方法論記事

人工心臓組織のデータ取得とモデルスループットを向上させるバイオリアクターの設計

DOI：

10.3791/64368

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2023年6月2日

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1Cardiovascular Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

この記事について

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サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

幹細胞由来の心筋細胞を用いてバイオエンジニアリングされた3次元心臓組織は、健康なヒト心筋と病気のヒト心筋を in vitro で研究するための有望なモデルとして浮上し、天然の心臓ニッチの重要な側面を再現しています。この原稿では、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞から生成されたハイコンテント人工心臓組織を作製および分析するためのプロトコルについて説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心不全は依然として世界の主要な死因であり、ヒトの心臓のより優れた前臨床モデルが急務となっています。組織工学は、基礎科学の心臓研究に不可欠です。 in vitro でのヒト細胞培養では、動物モデルの種間の違いが排除されますが、より組織に似た3D環境(細胞外マトリックスやヘテロ細胞カップリングなど)では、プラスチック製のペトリ皿での従来の2次元培養よりもin vivo 条件をシミュレートできます。ただし、各モデルシステムには、カスタム設計のバイオリアクターや機能評価デバイスなど、特殊な機器が必要です。さらに、これらのプロトコルはしばしば複雑で労働集約的であり、小さくて繊細な組織の障害に悩まされています。

この論文では、組織機能の縦断的測定のために人工多能性幹細胞由来心筋細胞を使用して、堅牢なヒト人工心臓組織(hECT)モデルシステムを生成するプロセスについて説明します。直線的なストリップ形状の6つのhECTを並行して培養し、各hECTはPDMSラックに取り付けられた一対の力感知ポリジメチルシロキサン(PDMS)ポストから吊り下げられます。各ポストは、使いやすさ、スループット、組織保持、データ品質を向上させる新機能である黒色のPDMS安定ポストトラッカー(SPoT)で覆われています。この形状により、ポストのたわみを確実に光学的に追跡でき、絶対的な能動的および受動的張力による痙攣力の追跡が改善されます。キャップ形状により、hECTがポストから滑り落ちることによる組織障害が排除され、PDMSラック製造後の第2ステップが含まれるため、バイオリアクター製造プロセスに大きな変更を加えることなく、SPoTを既存のPDMSポストベースの設計に追加できます。

このシステムは、生理学的温度でhECT機能を測定することの重要性を実証するために使用され、データ取得中に安定した組織機能を示します。要約すると、主要な生理学的条件を再現して、 in vitro アプリケーション用に設計された心臓組織の生体忠実度、効率、および厳密性を向上させる最先端のモデルシステムについて説明します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人工心臓組織モデルは、従来の2次元細胞培養では実現が困難であった在来の心臓ニッチのさまざまな側面を再現するために、さまざまな形状と構成で提供されます。最も一般的な構成の1つは、組織の自己組織化を誘導し、定義されたプリロードと結果として生じるけいれん力の読み出しを組織に与えるために、両端に柔軟なアンカーを備えた線形組織ストリップです1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21
、22、23、24、25、26、27。発生する力は、組織の短縮の光学追跡と、アンカー1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11の測定されたたわみとばね定数から力を計算する弾性ビーム理論を使用して、ロバストに決定することができます。12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、25、26、28。

しかし、心臓組織工学はまだ発展途上の分野であり、いくつかの課題が残っています。カスタムメイドのバイオリアクターや機能評価装置などの専用機器は、各モデルシステム10,29,30,31に必要です。これらのコンストラクトの微小環境のサイズと複雑さは、多くの場合、労働集約的なプロトコル、多数の細胞、および組織の脆弱性による低スループットによって制限されます。これに対処するために、一部のグループは、創薬に役立つハイスループットアッセイを容易にするために、数百または数千の細胞のみを含む微小組織の作製に目を向けています。しかし、この縮小されたスケールは、機能12の正確な評価を複雑にし、本来の心臓ニッチの重要な側面(栄養素/酸素拡散勾配や複雑な構造36など)を排除し、その後の分子および構造分析に利用できる材料の量を制限します(多くの場合、組織のプールが必要です)。表1は、文献1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15における線状組織ストリップモデルの構成のいくつかを要約したものである。16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、37、38、39、40。

群組織あたりの細胞数プレートあたりの組織数プレートフォーマットアンカー機能機能データ取得方式共有メディアバス?機能測定-
その場で?
吉田 (ECT)38400万人6修正型6ウェルプレート*力変換器直接力測定いいえいいえ
チャン(hESC-CM-ECT)26310キロメートル6カスタム6ウェルディッシュPDMSの投稿直接力測定はいいいえ
ファインバーグ (dyn-EHT)16150万人6カスタム6ウェルディッシュPDMSワイヤー組織形状いいえはい
RADISIC (BioWire)39, 40110キロメートル競走8ポリマーワイヤーワイヤー形状はいはい
肋骨(単一のhECT)1、21-200万4**10cmシャーレ**PDMSの投稿光学偏向(エッジ/オブジェクトトラッキング)はいはい
肋骨(multi-hECT)3–9500 k-100万66cmシャーレPDMSの投稿光学偏向(エッジ/オブジェクトトラッキング)はいはい
コスタ(マルチhECT W/ SPoT)100万人66cmシャーレ黒いキャップのPDMSポスト光学偏向(オブジェクトトラッキング)はいはい
パッシエ(EHT)17245キロメートル3612ウェルプレート黒いキャップのPDMSポスト光学偏向(オブジェクトトラッキング)はいはい
ヴンジャク-ノヴァコビッチ13, 18100万人126cmシャーレキャップ付きPDMSポスト光学偏向(エッジ検出)はいはい
Vunjak-Novakovic (ミリピラー)14550キロメートル6カスタム6ウェルディッシュキャップ付きPDMSポスト光学偏向(物体追跡);カルシウムイメージングいいえはい
エッシェンハーゲン (EHT)10, 19–21100万人1212ウェルプレートキャップ付きPDMSポスト光学的偏向(ポストたわみのエッジ検出);カルシウムイメージングいいえはい
ザンドストラ(CaMiRi)2225〜150キロメートル9696ウェルプレートフック付きのPDMSポスト光学偏向(エッジ検出)いいえはい
マリー23、24900キロ2424ウェルプレートキャップ付きPDMSポスト、一体型マグネット磁気センサーいいえはい
ドイツ (μTUG)11, 12, 25未定義156156ウェルディッシュキャップ付きPDMSポスト、一体型マグネット光学トラッキング(蛍光ビーズ)はいはい

表1:文献中のいくつかの線形工学心臓組織モデルの特徴。 線形工学的心臓組織モデルは、サイズ、スループット、アンカー機能の設計、共有培地浴の容易化、および機能特性評価のための個別の筋浴システムの要件が異なります。*研究者は、標準的な6ウェルプレートの寸法に基づいて、市販の人工組織システムを使用しました。** 単一組織バイオリアクターを任意のプラスチック培養皿に所望の数と位置で固定するモジュラーシステム。

この論文では、線形ヒト工学心臓組織(hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27の確立されたモデルを作製するための最新のプロトコルについて説明しますhECT収縮機能を評価する方法。各マルチティッシュバイオリアクターは、共有培地に最大6台のhECTを収容し、硬質ポリスルホンフレームに取り付けられたシリコーンエラストマーポリジメチルシロキサン(PDMS)製の2つの「ラック」ピースで構成されています。各PDMSラックには、直径0.5 mm、長さ3.25 mmの柔軟な統合型フォースセンシングポストが6つ含まれており、2つのラックには6組のポストがあり、それぞれが1つのhECTを保持します。バイオリアクターの反転は、培地からの結露や空気と液体界面のメニスカスによる歪みによる下からのhECTの可視化の障害を克服するのに役立ちます。hECTが収縮するたびに、統合されたエンドポストのたわみが発生し、たわみ信号の光学的測定は、hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27の収縮機能を表す力対時間追跡に処理されます.このサイズの組織に通常使用される単一組織バイオリアクターと比較して、マルチティッシュデザインは実験スループットを向上させ、潜在的に異なる細胞組成の隣接する組織間のパラクリンシグナル伝達の研究を可能にします。このシステムは、疾患モデリング4,8、パラクリンシグナル伝達6,7、ヘテロ細胞培養5,9、および治療スクリーニング7,9への応用を説明する発表された研究で検証されています。

このシステムでは、hECTは長さ約6mm、直径0.5mmに設計されており、低ノイズで力測定の堅牢な光学的追跡を容易にします。さらに、拡散勾配や細胞組織などの組織の複雑さの側面は、組織あたり100万個の細胞という管理可能な要件とバランスが取れています。標準的なCCDカメラ技術では、1μNという弱い力(たわみ後5μm未満を表す)で明確な信号を生成するため、一部のhECT疾患モデルで観察されるような非常に弱い収縮機能でも正確に測定できます。これにより、痙攣力曲線の詳細な分析も容易になり、したがって、発達力、収縮率(+dF/dt)および弛緩率(−dF/dt)、および拍動率変動を含む、最大16の収縮性指標41のハイコンテント分析が可能になる。

このプロトコルは、バイオリアクターコンポーネントを製造するための指示から始まります。hECT収量を最大化し、組織機能の技術的変動性を低減し、組織評価の質と深さを最適化するためのステップに特別な注意が払われています。ほとんどの心臓組織工学研究は、製造および長期検査中の組織損失率を報告していませんが、これはこの分野ではよく知られた課題であり、研究のスループットと効率を低下させます27。ここで説明する組織工学的手法は、(PDMSラックの製造方法に関係なく)ほとんどのバイオリアクターですべてのhECTを確実に保持するために、長年にわたって改良されてきました。しかしながら、組織の5%〜20%の損失でさえ、特に利用可能な心筋細胞の数によって制限される小規模な実験において(例えば、いくつかの疾患細胞株4 の分化の課題のため、または市販の心筋細胞の高コストのために)、または治療条件(例えば、様々な治療化合物の限られた入手可能性または高コスト)によって、統計的検出力に大きく影響し得る。

このプロトコルは、hECTを保持する力感知ポストの端部でキャップとして機能するPDMSラックの新機能である安定したポストトラッカー(SPoT)の製造について説明します27。キャップ形状により、ポストの落下や引き抜きによるhECTの損失が大幅に減少し、キャップのないポストでの培養が困難な、より多様な剛性と張力を持つhECTを培養するための新しい機会が開かれることが実証されています。さらに、SPoTは、一貫性のある明確に定義された形状27を通じて、hECT収縮の光学的追跡を改善するための高コントラストの物体を提供する。これに続いて、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の培養と、以前に発表されたプロトコル3,42,43に基づく心筋細胞の分化、およびhECTの作製、培養、および機能測定の説明が続きます。

この記事では、生理学的温度で組織機能を測定する必要性についても説明します。ヒト心筋(胎児および成人の健康および罹患組織)、および広範囲の動物種(ラット、ネコ、マウス、フェレット、ウサギを含む)の心臓組織44,45は、生理学的温度と比較して28°C-32°Cの温度で周波数整合痙攣力の著しい増加を示します-低体温異方性45として知られる現象、46。しかし、人工心筋組織機能に対する温度の影響は、まだ十分に研究されていません。文献にある最近の人工心臓組織モデルの多くは、生理学的条件を近似するために37°Cで機能的に評価されるように設計されています13,14,37。しかし、私たちの知る限り、人工心臓組織によって生成される力に対する温度依存的な影響は体系的に調査されていません。このプロトコルは、試験中の熱損失を最小限に抑え、無菌性を損なうことなくhECTを生理学的温度に維持できる機能測定用のセットアップに絶縁発熱体を組み込むことを可能にするペーシング電極設計について説明しています27。次に、発達力、自発拍数、+dF/dt、-dF/dtなど、hECT機能に観測された温度の影響のいくつかを報告します。全体として、この論文は、ヒトで操作された心臓組織を作製し、それらの収縮機能を評価するために、この多組織力感知バイオリアクターシステムを製造するために必要な詳細を提供し、室温および37°Cでの測定の比較の基礎を提供する一連のデータを提示します27。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、匿名化されたiPS細胞株であるSkiPS 31.3(元々は健康な45歳男性の真皮線維芽細胞を用いて再プログラムされた)47を使用し、したがって、同機関のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従って、特定の治験審査委員会の承認を免除された。すべての細胞およびhECT操作は、HEPAフィルター付きクラスII生物学的安全キャビネットまたは層流作業台で無菌状態で行います。すべての非滅菌溶液を0.22 μmフィルターでろ過して滅菌し、すべての細胞とhECTをインキュベーター内で37°C、相対湿度95%、CO25%に維持します。

1. バイオリアクターの作製

  1. バイオリアクター部品とアルミニウムマスターキャスト製造
    注: コンピュータ支援設計 (CAD) ファイルは、 補足ファイル 1 で提供されています。 プロトコルは、これらのステップの間の任意の場所で一時停止できます。高い公差(≤5 μm)と滑らかな仕上げは、正確なポスト形状とポリテトラフルオロエチレン(PTFE)ベースプレートへのポリスルホンフレームの適切な圧入(ぴったりとした摩擦フィットを目指しているが、きつすぎない)に必要であるため、このセクションで説明するマスター金型の製造には専門の機械工に依頼することをお勧めします。
    1. コンピュータ数値制御(CNC)ミルを使用して、 図1Aの回路図に従ってPTFEからベースプレートを機械加工します。hECTは、等間隔に並んだ6つのウェル(白い矢印)に形成されます。
    2. CNCミルを使用して、 図1Bの回路図に従って、3つのフレームサポート(緑色のアスタリスク)を使用して、アルミニウムから鋳造されたポリジメチルシロキサン(PDMS)ラックネガティブマスターを加工します。PDMSポストを作成するために、直径0.5mmの6つの等間隔の穴(マゼンタの矢印)をドリルで開けます。
    3. CNCミルを使用して、 図1Cの回路図に従って、バイオリアクターフレームをポリスルホンから機械加工します。フレーム・サポート(緑色のアスタリスク)は、ラック・キャストに見られるフレーム・サポート(図1B、緑色のアスタリスク)に対応しています。
    4. CNCミルを使用して、 図1Dの回路図に従って、アルミニウムからアルミニウム鋳造ホルダーを機械加工します。各スロットには、高さ0.25 mmの三角形の棚(オレンジ色の三角形)があり、PDMSラックキャストの穴にPDMSが流れるデッドスペースを提供します(図1B、マゼンタの矢印)。
  2. アルミニウムネガマスターからのPDMSラックの鋳造
    1. 熱可塑性溶融堆積モデリング3Dプリンターを使用して、PDMSラック鋳造装置ブラケット2個をプリントします(補足ファイル1)。次のプリント設定を使用します:レイヤーの高さ0.1mm、壁/底/上部の厚さ1mm、三角形のインフィル密度90%、プリント温度230°C、ビルドプレート温度70°C、接着用ブリム。
    2. 4つのアルミニウムネガティブマスターキャストをキャストホルダー(図2AI)に配置し、支柱の穴が三角形の棚の反対側のデッドスペースに揃うようにします( 図1Dを参照)。液体PDMSの漏れを防ぐために、ガスケットとして厚さ0.5mmのシリコンシート(図2B、白い矢印)の長方形のピースで装置を包み、スクリュークランプを使用して2つの平行な3Dプリントブラケットの間にクランプします。
    3. 浅い容器にPDMS硬化剤0.5mLとPDMSエラストマーベース5mL(メーカーの指示による1:10の比率)を加え、5分間激しく混合します。真空チャンバー内でPDMS混合物を脱気し、室温で20〜60分間、または気泡が消えるまで強力な真空(0.1〜1 kPa)を適用します。
    4. PDMS混合物を鋳造装置に注ぎ、各スロットを完全に覆うようにオーバーフィルします(図2AII)。必要に応じて、PDMSラックの本体(図2AII)、支柱のある側(図2B)の反対側に小さな色付きガラスビーズを追加して、各PDMSラックを一意に識別できるようにします。鋳造装置を真空チャンバーに戻し(水平に水平であることを確認してください)、少なくとも12時間強力な真空を適用します。PDMSを埃から離して室温で約48時間硬化させ、デリケートな支柱の完全な硬化と最大の強度を可能にします。オーブンを使用すると、3Dプリントされたコンポーネントが歪むため、使用しないでください。
      注: プロトコルはここで一時停止できます。
  3. アルミニウムネガマスターキャストからのPDMSラックの取り外し
    1. クランプ、ブラケット、シリコンシートを鋳造装置から取り外します。ステンレス鋼のかみそりの刃を使用して、鋳造装置とフレームサポートの上部にあるPDMSフィルムを切り取り、指を使ってPDMSラックをキャストホルダーの側面からそっと分離します。鈍いステンレス鋼のかみそりの刃をキャストとキャストホルダーの間のデッドスペースに挿入し、こじ開けて(図2CI、II)、デッドスペースを埋めるPDMSがキャストホルダーに残るようにします(これはポストに取り付けられているため)。鋭利なステンレス鋼の刃を使用して、残りのPDMSフィルムを切り取り、支柱の先端からデッドスペースPDMSを切り取ります(図2C III-V)。
    2. 重要な手順: PDMSラックをキャストから外します(図2D)。支柱の反対側から始めて、指を使ってPDMSラックをキャストからゆっくりと離し、支柱からマスターキャストがなくなるまで反対側で作業します。
    3. すべての PDMS ラックとすべての支柱が解放されるまで、前の手順を繰り返します。鋭利なカミソリの刃を使用して、ラックに残っている余分な PDMS を切り取ります。その結果、PDMSラック(図2E)には、6本の支柱(オレンジ色の矢印)と識別用の色付きのビーズ(青色の矢印)が取り付けられています。
      注: プロトコルはここで一時停止できます。
  4. 安定したポストトラッカー(SPoT)の製造
    1. 熱可塑性溶融堆積モデリング3Dプリンタを使用して、SPoT鋳造装置のコンポーネントを印刷します(補足ファイル2および図3AI、II)。次のプリント設定を使用します:レイヤーの高さ0.1 mm、壁/底/上部の厚さ1 mm、三角形のインフィル密度80%、プリント温度230°C、ビルドプレート温度70°C、接着用のブリム。
    2. 3Dプリントされた部品の間、およびPDMSラックと三又治具の間にしっかりと圧入されていることを確認し、PDMSラックが曲げられずにウェルの底に届くポストにぴったりとフィットしていることを確認します。必要に応じて、プラスチックをトリミング/ヤスリで削ります。
    3. 0.5 mLの黒色PDMSパートAと0.5 mLのパートB(メーカーの指示に従って1:1の比率)を小型計量ボート(または同様の小型で浅い容器)に加え、色が均一になるまで完全に混合します。混合黒色PDMSを真空チャンバー内で20分間、強真空下で脱気する。脱気した黒いPDMSを3Dプリントしたベースに流し込んで穴を埋め、泡が残らないように叩きます。ベースから余分なPDMSをできるだけ削り取ります。
    4. 3本又の部品をベースにはめ込み、PDMSラックを3本柱の治具(図3AII、ターコイズブルーの長方形)の溝に置き、支柱の端が円形ウェルの黒いPDMSに浸るようにします(図3B、C)。黒色のPDMSを室温で硬化させ、粉塵から48時間保護します。
      注: プロトコルはここで一時停止できます。
    5. 三又をスライドさせて、支柱の張力を最小限に抑えます。小さな鉗子を使用して、各SPoTを囲む黒いPDMSの薄膜をこすり落とします。次に、先端が細かく曲がった鉗子をSPoTウェルに挿入して、3Dプリントされたベースから解放します(図3D)。
    6. SPoT(図3E)を検査し、細いVannasハサミを使用して、ステップ1.4.5で除去されなかった鋳造プロセスに残っている黒いPDMSフィルムを切り取ります。PDMSラックをポリスルホンフレームに取り付け、これを黒いベースプレートにスライドさせて、完成した支柱が正しい長さであることを確認します(図4A)。
      注: プロトコルはここで一時停止できます。
    7. PDMSラックをペアにし、フレームタブを使用してフレームに追加します(図4A)。PTFEベースプレート付きのバッグに少なくとも30分間オートクレーブを入れます(反りを減らすために<122°C)。

figure-protocol-1
図1:hECTバイオリアクターのコンポーネント。 (A)hECTを形成するための6つの等間隔のウェルを備えたPTFEベースプレートの上面図(左)と側面図(右)(白い矢印)。(B)6本の等間隔の支柱(マゼンタの矢印)とバイオリアクターフレームに取り付けるための3つの隙間(緑色のアスタリスク)を備えたPDMSラックのアルミニウムネガマスターキャストの側面図(左)と上面図(右)。(C) PDMS ラック・キャストのフレーム・サポートに対応する 3 つの等間隔のフレーム・サポート(緑色のアスタリスク)を備えた PDMS ラックのポリスルホン・フレームの側面図(左)と底面図 (右)。(D)高さ0.25 mmの三角形の棚(オレンジ色で強調表示された左端の棚)を備えた、PDMSラック鋳造用の4つのスロットを備えたアルミニウム鋳造ホルダーの上面図(上面図)と側面図(下面図)。この図はvan Neste27から修正されたものです。略語:hECT = Human Engineered Cardiac Tissue;Ø =直径;PTFE =ポリテトラフルオロエチレン;PDMS = ポリジメチルシロキサン;R = 半径。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図2:PDMSラックの製作。 (A)CADレンダリングは、鋳造装置の斜め図を示しています。(I)三角形の棚の反対側のデッドスペースに配置されたPDMSポスト(マゼンタの矢印)を形成する穴(図1D、オレンジ色の三角形)を使用して、負のPDMSラックマスターキャストをキャストホルダーの4つのスロットのそれぞれに挿入します。(ii)PDMSは、ネガティブマスターキャストの各キャビティに注がれます。(III)着色ビーズは、色分けされた識別システムとして未硬化のPDMSに添加される。(B)組み立てられたPDMSラックキャスティング装置を、3Dプリントした2つのブラケットで両側にクランプし、スクリュークランプで固定し、厚さ0.5mmのシリコンシート(白い矢印)で包んでクランプした側面を密封した写真。色付きのビーズは、支柱を形成する直径0.5mmの穴(マゼンタの矢じり)を覆わないように配置されます。(C)PDMSが硬化したら、ギプスをギプスホルダーから取り外します。(I)鈍いステンレス鋼のかみそりの刃または同様の薄い金属工具をキャストとキャストホルダーの間に挿入して、キャストホルダーからキャストをこじ開けます(II)。(III)支柱の穴を流れるPDMSによって形成されたフィルム(ターコイズブルーのブラケット)は、支柱の先端に取り付けられ、鋭利な刃(IV、V)を使用して切断する必要があります。(D)PDMSラックはキャストから分離されています。(E)識別のためにガラスビードを本体に埋め込んだPDMSラックの斜め(上)、側面(中央)、および下(下)の図を示す写真(青い矢印)。支柱の先端(オレンジ色の矢じり)には黒インクでマークされています。スケールバー = 1 cm。この図はvan Neste27から修正されたものです。略語:CAD = computer-aided design;PDMS = ポリジメチルシロキサン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図3:SPoT製造。 (A)SPoT鋳造治具の(I)ベースと(II)3本柱の部分の主要な寸法を示すCADレンダリング。円形のSPoTフォーム(AI、黒い矢印)の寸法は、深さ0.2 mm x 直径1.2 mmに設定され、それぞれが個々のSPoTの黒いPDMSを保持します。上面図に見られる11.1 mm x 27 mmの棚(AII、上面、ターコイズブルーの長方形)は、硬化中にPDMSラックを所定の位置に保持するために0.4 mm押し下げられています(下の側面図を参照)。(B)SPoT鋳造装置の組み立てを示すCADレンダリング。(C)組み立てたSPoT鋳造装置の写真。(D)PDMSが硬化した後、PDMSラックの下から三又の治具をスライドさせ、SPoTを微細な鉗子を使用してウェルから解放します。(E)SPoTなし(上)とSPoTあり(下)のPDMSラックの写真。インセットには、投稿が拡大表示されます。縮尺記号 = 1 cm (E)、2.5 cm ( E のズームイン画像)。この図はvan Neste27から修正されたものです。略語:CAD = computer-aided design;Ø =直径;PDMS = ポリジメチルシロキサン;R =半径;SPoT = 安定したポストトラッカー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

2. 細胞培養

  1. iPS細胞の培養
    注:細胞株が異なれば、継代希釈率と頻度、および/または培地添加剤の滴定の調整が必要になる場合があります。
    1. 細胞培養処理した6ウェルプレートを適格な基底膜マトリックス(メーカーの指示に従って1:1 Dulbecco's Modified Eagle Medium:Ham's F12 Nutrient Solution [DMEM/F12]で希釈)でコーティングし、プレートを37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。メーカーの指示に従ってiPS細胞培養液500mLを調製し、ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000IU/mL〜10,000μg/mL)原液5mLを加えます。
    2. iPS細胞を継代するには、ウェルから培地を吸引し、各ウェルを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄します。ウェルあたり1 mLのiPS細胞解離溶液を添加し、層流フード内で1分間インキュベートします。
    3. iPS細胞解離液を吸引し、37°C(培地なし)で5分間インキュベートします。iPS細胞培地に2 μMチアゾビビン1 mLを添加し、iPS細胞解離溶液を中和します。
    4. 2 mLの血清ピペットを使用してコロニーを約10個の細胞の塊に解離させ、iPS細胞培地中の2 μMチアゾビビンを追加1 mLでウェルに洗浄します。基底膜マトリックスで新たにコーティングしたプレートの各ウェルに2 mLの細胞懸濁液を加えます(ステップ2.1.1)。
    5. 24時間後、培地を取り出し、新しいiPS細胞培地(チアゾビビンなし)を添加します。2 mLのiPS細胞培地を48時間ごとに、または4 mLの培地を72時間ごとにiPS細胞に供給します。細胞を1:6希釈で再抹録し、3日ごと、または80%のコンフルエントに達したら継代します。
      注:細胞株が異なれば、希釈率と継代頻度の調整が必要になる場合があります。
  2. 心筋細胞の分化
    1. iPS細胞単分子膜が80%〜90%コンフルエントになったら分化を開始します。
    2. 500 mLのRoswell Park Memorial Institute 1640培地(RPMI)に、インスリンを含まないB27サプリメント10 mLとペニシリン-ストレプトマイシンストック溶液5 mLを加えて、分化培地を調製します。10 mLのB27サプリメントと5 mLのペニシリン-ストレプトマイシンストック溶液を500 mLのRPMI 1640に添加して、心筋細胞維持培地を調製します。
      注:分化培地および心筋細胞維持培地は、4°Cで最大2週間保存できます。
    3. 0日目:細胞を1 mLのDMEM/F12で洗浄し、2 mLの10 μM CHIR99021と希釈した基底膜マトリックスを分化培地に加えます。
    4. 1日目:24時間後、または細胞コンフルエントが70%未満に減少したら、細胞を1 mLのDMEM/F12で洗浄し、2 mLの分化培地を加え、48時間インキュベートします。
    5. 3〜4日目:細胞を1 mLのDMEM/F12で洗浄し、2 mLの5 μM IWR-1を分化培地に加えます。4日目に繰り返します。
    6. 5〜6日目:細胞を1 mLのDMEM/F12で洗浄し、2 mLの分化培地を加えます。6日目に繰り返します。
    7. 7〜10日目:細胞を1 mLのDMEM / F12で洗浄し、2 mLの心筋細胞維持培地を追加します。24時間ごとに繰り返します。
    8. 11+日目:培地を48〜72時間ごとに4mLの新鮮な心筋細胞維持培地と交換します。激しく鼓動する単層を傷つけないように、ゆっくりと吸引してピペットで操作します。

3. hECT培養

  1. 心筋細胞の採取
    1. 分化誘導後8〜60日でhECT製造に使用する心筋細胞単層を採取します。ウェルあたり200万〜500万個の細胞が期待できます。
      注:10日目までに細胞が叩き始めていない場合、分化が成功する可能性は低いです。激しく叩く単層は、分化に11〜15日後に剥離し、密集した組織に圧縮されることがよくあります。現時点では、そのような細胞を使用または再播種することをお勧めします。
    2. 心筋細胞の各ウェルを2 mLのPBSで2回すすぎます。室温で0.25%トリプシン-EDTAを1 mL添加します。細胞が丸みを帯び、プレートを軽く叩くと剥離するまで、37°Cで5〜10分間インキュベートします。



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結果

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上記のプロトコルに従って、心筋細胞は、以前に私たちのグループによって使用された健康なiPS細胞株から生成されました9,15、培養で8〜61日後にhECTに作製されました。図9Aは、SPoTなし(上)とSPoTあり(下)で作成されたhECTを下から見た代表的な画像を示しています。機能測定は、hECT製造後37日から52日の間に室温(23°C)および生理学的温度(36°C)で行われました。PDMSラックの製造では、経験豊富なユーザーは、6つの支柱すべてをそのままにした状態でPDMSラックで80%の歩留まり、少なくとも5本の支柱で全体で95%の歩留まり(私たちの研究室の3人のユーザーに基づく<)を期待できることを文書化しました。

SPoTは、PDMSポストの先端にうまく接着しないマーカーインクの断片化された形状(補足ビデオS2)と比較して、データ取得中に追跡するための単一の...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

文献には多数の線形改変心臓組織モデルが公開されており、その一部を表1に記載する。いくつかのモデルは、組織力の直接測定を含むが、これらは典型的には、構築物を別個の筋浴38に移すことを必要とする。ほとんどのモデルはPDMSのポスト1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16に両端で永久に固定されるティッシュと、最も一般的である設計されている

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.D.C.は、Novoheartの共同設立者兼最高科学責任者であり、持ち株会社であるMedera Biopharmaceuticalの株式を保有しています。Novoheartは、この研究の資金調達、計画、または実行に貢献していません。しかし、この研究結果は、ノボハートとメデラに経済的影響を与える可能性があります。他の著者は、競合する利害関係はないと宣言しています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、この方法に関する以前の研究について、Timothy Cashman博士に感謝しています。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)(R01-HL132226およびK01 HL133424)およびLeducq Foundation International Networks of Excellence Program(CURE-PLaN)からの資金提供を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25 mm径304ステンレス鋼線マクマスターカー6517K61 
0.25% トリプシン-EDTAGibco25200056
1.7 mL マイクロチューブAxygenMCT-175-C
10 cm 皿 (高さ 20 mm)Corning353003
10 mL 血清ピペットDrummond6-000-010
10 N NaOHFisher ScientificSS225-1希釈 1:10 滅菌蒸留水
10XモディファイドイーグルミディアムシグマアルドリッチM0275
20 - 200 μL マイクロピペットエッペンドルフ3123000055
200 μL マイクロピペットチップVWR76322-150
5 mL セロロジカルピペットDrummond6-000-005
50 mL コニカル遠心チューブFalcon352070
6 cm ペトリ皿コーニング353002
6ワット LED デュアルグースネックイルミネーターAmScope LED-6W 
6ウェルプレートコーニング353046
90度アングルミラーエドモンド・オプティクス45-594
アクリル接着接着剤SCIGRIP#4
調整可能 10 cm x 10 cm ジャッキフィッシャー・サイエンティフィック14-673-50
アルミニウム 6061マクマスター・カー9008K82
A-Plan 10X 対物レンズZEISS1020-863
オートクレーブバッグPropper21002
B-27サプリメントThermoFisher17504044
B-27サプリメント(インスリンなし)ThermoFisherA1895601
卓上遠心分離機Eppendorf5810 R
Black ABSUltimaker2.85 mm幅
牛コラーゲンIGibcoA1064401
CHIR99021Tocris4423
Class II バイオセーフティキャビネットLabconco3430009
透明アクリルシートestreetplastics1002502436厚さ 6.25 mm
CNC 縦型ミルHaasVF-1
導電性グラファイトバーMcMaster Carr1763T33
解剖顕微鏡オリンパスSZ61
ダルベッコ改変イーグル メディウム/ハム F-12 栄養ミックスサーモフィッシャー11330032
エタノール フィッシャーサイエンティフィックA4094水中で70%に希釈
EVE 自動セルカウンターNanoEntekE1000
EVE セルカウンティングスライドNanoEntekEVS-050
胎児ウシ血清ライフテクノロジー10438026
ファインカーブ鉗子ファインサイエンスツール11253-25
FormaシリーズIIウォータージャケットCO2インキュベーターサーモエレクトロンコーポレーション3110別名「インキュベーター」。HEPAクラス100フィルター付き
Fusion360ソフトウェアオートデスク別名 "CADソフトウェア"
ガラス血球計算盤ライヒェルト14750.1 mm深さ
HEPESシグマ アルドリッチH3784
hESC認定マトリゲルコーニング354277別名「基底膜マトリックス」。冷凍アリコートに保存
高速CCDカメラPixelLINKP7410
倒立顕微鏡Carl Zeiss WerkAxiovert 40 CFL10X 位相差対物レンズ
IWR-1SelleckChem S7086
LabView ソフトウェアNational Instruments2016
層流クリーンベンチNuAireNU-201-330hECT機能分析に必要
ラップトップAsusTekStrixIntel Core i&プロセッサ、CPU 2.8GHz、16GB RAM
レーザー切断機EpilogHelix 24
倍率 ヘッドセットExcelBlades70020細かい操作が必要なステップに推奨
MatlabMathworksバージョン2019b以降別名「データ分析」ソフトウェア"
Micro Vannas Scissors, 3 mm bladeWPI Instruments501839
Microscope Boom StandOlympusSZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin Stock SolutionThermoFisher1514012210,000 IU/ml ペニシリン; 10,000 μg/ml ストレプトマイシン
二価陽イオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水Sigma AldrichP3813蒸留水で1倍および10倍の濃度に希釈
ピペットコントローラーDrummond4-000-100
PixelLINK Capture OEMPixelLINK10.2.1.6別名「カメラソフトウェア」
ポリスルホンMcMaster Carr86735K73半透明琥珀色
ポリテトラフルオロエチレン(フッ素樹脂)マクマスターカー8545K176 ブラック、成形
ReLeSR幹細胞技術5872別名「iPS細胞解離培地」
ローズウェルパーク記念研究所 1640 培地サーモフィッシャー11875135
シリコーンシートSMI製造光沢、厚さ0.02、デュロメータ 40
サイズ 10/0 青、緑、赤、黄色 ガラス シードビーズマイケルの色は耐えられるはずですオートクレーブ滅菌
スパチュラフィッシャー サイエンティフィ14-373PDMS
スクエアパルス刺激装置Astro-Med / Grass TechnologiesS88X
ステンレス鋼 RazobladesGEM62-0179-CTNが低いため、非ステンレス鋼よりも好まれ
StemflexThermoFisherA3349401別名「iPSC culture media」
滅菌蒸留水ThermoFisher5230
Sylgard 170 - シリコーンエラストマー封止材 黒 0.9 kg キットダウDOWSIL 170 2LB KITAKA 黒 ポリジメチルシロキサン (黒 PDMS)
シルガード 184 - シリコーンエラストマー クリア 1 ポンド キットダウDC 184 シルガード 0.5KG 1.1LB KITAKA ポリジメチルシロキサン (PDMS)
温度制御加熱ステージOkolabH401-HG-SMU高さを 10 cm に設定
熱可塑性 3D プリンターUltimakerUltimaker 3
ThiazovivinSelleck ChemS1459
Trypan BlueNanoEntekEBT-001
真空チャンバーBel-Art PartsF42027-0000
可変速ミニバンドソーMicro-Mark82203
可変速ミニチュアドリルプレスMicro-Mark82959
振動アイソレーションテーブルLabconco3618000
ボートVWR10803-140
タロンシリンダーベンチクランプVWR97035-528AKAスクリュークランプ
のック の混合に使用  硬度ます 計量

参考文献

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 1/10/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues

to:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

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Bioreactor DesignHuman Heart ModelInduced Pluripotent Stem CellsTissue EngineeringPDMS RacksStable Post TrackerOptical TrackingForce MeasurementParacrine Signaling

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