このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の in vitro 実験のためのミクログリア様細胞への分化プロセスについて説明しています。また、生細胞イメージングシステムを使用した in vitro 食作用アッセイの基質として使用できるiPS細胞由来の低運動ニューロンからヒトシナプトソームを生成するための詳細な手順も含まれています。
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方法論記事
ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ
この記事について
サマリー
要約
ミクログリアは、脳微小環境の恒常性を維持する骨髄系起源の常在免疫細胞であり、複数の神経疾患の主要なプレーヤーとなっています。健康と病気におけるヒトミクログリアの研究は、ヒト細胞の供給が非常に限られているため、課題を表しています。ヒト個体由来の人工多能性幹細胞(iPSC)は、この障壁を回避するために使用することができる。ここでは、ヒトiPS細胞をミクログリア様細胞(iMG)に分化させて in vitro 実験を行う方法を実証します。これらのiMGは、ミクログリア様形態、適切なマーカーの発現、活発な食作用など、ミクログリアの期待される生理学的特性を示します。さらに、ヒトiPS細胞由来の下位運動ニューロン(i3LMN)に由来するシナプトソーム基質を単離および標識するための文書が提供されています。生細胞の縦断的イメージングアッセイを使用して、pH感受性色素で標識されたヒトシナプトソームの飲み込みを監視し、iMGの貪食能力を調べることができます。本明細書に記載のプロトコルは、ヒトミクログリア生物学および疾患へのミクログリアの寄与を調査している異なる分野に広く適用可能である。
概要
ミクログリアは中枢神経系(CNS)に常在する免疫細胞であり、CNSの発症に重要な役割を果たしています。ミクログリアは、成人の脳において恒常性を維持し、外傷や疾患のプロセスに積極的に反応するためにも重要です。累積的な証拠は、ミクログリアが複数の神経発達および神経変性疾患の病因の主要な原因であることを示しています1,2。ミクログリア生物学に関する現在の知見は主にマウスモデルから得られてきましたが、最近の研究ではマウスとヒトミクログリアの重要な違いが解明されており、ヒトミクログリアの遺伝学と生物学的機能を研究する技術を開発する必要性が強調されています3,4。解剖された初代組織からのミクログリアの単離は、ミクログリアの特性を著しく変化させる可能性があり5、そのような細胞で得られた結果を交絡させる可能性があります。この方法の全体的な目標は、ヒトiPS細胞をiMGに分化させることであり、それによって基礎条件下でヒトミクログリアを研究するための細胞培養システムを提供することです。さらに、完全ヒトモデル系を用いた食作用アッセイは、品質管理尺度として、および疾患の状況におけるiMG機能障害を評価する手段として、iMGの機能性を研究する手段として本明細書に含まれる。
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プロトコル
注:このプロトコルで使用されるすべての試薬は無菌である必要があり、すべてのステップは無菌条件下でバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。すべてのiPS細胞株、ならびに維持および分化培地は、材料表に記載されています。以下に図示されるミクログリア鑑別方法は、本明細書に記載される新たな改変を伴う以前に公表されたプロトコル7、8、12に基づく。
1.ミクログリア分化
メモ: プロトコルの概要を 図 1 に示します。
- 人工多能性幹細胞(iPSC)培養
注:iPS細胞培養技術を説明する詳細については、他の場所17を参照してください。- 解凍とメンテナンス
- iPSC培地を調製し、培地を分注し、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。アリコートを4°Cで一晩解凍し、最大1週間使用します。使用前に、メディアを周囲温度に少なくとも1時間放置してください。
- カルシウム....
- 解凍とメンテナンス
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結果
このプロトコルを使用してiMGを生成するには、明確なエッジを持つコンパクトなコロニー形態を示す未分化iPS細胞から始めることが重要です(図2A)。EB形成のセクションで説明したように維持された解離したiPS細胞は、EBと呼ばれる球状の凝集体を形成し、分化の4日目までサイズが大きくなります(図2B)。EBが収集され、PMP生成に適した条件でメッキされると、それらはマトリゲルコーティングされたプレートに付着し、細胞の層が広がり、球状の凝集体を囲みます(図2C)。不健康なEBはプレートから外れるため、排除する必要があります。PMP生成の14日目から21日目まで、潜在的に異なる細胞タイプが出現し、培地中に浮遊する可能性があります。これらの細胞は、培地交換中に廃棄する必要があります12。28日目に、細胞質と核の比率が大きい丸い細胞が浮遊状態で現れます(図2D)、P.......
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ディスカッション
ここで説明する分化プロトコルは、iPS細胞由来のミクログリア様細胞を6~8週間で高純度で、より多くの細胞を必要とする免疫蛍光実験やその他のアッセイを行うのに十分な収率で得る効率的な方法を提供します。このプロトコルでは、1週間で最大1×106 iMGが得られ、タンパク質とRNAの抽出、および対応するダウンストリーム分析(RNASeq、qRT-PCR、ウェスタンブロット、質量分析など)が可能になります。とはいえ、このプロトコルの制限は、iMGの歩留まりによって特定のアプリケーションが制限される可能性があることです。異なる週からのPMPを蓄積し、分化プロセスを一度に進行させるのに十分な前駆細胞が収集されるまで懸濁液中で均質な培養を維持するために、追加の修飾を実施することができる18。あるいは、EBの分化は、PMPの産生を増加させるために、より高い面積の細胞培養プレートを使用することによってスケールアップすることができる。
分化プロセスを開始するには、ラミニン521コーティングプレートで培養したiPS細胞を使用することを.......
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開示事項
著者は宣言する利益相反はありません。
謝辞
著者らは、運動ニューロン分化用のWTC11 hNIL iPS細胞株を提供してくれたMichael Wardと、ミクログリア分化に使用されるKOLF2.1J WTクローンB03 iPS細胞株を提供してくれたジャクソン研究所に感謝している。また、プロトコルの実施中の支援を提供してくれたドロシー・シェイファー氏、生細胞イメージングシステムを支援してくれたアンソニー・ジャンペトルッツィ氏とジョン・ランダース氏、改訂中の技術的貢献をしてくれたヘイデン・ガッド氏、この研究での協力についてジョナサン・ユング氏にも感謝します。この研究は、UMASSチャン医科大学の神経科学のためのダンとダイアンリッチョ基金とエンジェル基金、Inc.によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 免疫蛍光分析用抗体 | |||
| anti-IBA1ウサギ抗体 | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350希釈抗 |
| P2RY12ウサギ抗体 | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50希釈抗 |
| TMEM119ウサギ抗体 | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 |
| 希釈ウェスタンブロット分析用抗体 | |||
| anti-&β;-Tubulinウサギ抗体 | Abcam | ab6046 | 1:500 |
| 抗Synaptophysin(SYP)ウサギ抗体 | Abclonal | A6344 | 1:1,000 |
| 抗PSD95マウス抗体 | ミリポア | MAB1596 | 1:500 |
| <ストロング>ホウ酸バッファー成分 | |||
| ホウ酸 (100 mM) | シグマ | B6768 | |
| 重炭酸ナトリウム (NaHCO<サブ>3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| 塩化ナトリウム (75 mM) | シグマ | S7653 | |
| 四ホウ酸ナトリウム (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| 細胞培養材料 | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm セルストレーナー | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm組織培養処理 | CELLTREAT | 229620 | |
| セルリフター、ダブルエンド、フラットブレード &ナローブレード、滅菌 | CELLTREAT | 229305 | |
| 低接着性 丸底 96 ウェルプレート | Corning | 7007 | |
| Primaria 24 ウェル平底表面改変マルチウェル細胞培養プレート | Corning | 353847,Primaria | |
| 6 ウェル セルクリア フラットボトム表面改変マルチウェル培養プレート | Corning | 353846 | |
| Primaria 96 ウェル クリアフラット底面 Corning | 353872 | ||
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | 低 | 運動ニューロン分化に使用される | 25058CI |
| TrypLE試薬 | Life Technologies | 12-605-010 | ミクログリア分化に使用される解離試薬 |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFRメンブレンマトリックス | コーニング™ | 354230 | 細胞外マトリックスコーティング試薬 |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | ラミニン 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | ホウ酸緩衝液中で0.1 mg/mLに再構成 |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | ホウ酸バッファー |
| <ストロング> iPSC培地 | |||
| mTeSR Plusキット | STEMCELLテクノロジー | 100-0276 | iPSC培地混合した成分を |
| EB培地> | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | 最終濃度 50 ng/mL |
| iPSC 培地 | 最終濃度 1x | ||
| ROCK阻害剤Y27632 | フィッシャーサイエンティフィック | BD 562822 | 最終濃度10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | 最終濃度 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | 最終濃度 50 ng/mL |
| PMP ベース培地 | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | 最終濃度 1x |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) | の成分Gibco | 15140122 | 最終濃度 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | ロンザ | 12001-988 | 最終濃度 1x |
| PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 最終濃度 55 & マイクロ;M |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | 最終濃度 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | 最終濃度 100 ng/mL |
| PMP ベース培地 | 最終濃度 1x | ||
| iMG ベース培地の成分 | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 最終濃度12634010 1x | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | 最終濃度 1x |
| N2 サプリメント、100x | Gibco | 17502-048 | 最終濃度 1x |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | 最終濃度 100 U/mL |
| iMG complete media | |||
| 55 mM 2-メルカプトエタノール | Gibco | 21985023 | 最終濃度 55 &M |
| IL-34 | PeproTech または Biologend | 200-34 または 577904 | 最終濃度 100 ng/mL |
| iMG ベース培地 | 最終濃度 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | 最終濃度 5 ng/mL |
| TGF-&β; | PeproTech | 100-21 | 最終濃度 50 ng/mL |
| > | |||
| HEPES | Gibco | 11330032 | 最終濃度 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | 最終濃度 1x |
| N2 サプリメント、100x | Gibco | 17502-048 | 最終濃度濃度 1x |
| 非必須アミノ酸 (NEAA)、100x | Gibco | 11140050 | 最終濃度 1x |
| >>< | |||
| E | Calbiochem | 565790 | 最終濃度 0.2 μMおよびストック試薬を1:1エタノールおよびDMSO |
| ドキシサイクリン | Sigma | D9891 | 最終濃度2 &muで2 mMに再構成します。g/mL およびストック試薬を DPBS |
| Induction base 培地 | 最終濃度 1x | ||
| ROCK 阻害剤 Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | 最終濃度 10 μニューロン |
| の MComponents of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | 最終濃度 1x 培地およびサプリメント用 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | 最終濃度 1x |
| N2 サプリメント、100x | Gibco | 17502-048 | 最終濃度 1x |
| 非必須アミノ酸 (NEAA)、100x | Gibco | 11140050 | 最終濃度 1x |
| iPSC ライン この研究で使用 | |||
| KOLF2.1J: WT クローン B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | ナプトソームの単離のための細胞溶解試薬 |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready試薬 | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo レッド スクシンイミジルエステル | サーモフィッシャーサイエンティフィ | P36600 | pH感受性色素 |
| <強>その他の細胞培養試薬 | |||
| トリパンブルー、0.4% 溶液 | AMRESCO | INC K940-100ML | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | シグマ | 22144-77-0 | |
| BrdU | シグマ | B9285 | 滅菌水中で 40 mM に再構成 |
| カラシン D | シグマ | 最終濃度 10 & マイクロ; | |
| カルシウムとマグネシウムを含むM DPBS | コーニング | 21-030-CV | |
| カルシウムとマグネシウムを含まないDPBS | コーニング | 21-031-CV | DPBS |
| ノックアウトと呼ばれる DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | ヒト胚性および誘導多能性幹細胞の増殖に最適化されたDMEM-F12 |
| ミニンマウスタンパク質、天然 | Gibco | 23017015 | ラミニン |
| <ストロング>ソフトウェアおよび機器 | |||
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | モデル 5810R | |
| Cytation 5 ライブセルイメージングリーダー | Biotek | ||
| Gen5 マイクロプレート リーダーおよびイメージャー ソフトウェア | Biotek | バージョン 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | チューブ シェーカー | |
| ウォーター ソニケーター | エルマ | モード トランスソニック 310 |
参考文献
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G.
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