青色LED照明技術 による TLCプレート上の化合物の収率の推定

薄層クロマトグラフィー(TLC)は、有機化学の分野で定性的および定量的手法として広く使用されています^1,2,3。TLCの主な利点は、高速検出、柔軟なサンプル要件を提供し、特殊な機器を必要としないことです⁴。今日まで、多くの高度なアプローチが確立されているにもかかわらず、TLCは依然として混合物中の未知のサンプルを識別するための主要な方法です。ただし、このアプローチの課題は、特に予算が限られているラボを開発する場合、サンプル収量を定量化するための安全で安価な機器がないことです。そこで本研究では、TLCと組み合わせてサンプルの収量を推定するための効率的で安全かつ安価な方法を開発することを目的とした。

高性能TLC(HPTLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、およびガスクロマトグラフィー(GC)とは異なり、厳しいサンプル要件、時間がかかり、^{サンプル調製のための}多段階の関与^1,5、TLCはいくつかの利点を示しました。まず、サンプル調製の場合、粗抽出物がHPLCおよびGCのカラムを詰まらせる可能性があるため、HPLCおよびGCは粗抽出物を検出できません。第二に、サンプルがUVに適さない(HPLC分析にとって重要)または低揮発性(GC分析にとって重要)である場合、TLCをこれらのサンプルに適用することができ、可視化試薬を使用すると、単離されたサンプルが薄層に見えるようになります^6,7,8。第三に、一般ユーザーの場合、HPLCとGCは、TLCと比較して、独立して作業する前に比較的長い時間の事前トレーニングを必要とします。さらに、高性能TLC(HPTLC)として知られる定量的TLC分析は、高感度スキャナーでTLCプレート上の情報をデジタル化できます。しかしながら、HPTLCシステムのコストは比較的高価である。そのため、TLCプレート上のサンプルを定量するための費用効果が高く迅速なアプローチを開発することは重要なトピックです。

TLC収量の定量化についても同様の方法が開発されています。たとえば、ジョンソン⁹ は、コンピューターに接続されたフラットベッドスキャナーを使用してTLCプレート上のサンプルを定量できる技術を報告しました。2001年、El-Gindyら¹⁰ は、光学密度で化合物を検出するために使用されるTLC-デンシトメトリー法を開発し、この技術はElkadyらによっても適用されました¹¹。2007年、Hess² は、UV光と組み合わせたデジタルカメラを使用してTLCプレート上の化合物の収率を検出するために適用されたデジタル強化TLC(DE-TLC)法を発表しました。ヘスはまた、HPTLC法とDE-TLC法のコスト差を比較し、DE-TLC法は手頃な価格であるため、高校や大学の研究室で使用できると結論付け^ました2。ただし、TLC濃度測定法のコストは依然として高価であり、紫外線の操作には、ユーザーが紫外線にさらされる可能性がある場合に備えて、適切な事前トレーニングが必要です。したがって、TLCと互換性があり、効率的、安全、かつ安価なサンプル収率を定量する方法の開発が望まれている。

本研究では、青色LEDイルミネーターを用いてTLCプレート上のサンプルを検出するためのプロトコルを記述し、バンドの寸法を測定し、化合物収率を決定するための信頼性の高い(高いR2乗値)回帰モデルを開発しました。最後に、青色LED照明法は比較的安全であることがわかりました(対。紫外線検出法)、安価(対。GC、HPLC、およびHPTLC)、および収量定量のための効果的な(対バイオアッセイ法)アプローチ。

本プロトコルは、例としてロバスタチンを用いて記載される。ロバスタチンは、1週間齢の アスペルギルス・テレウスから抽出した。

1.化合物抽出

注:化合物抽出の詳細については、 図1を参照してください。

1. ジャガイモデキストロース寒天培地上で アスペルギルス・テレウス (PDA、 材料の表を参照)培地を30°Cで培養する。
2. 培養物を40°Cで24時間乾燥させます。滅菌ピンセットを使用して乾燥した培養物を50 mLチューブに移し、15 mLの酢酸エチルを加えます。
3. 混合物を1分間ボルテックスして激しく振盪し、200rpmで振とうしながら40°Cで1時間インキュベートします。
4. 40 kHzの超音波浴( 材料の表を参照)を使用して混合物を40°Cで1時間超音波処理します。
5. 混合物を室温で5,000 x g で1分間遠心分離し、11 μmのろ紙でろ過します。
6. 分液漏斗で等量の滅菌水でろ液を抽出する。
7. 相分離後、有機層を収集し、ロータリーエバポレーターで蒸発させます( 材料表を参照)。残留物を2mLの酢酸エチルに溶解する。

2. 順相(NP)吸着カラムによる粗抽出物の分離

1. 固定相としてNPシリカゲルをカラムに充填し、移動相としてn-ヘキサン:酢酸エチル:トリフルオロ酢酸(H:E:T; 80:20:0.1、v/v/v)を使用します。
2. 2 mLの抽出物(ステップ1)をカラムにロードし、移動相溶媒を1 mL/minの流速で加えて抽出物を溶出します。
   注:流量は活栓を使用して手動で制御されました。
3. TLCで廃液を検証してロバスタチンの存在を確認し、溶媒が除去されるまで45°Cのロータリーエバポレーターで蒸発させます。このステップには約20〜25分かかります。
4. 残留物を1mLの酢酸エチルに溶解し、次いで等量の1%トリフルオロ酢酸と混合する。
5. 混合物を室温で5,000 x g で1分間遠心分離し、有機層を新しいガラス管に集めます。

3. 薄層クロマトグラム(TLC)プレートの調製とローディング

1. キャピラリーピペットを使用して、5 μLのサンプルとロバスタチン標準物質( 材料表を参照)をTLCプレートのベースラインにスポットし、TLCプレートの側面に1 cmの境界線を残します。
2. TLCプレートをヒュームフードで室温で5分間乾燥させます。
3. プレートを鉗子で移動相溶媒の入った飽和ガラスチャンバーにそっと置きます。チャンバーをガラス蓋で覆い、プレートが完全に発達するようにします。
4. 溶媒ラインがプレートの上部から1cmに達したら、プレートをチャンバーから取り出します。

4. 青色LEDイルミネーターによる分析

1. 溶剤線を鉛筆でマークします。プレートをヒュームフードで室温で10分間乾燥させます。
2. 乾燥後、直ちにプレートを10%H₂SO₄ 溶媒に浸し、次にヒュームフード内で室温で10分間乾燥させる。
3. 茶色の斑点が現れるまでプレートを加熱パネルに置きます。ロバスタチンの視覚化が困難になる可能性があるため、プレートが過熱していないことを確認してください。
4. プレートを青色LEDイルミネーターに移し、互換性のあるフリーウェア(MiBio Fluo)を使用してスキャンします(材料の表を参照)。

5. 回帰モデルによる歩留まり推定

1. ImageJソフトウェアを使用してバンドの寸法を測定します( 材料表を参照)。
2. 1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mLなどのロバスタチン標準物質の降順濃度に基づいて、データ分析およびグラフ作成ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して回帰モデルを確立します。
3. 回帰モデルを適用して、サンプルの収量を推定します。

この研究では、化合物の収率を推定するための青色LED照明法を提示し、この方法を検証し、バイオアッセイおよびUV検出法と比較しました(表1)。回帰モデルは、サンプルの収量を予測するために、それぞれ3つの方法のバンドの次元と標準の濃度に基づいて開発されました。まず、バイオアッセイ法の結果において、阻害ゾーンの寸法とロバスタチン標準物質のR2乗は0.99であり、回帰モデルによって予測されたサンプル収量は0.56mgであった(図2)。第二に、UV検出法では、ロバスタチン標準とTLCプレート上のバンドの寸法との間のR二乗は0.97であり、回帰モデルによって予測されたサンプルの収量は0.53mgであった(図3)。特に、バンドのエッジがぼやけており、比較的低い信号強度のバンドが観察されました(図3A)。第三に、青色LED照明法では、ロバスタチン標準とTLCプレート上のバンド寸法との間のR二乗は0.98であり、回帰モデルによって予測されたサンプル収量は0.54mgであった(図4)。青色LED照明器を用いた予測収量は、バイオアッセイ法(対照として設定)に近かった。バンドの寸法はロバスタチンの量に比例し、明瞭なバンドは青色LED照明法によって得られた。さらに、バイオアッセイ、UV検出、および青色LED照明方法の作業時間は、それぞれ約24時間、2時間、および1時間でした。(注:労働時間とは、ロバスタチンの収量検査に費やされた合計時間を意味します)。

図1:プロトコルのワークフロー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:バイオアッセイ法。 (A) ニューロスポラクラッサ に対するロバスタチンのバイオアッセイ(30°Cで24時間インキュベート)。試験の終わりに、90mm寒天プレートを可視光下で撮影した。(B)6つのロバスタチン標準の濃度は、No.1(1 mg / mL)、No.2(0.75 mg / mL)、No.3(0.5 mg / mL)、およびNo.4(0.25 mg / mL)でした。.試料番号5を0.25×(1:4)に希釈した。サンプル番号6を0.5×(1:2)に希釈した。阻害ゾーン寸法(mm2)は、イメージングソフトウェアにより測定した。(C)標準の阻害ゾーン次元に基づくデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して回帰モデルを開発した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:UV光にさらされた薄層クロマトグラム(TLC)プレート。 (A)TLC分析の移動相としてn-ヘキサン:酢酸エチル(2:3 v / v)を使用し、TLCプレートを現像液(10%H2SO4)に浸した後、UV光(365 nm)にさらしました。(B)6つのロバスタチン標準の濃度は、No.1(1 mg / mL)、No.2(0.75 mg / mL)、No.3(0.5 mg / mL)、およびNo.4(0.25 mg / mL)でした。.試料番号5を0.25×(1:4)に希釈した。サンプル番号6を0.5×(1:2)に希釈した。阻害ゾーン寸法(mm2)は、イメージングソフトウェアにより測定した。(C)TLCプレート上のロバスタチン標準バンドの寸法に基づくデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して回帰モデルを開発した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:青色LEDイルミネーターでスキャンした薄層クロマトグラム(TLC)プレート 。 (A)TLC分析の移動相としてn-ヘキサン:酢酸エチル(2:3 v / v)を使用し、 TLCプレートを青色LEDイルミネーターでスキャンしました。(B)6つのロバスタチン標準の濃度は、No.1(1 mg / mL)、No.2(0.75 mg / mL)、No.3(0.5 mg / mL)、およびNo.4(0.25 mg / mL)でした。.試料番号5を0.25×(1:4)に希釈した。サンプル番号6を0.5×(1:2)に希釈した。阻害ゾーン寸法(mm2)は、イメージングソフトウェアにより測定した。(C)TLCプレート上のロバスタチン標準バンドの寸法に基づくデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して回帰モデルを開発した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:この研究で使用された3つの検出方法の比較。

表2:以前の方法と現在の研究の比較。

補足図1:アンピシリンを含む薄層クロマトグラム(TLC)プレートを青色LED照明法でスキャンしました。 (A)TLC分析の移動相として酢酸エチル:メタノール(9:13 v / v)を使用し、TLCプレートを青色LEDイルミネーターでスキャンしました。(B)アンピシリンの4つの標準物質の濃度は、1番(100 mg / mL)、2番(75 mg / mL)、3番(50 mg / mL)、および4番(25 mg / mL)でした。バンドの寸法は、イメージングソフトウェアによって測定されました。(C)TLCプレート上のアンピシリン標準バンドの寸法に基づくデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して回帰モデルを開発しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:青色LED照明法でスキャンしたアプラマイシンを含む薄層クロマトグラム(TLC)プレート。 (A)メタノール:水(6:5 v / v)をTLC分析の移動相として使用し、TLCプレートを青色LEDイルミネーターでスキャンしました。(B)4つのアプラマイシン標準の濃度は、No.1(50 mg / mL)、No.2(40 mg / mL)、No.3(30 mg / mL)、およびNo.4(20 mg / mL)でした。バンドの寸法は、イメージングソフトウェアによって測定されました。(C)TLCプレート上のアプラマイシン標準バンドの寸法に基づくデータ分析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して回帰モデルを開発しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。