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方法論記事

ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

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DOI:

10.3791/64323

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2022年8月18日

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1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Translation Science Program, Morningside Graduate School of Biomedical Sciences, University of Massachusetts Chan Medical School

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の in vitro 実験のためのミクログリア様細胞への分化プロセスについて説明しています。また、生細胞イメージングシステムを使用した in vitro 食作用アッセイの基質として使用できるiPS細胞由来の低運動ニューロンからヒトシナプトソームを生成するための詳細な手順も含まれています。

要約

ミクログリアは、脳微小環境の恒常性を維持する骨髄系起源の常在免疫細胞であり、複数の神経疾患の主要なプレーヤーとなっています。健康と病気におけるヒトミクログリアの研究は、ヒト細胞の供給が非常に限られているため、課題を表しています。ヒト個体由来の人工多能性幹細胞(iPSC)は、この障壁を回避するために使用することができる。ここでは、ヒトiPS細胞をミクログリア様細胞(iMG)に分化させて in vitro 実験を行う方法を実証します。これらのiMGは、ミクログリア様形態、適切なマーカーの発現、活発な食作用など、ミクログリアの期待される生理学的特性を示します。さらに、ヒトiPS細胞由来の下位運動ニューロン(i3LMN)に由来するシナプトソーム基質を単離および標識するための文書が提供されています。生細胞の縦断的イメージングアッセイを使用して、pH感受性色素で標識されたヒトシナプトソームの飲み込みを監視し、iMGの貪食能力を調べることができます。本明細書に記載のプロトコルは、ヒトミクログリア生物学および疾患へのミクログリアの寄与を調査している異なる分野に広く適用可能である。

概要

ミクログリアは中枢神経系(CNS)に常在する免疫細胞であり、CNSの発症に重要な役割を果たしています。ミクログリアは、成人の脳において恒常性を維持し、外傷や疾患のプロセスに積極的に反応するためにも重要です。累積的な証拠は、ミクログリアが複数の神経発達および神経変性疾患の病因の主要な原因であることを示しています1,2。ミクログリア生物学に関する現在の知見は主にマウスモデルから得られてきましたが、最近の研究ではマウスとヒトミクログリアの重要な違いが解明されており、ヒトミクログリアの遺伝学と生物学的機能を研究する技術を開発する必要性が強調されています3,4。解剖された初代組織からのミクログリアの単離は、ミクログリアの特性を著しく変化させる可能性があり5、そのような細胞で得られた結果を交絡させる可能性があります。この方法の全体的な目標は、ヒトiPS細胞をiMGに分化させることであり、それによって基礎条件下でヒトミクログリアを研究するための細胞培養システムを提供することです。さらに、完全ヒトモデル系を用いた食作用アッセイは、品質管理尺度として、および疾患の状況におけるiMG機能障害を評価する手段として、iMGの機能性を研究する手段として本明細書に含まれる。

iPS細胞からのミクログリア分化のための複数のプロトコルが、最近、文献6、7、8、9、10に出現した。いくつかのプロトコルの潜在的な欠点には、長期間または長期間の分化、複数の成長因子の追加、および/または複雑な実験手順が含まれる6、9、10。ここでは、iPS細胞をプリミティブマクロファージ前駆体(PMP)と呼ばれる前駆細胞に分化させることで、ミクログリア個体発生の側面を再現する「ユーザーフレンドリーな」分化方法が実証されています7,11。PMPは、前述のように生成され、いくつかの最適化が本明細書12に提示される。PMPは、MYB非依存性の卵黄嚢由来のマクロファージを模倣しており、血液脳関門閉鎖の前に脳に侵入することにより、胚発生中にミクログリアを引き起こします13。PMPをiMGに最終的に分化させるために、HaenselerらとBrownjohnらのプロトコルに基づく高速で簡略化された単一培養法を使用し、iMGがミクログリア富化マーカーを堅牢に発現する効率的なミクログリア分化法を生成するためにいくつかの変更を加えました7,8。この分化法は、iPS細胞の培養に関する専門知識を持ち、ヒトモデルシステムを用いたミクログリア生物学の研究を目的とした研究目標を持つ研究室で再現することができます。

iPS細胞由来のミクログリアは、in vitro実験のためのヒトミクログリアの生物学的に関連する供給源であり、食作用を含むミクログリアの標準機能を調査するための重要なツールです。ミクログリアは、脳とCNSの専門的な食細胞であり、細胞の破片、凝集したタンパク質、および分解されたミエリンを取り除きます14。ミクログリアはまた、シナプスを飲み込むことによるシナプスリモデリングや、病原体の食作用による外部感染に対する防御にも機能します15,16。このプロトコルでは、iMGによる食作用は、iMG巻き込みの材料としてヒトシナプトソームを使用して評価されます。この目的のために、ヒトi3LMNsに由来するシナプトソームを単離するための記載が記載されている。i3LMN由来のヒトシナプトソームは、pH感受性色素で標識されており、in vitroでのファゴソーム処理および分解中に酸性コンパートメント内に局在するシナプトソームの定量を可能にします。ミクログリア巻き込みの動的プロセスをリアルタイムでモニタリングするために、生細胞顕微鏡を用いた食作用アッセイが示されています。この機能アッセイは、完全なヒトシステムを使用して、健康と病気におけるミクログリア食作用の可能性のある欠陥を調査するための基礎を確立します。

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プロトコル

注:このプロトコルで使用されるすべての試薬は無菌である必要があり、すべてのステップは無菌条件下でバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。すべてのiPS細胞株、ならびに維持および分化培地は、材料表に記載されています。以下に図示されるミクログリア鑑別方法は、本明細書に記載される新たな改変を伴う以前に公表されたプロトコル7、8、12に基づく。

1.ミクログリア分化

メモ: プロトコルの概要を 図 1 に示します。

  1. 人工多能性幹細胞(iPSC)培養
    注:iPS細胞培養技術を説明する詳細については、他の場所17を参照してください。
    1. 解凍とメンテナンス
      1. iPSC培地を調製し、培地を分注し、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。アリコートを4°Cで一晩解凍し、最大1週間使用します。使用前に、メディアを周囲温度に少なくとも1時間放置してください。
      2. カルシウムとマグネシウム18を含むDPBSで希釈した10 μg/mLのラミニン521を1 mL添加して、6ウェルプレートのウェルをコーティングします。プレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターに少なくとも2時間、できれば一晩保管します。希釈したら、ラミニンを4°Cで3ヶ月間保存します。
      3. 滅菌水で希釈することにより、10 mM Rhoキナーゼ阻害剤Y27632(ROCK阻害剤)ストック溶液を調製します。ROCK阻害剤溶液のシングルユースアリコートを作成し、-20°Cで最大1年間保存します。
      4. 0.5 M EDTAのストック溶液をDPBSで希釈して、0.5 mM EDTAを調製します。
      5. 凍結したiPS細胞のバイアルを解凍するには、バイアルを37°Cの水浴に入れて、ほとんど解凍するまで入れます。バイアルの内容物を直ちに、4 mLの iPS細胞培地を含む15 mLのコニカルチューブに移します。500 × g で1分間遠心分離します。
      6. 上清を吸引し、10 μM ROCK阻害剤を含む iPS細胞培地 1 mLをチューブの壁にゆっくりと加え、コロニーの乱れを避けるために細胞を再懸濁します。
      7. 10 μM ROCK阻害剤を含む iPS細胞 培地1.5 mLをコーティングした各ウェルに加え、再懸濁したコロニーを培地を含むウェルに一滴ずつ移します。
        注:培養の維持にはステップ1.1.1.6から5〜7滴を使用しますが、すべてのiPS細胞株に最適な播種密度を調整します。
      8. プレートを手動で左右および前後にシャッフルすることにより、ウェル内の細胞を均等に分配します。細胞を37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れる。翌日、ROCK阻害剤を含まない新鮮な iPS細胞 培地を添加して培地を完全に交換する。
      9. メンテナンスのために、細胞が80%コンフルエントに達するまで毎日培地を交換してください。
        注:使用する iPS 細胞培地が柔軟な給餌スケジュールを可能にする場合、細胞は培地を交換することなく2日間維持することができます。これを継代ごとに1回に制限し、細胞が50%未満のコンフルエントである場合にのみ行うことをお勧めします。.
    2. 分割
      1. 培地を吸引し、1 mLのDPBS(カルシウムとマグネシウムを含まない)で細胞を洗浄します。
      2. 細胞を除去するには、1 mLの0.5 mM EDTAを加え、細胞コロニーの端がウェルの表面から持ち上がるまで室温で2〜3分間インキュベートします。細胞をDPBSで再度洗浄し、1 mLの iPS細胞培地を加えます。
      3. 細胞リフターを使用して細胞コロニーを穏やかにこすり、細胞コロニーを解離します。コロニーを乱さないように、井戸の各領域を一度だけこすります。
        注:コロニーを井戸から取り除くための代替方法は、他の場所で見つけることができます17。
      4. 1 mLのピペットチップを使用して細胞を回収し、1.5 mLの iPS細胞培地を含むプレコートウェル(ステップ1.1.1.2で説明)に1:6の比率(細胞と培地)で一滴ずつ移します。
  2. ミクログリア様細胞(iMG)へのiPS細胞分化
    注:低分子および成長因子は、DPBS中の滅菌ろ過された0.1%ウシ血清アルブミンに最終濃度の1,000倍のストック濃度に溶解されます。早期継代時にiPS細胞をiMGに分化させることが推奨されます。iPS細胞株の定期的な核型検査が推奨されます。
    1. 標準コーティング液の準備
      1. 細胞外マトリックスコーティング試薬のストック溶液を氷上で4°Cで一晩解凍します。
      2. マイクロ遠心チューブとフィルターピペットチップを4°Cでプレチルします。
      3. 濃縮した細胞外マトリックスコーティング試薬250 μLを各チューブに分注し、直ちに氷上に置きます。アリコートは-20°Cで保存してください。
      4. コーティング溶液を調製するには、細胞外マトリックスコーティング試薬アリコートの1つを氷上で4°Cで一晩解凍します。
      5. ヒト胚性および人工多能性幹細胞(DMEM-F12と呼ばれる)の増殖に最適化された50 mLの氷冷DMEM-F12培地をプレチルドコニカルチューブに加え、氷上に保ちます。
      6. 氷冷したDMEM-F12を複数回上下にピペッティングして1 mLのピペットチップを冷却し、すぐにピペットチップを使用して250 μLの細胞外マトリックスコーティング試薬をDMEM-F12培地を含むコニカルチューブに移します。
        注:標準コーティング溶液は、4°Cで2週間保存できます。
    2. 胚様体(EB)形成
      1. 4°Cで最大4日間維持できる EB培地 を準備します。
      2. iPS細胞が80%のコンフルエントに達したら、1 mLのDPBSで洗浄し、1 mLの解離試薬を加えて37°Cで2分間解離させ、コロニーを解離させます。 セルリフターを使用してコロニーを複数回こすり、単一細胞懸濁液を作成します。細胞を収集し、9 mLのDPBSを含む15 mLのコニカルチューブにすべてを移します。
      3. 細胞を500 × g で1分間遠心分離し、上清を除去して、細胞を1 mLの EB培地に再懸濁します。10 μLの細胞を取り、トリパンブルーで1:1に希釈します。血球計算盤で細胞をカウントし、細胞数に基づいて、細胞ストックを100 μLあたり10,000細胞の最終希釈まで希釈します。プレーティングセルの場合は、ウェルあたり100 μLの希釈セルを低接着性の丸底96ウェルプレートに追加します。
        注:一般に、96ウェルプレートの48ウェルは、iPS細胞の80%コンフルエントウェルから得ることができます。
      4. プレートを125 × g で3分間遠心分離し、37°C、5%CO2 で4日間インキュベートします。2日目にマルチチャンネルピペットを使用し、50 μLの古い培地を静かに回収し、50 μLの新しい EB培地を再び追加して、ハーフ培地交換を行います。
        注:4日目に、iPS細胞は結果セクションで説明されているように、EBと呼ばれる球状の細胞構造を形成します。EB鑑別プロセスは、必要に応じて最大7日間延長することができます。
    3. プリミティブマクロファージ前駆体(PMP)の生成
      1. PMPベース培地、滅菌フィルターを調製し、4°Cで最大1ヶ月間保存します。
      2. 1 mLの氷冷マトリゲルコーティング溶液を加えて6ウェルプレートのウェルをコーティングし、37°Cおよび5%CO2 で少なくとも2時間または好ましくは一晩インキュベートします。
      3. EB分化の4日目に、1 mLピペットチップでEBを回収することにより、EBをマトリゲルコーティングウェルに移します(ピペットを使用)。ピペットを上下に1〜2回使用して、EBをウェルから取り除きます。6ウェルプレートを傾斜角度で保持し、EBがウェルの端に落ち着くようにします。
        注:コーティングされたウェルごとに9個または10個のEBをメッキできます。
      4. すべてのEBが落ち着いたら、EBをウェルの端に保ちながら、1 mLピペットチップを使用して古い培地を静かにピペットで取り除きます。3 mLの新しく調製した PMP完全培地 を各ウェルに加えます。プレートを手動で左右および前後にシャッフルすることにより、ウェル内の細胞を均等に分配します。プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れる。
      5. EBがウェルの底に付着できるように、プレートを7日間乱さないでください。その後、完全培地の PMPを用いて半培地交換を行う。
        注:この時点で、ほとんどのEBをプレートに取り付ける必要があります。フローティング EB はすべて削除できます。
      6. 5〜7日後、4倍の倍率でライトフィールド顕微鏡でEBを検査して、ウェルの底に付着していることを確認します。1.2.3.5の説明に従ってメディアを変更します。21日目に、3 mLのPMP完全培地で 完全培地交換を行います。
        注:培地に浮遊する骨髄系前駆細胞は、この時点で明らかである可能性があります。これらの細胞は、培地交換中に廃棄する必要があります。
      7. 28日目に、上清中のPMPと呼ばれる丸い細胞を探し、10 mLピペットと自動ピペッターを使用してPMPを含む培地を収集します。EBを邪魔しないように注意してください。PMPと培地を15 mLのコニカルチューブに移し、ステップ1.2.4の説明に従って進めます。
        注:通常、同じiPSCラインからのPMPは、6ウェルプレートの5つのウェルから収集し、単一の15 mLコニカルチューブに一緒にプールすることができます。
      8. EBのさらなるメンテナンスのために、3 mLの新鮮な PMP完全培地 を追加します。PMPは3か月以上EBから継続的に出現するため、手順1.2.3.7および1.2.3.8で説明されているように、4〜7日ごとにPMPを収集します(培地の色が黄色の色調に変化しないようにしてください)。
        注:PMPは数か月間収集できますが、時間の経過とともに表現型が変化する可能性があります。
    4. iMGへの差別化
      1. iMGベース培地(材料表)を調製し、滅菌フィルターを4°Cで最大3週間保存します。
      2. PMPを15 mLのコニカルチューブに回収したら、200 × g で4分間遠心分離します。上清を吸引し、1〜2 mLの iMG基礎培地を使用してPMPを再懸濁します。血球計算盤を使用して、少量のアリコートを取り、トリパンブルーで1:1に希釈して細胞を数えます。
        注:0.5-1.5×106 PMPは通常、iPS細胞株とEB培養の年齢に応じて毎週得られます。
      3. 残りの細胞を200 × gで4分間遠心分離します。新たに調製したiMG完全培地を使用して、細胞を細胞培養処理プレート上に~105/cm2の密度で播種するように、PMPを所望の濃度に希釈します。最終分化を可能にするために、10〜12日間、3〜4日ごとに、新たに調製したiMG完全培地を使用して半培地交換を行います。
        注:この時点で、細胞はミクログリア様の形態を獲得するはずです。ミクログリアの運命に対するPMPの関与を確認するために、免疫蛍光分析が行われ、プリン作動性受容体P2RY12や膜貫通タンパク質119(TMEM119)9などのミクログリア富化マーカーの発現が裏付けられます。
      4. 細胞の健全性と生存率を維持するために、iMG分化の10日目から12日目の間にすべての実験を実施してください。

2. 運動ニューロン由来ヒトシナプトソームを用いた貪食アッセイ

  1. 転写因子を介したiPS細胞由来低運動ニューロンの分化(i3ティッカー)
    注:ニューロゲニン-2(NGN2)、膵島-1(ISL1)、およびLIMホメオボックス3(LHX3)転写因子を含むhNIL誘導性転写因子カセットをCLYBLセーフハーバー遺伝子座に安定的に挿入したWTC11株を、前述のように分化プロセスに使用しました。17.iPSCラインは、ステップ1.1.1で説明されているように維持されましたが、ステップ1.2.1で説明されているコーティング条件でした。ラミニン521は必要ないため、神経分化に使用されるiPS細胞の培養には、任意の細胞外マトリックスコーティング試薬を使用できます。すべてのメディアは、使用前に少なくとも1時間周囲温度に平衡化されています。
    1. ステップ1.2.1の説明に従って、10 cmの皿に5 mLの標準コーティング溶液をコーティングします。
      注:ここでは、分化ごとに3〜4個の10cmディッシュを使用しました。
    2. 誘導ベース培地、滅菌フィルターを調製し、4°Cで最大3週間保管します。
    3. ニューロン培地、滅菌フィルターを調製し、4°Cで最大2週間保存します。
    4. 滅菌水中で100 mMホウ酸、25 mM四ホウ酸ナトリウム、および75 mM塩化ナトリウムを混合してホウ酸緩衝液を調製します。pHを8.5に調整し、滅菌ろ過します。
    5. iPS細胞が80%のコンフルエントに達したら、細胞をDPBSで洗浄し、0.5 mM EDTAを加えてコロニーを除去します。
      注:通常、10 cmの皿ごとに2つのウェルで十分です。
    6. 周囲温度で4〜5分間細胞をインキュベートします。EDTAを取り外し、HEPESを含むDMEM/F12を3 mLずつ各ウェルに加えます。
    7. セルリフターを使用して細胞をこすり落とし、10 mLピペットを使用して、2〜3倍に穏やかに上下にピペッティングして、ウェルの底から細胞を取り除きます。
    8. 細胞を15 mLのコニカルチューブに集め、300 × g で3分間遠心分離します。
    9. 10 μM ROCK阻害剤を含む3 mLの iPS細胞培地 に細胞を再懸濁し、血球計算盤を使用してカウントします。
    10. 10 μM ROCK阻害剤を含む12 mLのiPS細胞培地を入れたプレコート10 cmディッシュに1.5 ×10 6個の iPS細胞 をプレートします。
    11. 翌日、培地を取り除き、細胞をDPBSで洗浄します。新たに調製した 完全誘導培地 12 mLを加えて、転写因子の発現を誘導します。
    12. 2日目に、ホウ酸緩衝液で希釈した0.1 mg/mLのポリ-D-リジンと1 mg/mLのポリ-L-オルニチンを等量で調製した5 mLのニューロンコーティング溶液で10 cmのディッシュをコーティングします。37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。
    13. 3日目に、コーティングされた皿を滅菌水で3回洗浄し、水を完全に吸引し、プレートを傾けて、周囲温度で少なくとも1時間、バイオセーフティキャビネット内で部分的に覆われていないままにして、皿を乾かします。
    14. 皿が完全に乾いたら、15 μg/mLのラミニンと40 μM BrdUを添加した6 mLの 完全誘導培地 で、37°Cと5%CO2で少なくとも1時間コーティングします。
      注:BrdU処理は、有糸分裂活性細胞を排除し、ニューロン培養の純度を高めるために推奨されます。ニューロンの健康に対するBrdUの影響は最小限です。
    15. 分化細胞を10 cmディッシュあたり3 mLの解離試薬で処理し、周囲温度で3〜4分間インキュベートします。
    16. 解離試薬を除去せずに6 mLのDPBSをプレートに加え、溶液中の細胞を10 mLピペットで4〜5倍にピペットで上下にピペットして細胞を解離させます。
    17. 細胞懸濁液を回収し、40 μmのセルストレーナーを通して50 mLのコニカルチューブに入れます。1 mLの 誘導ベース培地 を加えて、ストレーナーをすすぎます。
    18. 細胞を300 × g で5分間遠心分離します。培地を吸引し、40 μM BrdUを含む3 mLの 完全誘導培地 に細胞を再懸濁します。
    19. 血球計算盤で細胞を数えます。ステップ2.1.14で添加したコーティング溶液を除去せずに、40 μM BrdUを含む6 mLの完全誘導培地で細胞を希釈することにより、10 cmディッシュあたり約2.5×106細胞をプレコートディッシュにプレートします。
    20. 4日目に、培地を吸引し、細胞をDPBSで1回洗浄し、40 μM BrdUを含む新しい 完全誘導培地 を追加します。
    21. 6日目に、培地を吸引し、細胞をDPBSで1回洗浄し、1 μg/mLのラミニンを添加した ニューロン培地 を加えます。
    22. 9日目に、1 μg/mLのラミニンを添加した新しいニューロン培地と交換して、培地の1/3を交換します。
    23. 3〜4日ごとに新鮮な1 μg / mLのラミニンを添加したニューロン培地でハーフ培地交換を行うことにより、さらに3つのLMNをさらに25日間維持します。
      注:この時点で、i3LMNは長いプロセスを持つニューロン形態を示すはずです。ニューロンはまた、細胞の塊またはクラスターを形成する傾向があります。i3LMNの分化を検証する方法のより詳細な説明は、他の場所17で見つけることができます。
  2. シナプトソームの精製と標識
    注意: 無菌状態を維持し、バイオセーフティキャビネット内のすべての手順を実行します。
    1. 3つのLMNをDPBSで2回洗浄します。
    2. シナプトソームを単離するための氷冷細胞溶解試薬2 mLを加え、氷上で2分間インキュベートし、ニューロンをしっかりとこすります。
    3. ライセートを複数の2 mLマイクロチューブ(チューブあたり~1.5 mLライセート)に移し、1,200 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
      注意: この手順全体を通して、チューブを氷上に維持してください。
    4. 上清を回収し(ペレットを廃棄)、15,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。 シナプトソームを含むペレットを、DPBSの5%DMSOと同様の容量(元のライセートと)で保存して再懸濁します。
      注:シナプトソームは、蛍光色素で直ちに標識するか、将来の使用のために-80°Cで保存することができます。
    5. すべてのチューブに対してビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイを実行して、シナプトソーム調製物中のタンパク質の総収量を評価します。
      注:タンパク質濃度を測定するための他のアッセイを使用できます。異なる調製物から得られた総タンパク質収率は、基準として 表1 に含まれている。シナプス前およびシナプス後タンパク質の存在を確認するために、シナプトソーム調製物のウェスタンブロット分析を行うことが推奨される。ここでは、シナプス前マーカーであるシナプトフィジン(SYP)とシナプス後マーカーであるシナプス後密度タンパク質95(PSD95)を、前述のようにウェスタンブロッティング解析用に選択した19。
    6. 100 mM重炭酸ナトリウムを水中に溶かした溶液を調製し、pHを8.5に調整し、滅菌フィルターに入れます。
    7. 使用したpH感受性色素の凍結乾燥粉末1 mgを150 μLのDMSOに可溶化します。使い捨てアリコートを作り、-80°Cで保管します。
    8. シナプトソームを15,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
    9. 100 μLの100 mM重炭酸ナトリウム溶液で最大1 mgのシナプトソームを希釈します。
    10. シナプトソームを標識するには、シナプトソーム1 mgあたり再構成されたpH感受性色素を1 μL添加し、光にさらされないように反応物をアルミホイルで覆います。チューブシェーカーを使用して室温で2時間振とうします。
    11. 1 mLのDPBSをチューブに加え、標識シナプトソームを15,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
    12. 上清を取り除き、ステップ 2.2.11 の説明に従ってさらに 4 回の洗浄を実行します。
    13. 最後の洗浄とスピンの後、ペレットを乱すことなく上清をできるだけ取り除き、標識したシナプトソームをDPBS中の5%DMSOで所望の濃度(ここでは0.7 μg/μLを使用)の量で再懸濁します。使い捨てアリコートを調製し、-80°Cで保存します。 標識されたシナプトソームへの光の露出を避けるようにしてください。
  3. 生細胞食作用アッセイ
    1. プレート20-30 ×10 4 PMPを100 μLの iMG完全培地中の96ウェルプレートに入れ、ステップ1.2.4に示すように10日間分化プロセスに従います。
    2. アッセイ当日、生細胞用核染色剤1滴を iMG基礎培地2mLに添加して核染色液を調製する。
    3. 96ウェルプレートのウェルあたり40 μLの培地を除去し、マルチチャンネルピペットを使用して10 μLの核染色溶液を追加します。プレートを37°C、5%CO2 で2時間インキュベートします。
    4. 標識されたシナプトソームを氷上で解凍し、1分間水超音波処理器を使用して穏やかに超音波処理する。すぐにシナプトソームを氷に戻します。標識シナプトソームを iMG完全培地 で、培地50 μLあたりシナプトソーム1 μLの比率で希釈します。
      注:シナプトソームの濃度はアッセイに依存し、最適化が必要な場合があります。培地中のDMSOの割合を比較的低く(すなわち、0.1%以下)維持するために、ウェルあたり2μLを超えるシナプトソームを追加しないことをお勧めします。
    5. 陰性対照として、いくつかのウェルをサイトカラシンDで前処理して、アクチン重合を阻害し、したがって食作用を阻害する。 iMG完全培地中の60 μMサイトカラシンDの溶液を調製する。この溶液を各ウェルに10 μL加え、最終濃度10 μMとし、37°C、5%CO2 で30分間インキュベートします。
    6. プレートをインキュベーターから取り出し、10°Cで10分間インキュベートします。プレートを氷上に維持し、ステップ2.3.4の説明に従って調製したシナプトソームを含む培地50 μLを追加します。
    7. プレートを270 × g で10°Cで3分間遠心分離し、画像取得までプレートを氷上に維持します。
  4. 画像の取得と分析
    1. プレートを生細胞イメージングリーダーに挿入し、分析するウェルを選択します。
    2. 20倍の対物レンズを選択します。
    3. 明視野チャンネルと青色(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール[DAPI])チャンネルのフォーカス、発光ダイオード(LED)強度、積分時間、ゲインを調整します。シナプトソーム蛍光は、最初の時点では無視できるはずです。赤(RFP)チャンネルに焦点を合わせるには、明視野チャンネルを参照として使用します。積分時間とゲインは実験によって異なります。赤チャンネルには、LED:4、積分時間:250、ゲイン:5の初期設定を使用します。
    4. ウェルごとにモンタージュで取得する個々のタイルの数を選択します(ウェルの中心で16個のタイルを取得し、それによってウェル全体の約5%をイメージングします)。温度を37°Cに設定し、イメージングに必要な時間間隔を設定します。
      注:この研究では、画像は1〜2時間ごとに最大16時間取得されました。
    5. 解析ソフトウェアを開きます。
      1. 画像を含む実験を開きます。 データ削減 アイコンをクリックします。
      2. メニューの「画像処理」の「イメージングスティッチング」を選択すると、表 2 に示すパラメータを使用して、モンタージュ内の 4 x 4 の個別のタイルから完全な画像が作成されます。
      3. ステッチされた画像が作成されたら、これらの画像のDAPIおよびRFPチャネルを使用して強度しきい値を定義します。画像を開き、[分析]をクリックします。[分析] で [セルラー分析] を選択し、[検出チャネル] で、DAPI チャネルまたは RFP チャネルでステッチされた画像を選択します。[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、DAPIチャネルの細胞核またはRFPチャネルのシナプトソーム信号を適切に選択するしきい値とオブジェクトサイズの値を設定します。実験全体に適用できるパラメーターが最適化されるまで、異なる画像でこのプロセスを繰り返します。
        メモ: 推奨値は 表 2 に記載されています。
      4. 核の数をカウントするには、[データ削減]メニューに移動し、[画像分析]で[細胞分析]を選択します。[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、[チャネル]でDAPIステッチ画像を選択し、表2で説明されているパラメーターを使用します。
      5. [計算指標] タブに移動し、[セル数] を選択します。シナプトソームシグナルの領域を取得するには、[データ削減]メニューに移動し、[分析]で[細胞分析]を選択します。
      6. [プライマリマスクとカウント]タブに移動し、[チャネル]でRFPステッチ画像を選択し、表2に詳述されているパラメーターを使用します。
      7. [計算指標]タブに移動し、[オブジェクト合計領域]を選択します。の中に データ削減 タブで、[OK]をクリックして、ソフトウェアが取得したすべての画像を分析できるようにします。
      8. 各時点の[ オブジェクトの合計面積 ]と [セル数 ]の値をエクスポートします。 オブジェクト合計面積 を セル数で割って、時間ポイントごとの正規化面積を計算します。複数の治療法または遺伝子型を比較する場合は、式 (1) を使用して食作用指数を計算します。
        figure-protocol-1 (1)
      9. 結果を保存し、データを統合します。

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結果

このプロトコルを使用してiMGを生成するには、明確なエッジを持つコンパクトなコロニー形態を示す未分化iPS細胞から始めることが重要です(図2A)。EB形成のセクションで説明したように維持された解離したiPS細胞は、EBと呼ばれる球状の凝集体を形成し、分化の4日目までサイズが大きくなります(図2B)。EBが収集され、PMP生成に適した条件でメッキされると、それらはマトリゲルコーティングされたプレートに付着し、細胞の層が広がり、球状の凝集体を囲みます(図2C)。不健康なEBはプレートから外れるため、排除する必要があります。PMP生成の14日目から21日目まで、潜在的に異なる細胞タイプが出現し、培地中に浮遊する可能性があります。これらの細胞は、培地交換中に廃棄する必要があります12。28日目に、細胞質と核の比率が大きい丸い細胞が浮遊状態で現れます(図2D)、P...

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ディスカッション

ここで説明する分化プロトコルは、iPS細胞由来のミクログリア様細胞を6~8週間で高純度で、より多くの細胞を必要とする免疫蛍光実験やその他のアッセイを行うのに十分な収率で得る効率的な方法を提供します。このプロトコルでは、1週間で最大1×106 iMGが得られ、タンパク質とRNAの抽出、および対応するダウンストリーム分析(RNASeq、qRT-PCR、ウェスタンブロット、質量分析など)が可能になります。とはいえ、このプロトコルの制限は、iMGの歩留まりによって特定のアプリケーションが制限される可能性があることです。異なる週からのPMPを蓄積し、分化プロセスを一度に進行させるのに十分な前駆細胞が収集されるまで懸濁液中で均質な培養を維持するために、追加の修飾を実施することができる18。あるいは、EBの分化は、PMPの産生を増加させるために、より高い面積の細胞培養プレートを使用することによってスケールアップすることができる。

分化プロセスを開始するには、ラミニン521コーティングプレートで培養したiPS細胞を使用することを...

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開示事項

著者は宣言する利益相反はありません。

謝辞

著者らは、運動ニューロン分化用のWTC11 hNIL iPS細胞株を提供してくれたMichael Wardと、ミクログリア分化に使用されるKOLF2.1J WTクローンB03 iPS細胞株を提供してくれたジャクソン研究所に感謝している。また、プロトコルの実施中の支援を提供してくれたドロシー・シェイファー氏、生細胞イメージングシステムを支援してくれたアンソニー・ジャンペトルッツィ氏とジョン・ランダース氏、改訂中の技術的貢献をしてくれたヘイデン・ガッド氏、この研究での協力についてジョナサン・ユング氏にも感謝します。この研究は、UMASSチャン医科大学の神経科学のためのダンとダイアンリッチョ基金とエンジェル基金、Inc.によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
免疫蛍光分析用抗体
anti-IBA1ウサギ抗体Wako Chemical USANC92883641:350希釈抗
P2RY12ウサギ抗体Sigma-AldrichHPA0145181:50希釈抗
TMEM119ウサギ抗体Sigma-AldrichHPA0518701:100
希釈ウェスタンブロット分析用抗体
anti-&β;-Tubulinウサギ抗体Abcamab60461:500
抗Synaptophysin(SYP)ウサギ抗体AbclonalA63441:1,000
抗PSD95マウス抗体ミリポアMAB15961:500
<ストロング>ホウ酸バッファー成分
ホウ酸 (100 mM)シグマB6768
重炭酸ナトリウム (NaHCO<サブ>3) BioXtraSigma-AldrichS6297-250G
塩化ナトリウム (75 mM)シグマ S7653
四ホウ酸ナトリウム (25 mM)Sigma221732
細胞培養材料
6-well platesGreiner Bio-One657160
40 μm セルストレーナー Falcon352340
100 mm x 20 mm組織培養処理CELLTREAT229620
セルリフター、ダブルエンド、フラットブレード &ナローブレード、滅菌CELLTREAT229305
低接着性 丸底 96 ウェルプレートCorning7007
Primaria 24 ウェル平底表面改変マルチウェル細胞培養プレートCorning353847,Primaria
6 ウェル セルクリア フラットボトム表面改変マルチウェル培養プレートCorning353846
Primaria 96 ウェル クリアフラット底面 Corning353872
Cell dissociation reagents
Accutase 低運動ニューロン分化に使用される25058CI
TrypLE試薬Life Technologies12-605-010ミクログリア分化に使用される解離試薬
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFRメンブレンマトリックスコーニング™354230細胞外マトリックスコーティング試薬
CellAdhere Laminin-521STEMCELL Technology77004ラミニン 521
Poly-D-LysineSigmaP7405ホウ酸緩衝液中で0.1 mg/mLに再構成
Poly-L-OrnithineSigma P3655ホウ酸バッファー
<ストロング> iPSC培地
 mTeSR PlusキットSTEMCELLテクノロジー100-0276iPSC培地混合した成分を
EB培地>
BMP-4Fisher ScientificPHC9534最終濃度 50 ng/mL
iPSC 培地最終濃度 1x
ROCK阻害剤Y27632フィッシャーサイエンティフィックBD 562822最終濃度10 µM
SCFPeproTech300-07最終濃度 20 ng/mL
VEGFPeproTech100-20A最終濃度 50 ng/mL
PMP ベース培地
GlutaMAXGibco35050061最終濃度 1x
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)の成分Gibco15140122最終濃度 100 U/mL
X-VIVO 15ロンザ12001-988最終濃度 1x
PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanolGibco21985023最終濃度 55 & マイクロ;M
IL-3PeproTech200-03最終濃度 25 ng/mL
M-CSFPeproTech300-25最終濃度 100 ng/mL
PMP ベース培地最終濃度 1x
iMG ベース培地の成分
Advanced DMEM/F12Gibco最終濃度12634010 1x
GlutaMAXGibco35050061最終濃度 1x
N2 サプリメント、100xGibco17502-048最終濃度 1x
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Gibco15140122最終濃度 100 U/mL
iMG complete media
55 mM 2-メルカプトエタノールGibco21985023最終濃度 55 &M
IL-34PeproTech または Biologend200-34 または 577904最終濃度 100 ng/mL
iMG ベース培地最終濃度 1x
M-CSFPeproTech300-25最終濃度 5 ng/mL
TGF-&β;PeproTech100-21最終濃度 50 ng/mL
>
HEPESGibco11330032最終濃度 1x
GlutaMAXGibco35050061最終濃度 1x
N2 サプリメント、100xGibco17502-048最終濃度濃度 1x
非必須アミノ酸 (NEAA)、100xGibco11140050最終濃度 1x
>><
ECalbiochem565790最終濃度 0.2 μMおよびストック試薬を1:1エタノールおよびDMSO
ドキシサイクリンSigmaD9891最終濃度2 &muで2 mMに再構成します。g/mL およびストック試薬を DPBS
Induction base 培地最終濃度 1x
ROCK 阻害剤 Y27632Fisher ScientificBD 562822最終濃度 10 μニューロン
の MComponents of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture SystemGibcoA3653401最終濃度 1x 培地およびサプリメント用
GlutaMAXGibco35050061最終濃度 1x
N2 サプリメント、100xGibco17502-048最終濃度 1x
非必須アミノ酸 (NEAA)、100xGibco11140050最終濃度 1x
iPSC ライン この研究で使用
KOLF2.1J: WT クローン B03The Jackson Laboratories
WTC11 hNILNational Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay KitThermo Scientific Pierce23227
ジメチルスルホキシド (DMSO)SigmaD2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction ReagentThermo Scientific87793ナプトソームの単離のための細胞溶解試薬
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready試薬Invitrogen R37605
pHrodo レッド スクシンイミジルエステルサーモフィッシャーサイエンティフィ P36600pH感受性色素
<強>その他の細胞培養試薬
トリパンブルー、0.4% 溶液AMRESCOINC K940-100ML
ウシ血清アルブミン (BSA)シグマ22144-77-0
BrdUシグマB9285滅菌水中で 40 mM に再構成
カラシン Dシグマ最終濃度 10 & マイクロ;
カルシウムとマグネシウムを含むM DPBSコーニング21-030-CV
カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSコーニング21-031-CVDPBS
ノックアウトと呼ばれる DMEM/F-12Gibco12660012ヒト胚性および誘導多能性幹細胞の増殖に最適化されたDMEM-F12
ミニンマウスタンパク質、天然Gibco23017015ラミニン
<ストロング>ソフトウェアおよび機器
遠心分離機エッペンドルフモデル 5810R
Cytation 5 ライブセルイメージングリーダーBiotek
Gen5 マイクロプレート リーダーおよびイメージャー ソフトウェアBiotekバージョン 3.03
Multi-Therm Heat-ShakeBenchmarkチューブ シェーカー
ウォーター ソニケーターエルマモード トランスソニック 310
希釈希釈希釈Corning 解離試薬BMP-4の成分に1x><< シック サイト ラ

参考文献

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