー溶液
      1. 300 μL溶液の場合、33.3 mgのスターポリエチレングリコールアクリレート(sPEG-AC)、3.03 mgのLAPを計量し、300 μLの脱イオン水に溶解します。グリシジルメタクリレート(GMA)2.4 mgを追加します。
         注:激しい振とうはGMA溶解を加速します。1 mLのガラスシリンジで溶液を取り上げ、アルミホイルを使用して光から保護します。

4.アミンおよびエポキシ官能化ミクロゲルロッドの製造と精製

図1:マイクロ流体オンチップゲル化アセンブリの配置 。 (A)マイクロフルイディクス時の部品配置の正面図と斜め図。(B)ミクロゲルロッドのオンチップゲル化に使用されるマイクロ流体チップ設計。(1)第1のオイルインレットにPEチューブ。(2)分散相入口への光保護されたPEチューブ。(3)第2のオイル注入口にPEチューブ。(4)出口から製品収集容器までのPEチューブ。(5)UVランプと照射位置は、出口近くのストレート80μmチャネル上にあります。(6)顕微鏡の対物/観察位置。(7)マイクロ流体デバイスの着色PDMSコンポーネント。(8)PDMSに接着されたカバーガラス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 針をPEチューブに挿入し、シリンジとチューブからガスを取り除きます。
2. 製品収集のためにPEチューブを出口に挿入します。
3. すべてのガラス製シリンジをシリンジポンプに入れ、各チューブの端を対応するインレットに挿入します(図1)。
   注意: 意図しないゲル化を避けるために、アルミホイルまたは黒いチューブを介してプレポリマーチューブを光から保護してください。
4. 顕微鏡を油水断面に焦点を合わせます。
5. 最初のオイルシリンジポンプ(流量= 100-200 μL / h)を始動して、分散相によるチャネルの濡れを防ぐために、最初にチャネルにオイルを充填します。
6. 最初のオイル流量を30 μL/hに下げ、分散した水相が断面に観察されるまでプレポリマーシリンジポンプ(流量= 100-200 μL/h)を始動します。
7. プレポリマーの流量を30 μL/hに設定し、顕微鏡を出口に合わせます。
8. 2番目のオイルシリンジポンプ(流量300μL/h)を始動し、流量が安定するまで待ちます。
9. 出口チューブを収集容器に入れます。
   注意: 時間の経過に伴う製品の蓄積による圧力上昇を避けるために、チューブの端を容器の上部に配置します。
10. 紫外線照射システムは、放射照度が900〜1000 mW/cm2(使用照度=957 mW/^cm2)の範囲で、照射スポットが出口の前の直線流路部分になるように設定します(図1B)。
    注意: チャネルの詰まりを防ぐため、油水断面の近くで照射しないようにしてください。保護を強化するために、ユニット上部の照射スポットの前にチャネル構造を覆います。
11. UV照射する前に、プレポリマーと最初のオイルの流量を調整して、3.0〜4.5の範囲で目的のアスペクト比を達成し、照射スポットのサイズに応じて、分散相の照射時間を~2.3秒に設定します。
12. UV照射を開始し、必要に応じて、前のサブセクションに従って流量を再度調整します。
    注:最初に生産を観察し、出口での安定した流動挙動とミクロゲルロッドの均一性を監視します。2番目のオイル流量を調整して、出口内の製品輸送を最適化することができます。
13. 回収容器を変更し、製品回収の開始時刻と流量をメモします。
    注意: 製品をほこりから保護してください。シリンジの溶液が少なくなる前に収集を停止します。
14. 収集を終了するには、時刻をメモして収集コンテナーを削除します。照射とすべてのシリンジポンプを停止します。
15. その後、製品をn-ヘキサン、イソプロパノール、および脱イオン水でそれぞれ5回洗浄します。ロッド沈降後の上澄み液を除去する。
    注意: 各溶液添加後、製品を注意深く分散させ、分子拡散を考慮して溶媒を交換する前に10分待ちます。ロッドが液体の表面に浮くのを防ぐために、イソプロパノールを徐々に水と交換します。水で複数回追加洗浄すると、残りのイソプロパノールの痕跡が減少します。

5. マクロポーラス足場形成

1. エポキシおよびアミン官能化サンプルの分散体積あたりのミクロゲルロッドの数を決定します。
2. エポキシおよびアミン官能化サンプルの数を希釈または濃度によって1,000〜5,000ロッド/ 100μLの間の同様の値に調整します。
   注:ミクロゲルロッドの沈降をスピードアップするために、~2,000 x gの遠心分離機を5〜10秒間使用します。分散体積あたりのロッドの数が少ない場合、ロッドインターリンクは、1つの安定した構造ではなく、より小さなロッドクラスターをもたらす可能性があります。分散体積あたりのロッド数が多いと、2つの成分の混合品質が損なわれます。
3. 最初の成分(~1,200ロッド)分散液を円錐形の1.5 mLまたは2 mLの透明なバイアルに移します。
4. 2番目の成分を連続運転(100 μLピペット)で制御された方法で添加します。添加後、ピペットを使用して内容物を直接混合して液体を取り、再度加えます。混合中に数秒以内に相互結合構造が形成されます。
   注:1つのコヒーレント構造ではなく複数のクラスターが形成された場合は、体積あたりのミクロゲルロッドの数を再確認するか、2つの成分の混合をより制御してください。

6.細胞接着後改質

1. 分散ポリマー相の流速、特定の時間に収集されたミクロゲルの数、および足場形成に使用されるミクロゲル分散液の希釈係数に基づいて、相互連結構造中のエポキシ基の理論数を計算します。
   注:足場あたりのエポキシ基の理論数を次の式で概算します。
   
   
   n_番目: 物質の理論量
   c GMA:プレポリマー溶液中の_GMA濃度
   Q:プレポリマー溶液の流量
2. GRGDS-PC溶液を連結構造に追加し、遊離アミンとチオールを含む細胞接着性ペプチドで残りのすべてのエポキシ基を修飾します(n[理論エポキシ基]/n[GRGDS-PC] = 1)。室温で一晩放置する。
3. イオン交換水で洗浄し、上清を除去することにより、未反応分子を除去する。

7. 滅菌と細胞培養培地への移送

1. 水位を下げて、連結された足場を水没させます。
2. バイアルを開き、 λ =250-300nmのUV光を照射する。バイアルを閉じ、バイアルをクリーンベンチに移します。滅菌水で1回洗浄します。
3. バイアル内の水を細胞培養培地と交換し、5分間平衡化します。これを新鮮な細胞培養培地で2回繰り返します。
4. マクロポーラス足場を、スパチュラまたはスパチュラを用いて実験用の細胞培養ウェルプレートに移す。

図2:マクロポーラス架橋足場構造 。 (A)連結マクロポーラス足場の500μm共焦点顕微鏡Zスタックの3D投影。スケールバーは500μmを表す。 (B)水から直接取り出したカバーガラス上の~10,000本のミクロゲル棒からなる連結足場。スケールバーは5mmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

このプロトコルにより、相互連結アミンとエポキシ官能化ミクロゲルロッドで構成される安定した3Dマクロポーラス構造が得られます(図2A)。記載されたタイプの混合が使用されている場合、構築物はコンパクトな形状を示すべきであり、それは2秒または3秒以内に形成される(図2B)。

連結された構築物の安定性は、それが構成されるミクロゲルロッドビルディングブロックに依存する。アミン官能化ミクロゲルロッドは、ナノインデンテーションによって決定された2.0±0.2kDaの平均剛性を示します(図3A)。ロッドが柔らかすぎると、ビルディングブロックの変形により、相互連結マクロポーラス構造が得られない場合があります。活性官能基を検出するために、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)を使用して第一級アミノ基を可視化し、フルオレセインアミン異性体Iを使用してエポキシ基を標識することができます(図3B、C)。アミンミクロゲルロッドは、脱イオン水中で平均長さ553 μm±29 μm、平均幅193 μm±7 μmの寸法を有し、その結果、アスペクト比は~3.0となり、細胞培養培地中で体積が~73%減少(崩壊)します11。

図3:ミクロゲルの特性。 (A)ナノインデンテーションによって測定されたアミンおよびエポキシミクロゲル球体とともに、アミンおよびエポキシミクロゲルロッドの有効ヤング率。データは、25 パーセンタイルから 75 パーセンタイルまでの箱ひげ図として表示され、ひげは 5% から 95% の分位数に達します。ボックス内の線は中央値を表し、空の四角形は平均を示し、黒い四角形は外れ値を表します(n = 40;p値は、ボンフェローニ補正付きの一元配置分散分析(**p < 0.01、****p < 0.0001)を用いて計算されます。(B)上:FITCで官能化されたアミンミクロゲルロッドとフルオレセインアミン異性体Iで官能化されたエポキシミクロゲルロッドの共焦点顕微鏡画像。 下:対応する明視野画像。スケールバーはすべて100μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

関連公報に記載されているように、同じ方法を介して製造された球状ミクロゲルは、1つの安定なマクロポーラス足場11ではなく、複数の相互連結クラスターをもたらす。ミクロゲルロッドのアスペクト比が高いほど、3Dでの構造ブリッジングがより効率的になるため、全体的な安定性が向上します(図4)。

図4:構造形成に対するアスペクト比の影響 。 (A)ミクロゲルロッドで構成された連結コンストラクトの明視野画像。(B)球状ミクロゲルからなる連結クラスターの明視野像。スケールバーは500μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ミクロゲル棒で構成された足場のマクロ孔の平均値は100μmであり、細孔径の90%は30μmから150μm以上の範囲である11。球状のミクロゲルは、孔径が~10 μmから55 μmのクラスターを生じ、平均値は約22 μmです11。これは、球状ミクロゲルに基づいてMAPを調製する他の研究によって報告された数と一致している2、4、14。

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