全層軟骨欠損ラットモデルの開発と評価

Summary

このプロトコルは、ラットの大腿滑車溝に穴を開け、その後の痛みの行動と組織病理学的変化を測定することにより、全層軟骨欠損(FTCD)モデルを確立します。

Abstract

外傷による膝関節の軟骨欠損は、クリニックで一般的なスポーツ関節損傷であり、これらの欠陥は関節痛、運動障害、そして最終的には変形性膝関節症(kOA)を引き起こします。しかし、軟骨欠損やkOAに対する効果的な治療法はほとんどありません。治療薬の開発には動物モデルが重要ですが、軟骨欠損の既存のモデルは不十分です。本研究では、ラットの大腿滑車溝に穴を開けて全層軟骨欠損(FTCD)モデルを確立し、その後の疼痛行動と病理組織学的変化を読み出し実験として使用した。手術後、機械的離脱閾値が低下し、損傷部位の軟骨細胞が失われ、マトリックスメタロプロテイナーゼMMP13発現が増加し、II型コラーゲン発現が減少し、ヒト軟骨欠損で観察された病理学的変化と一致しました。この方法論は簡単で簡単に実行でき、損傷直後の肉眼的観察を可能にします。さらに、このモデルは臨床的な軟骨欠損をうまく模倣することができ、軟骨欠損の病理学的過程を研究し、対応する治療薬を開発するためのプラットフォームを提供する。

Introduction

関節軟骨は、軟骨細胞と細胞外マトリックス¹からなる高度に分化した高密度組織である。関節軟骨の表層は硝子軟骨の一種であり、表面が滑らかで、摩擦が少なく、強度と弾力性が高く、機械的ストレス耐性に^{優れています2。}細胞外マトリックスはコラーゲンプロテオグリカンと水からなり、コラーゲン全体の約90%を占めるII型コラーゲンがコラーゲン^の主成分です3。軟骨組織には血管や神経が存在しないため、損傷後の自己修復能力が不足しています⁴。したがって、外傷によって引き起こされる軟骨欠損は、診療所では常に難治性の関節疾患でした。さらに、この関節疾患は若者を襲う傾向があり、世界的な発生率は増加しています^5,6。膝関節は軟骨欠損の最も一般的な部位であり、ここでの欠損は関節痛、関節機能障害、関節軟骨変性を伴い、最終的には変形性膝関節症(kOA)^{につながります7}。膝関節の軟骨欠損は、患者に経済的および生理学的負担をもたらし、^{患者の生活の質に}深刻な影響を及ぼします8。この病気は、差し迫った解決策のない重大かつ緊急の臨床的課題をもたらします。現在、軟骨欠損の治療は手術が主力であるが、長期的な転帰は依然として満足のいくものではない^9。

臨床的な軟骨欠損は最終的にkOAにつながるため、kOA動物モデルは軟骨欠損の病理学的研究や医薬品開発に一般的に使用されています。軟骨欠損修復の病態生理学的過程を理解するためには、軟骨の再生や線維軟骨と硝子軟骨の変化を観察するために、動物モデルの確立が重要です¹⁰。しかし、前十字靭帯離断(ACLT)、内側半月板の不安定化(DMM)、卵巣摘出術(OVX)、ハルスなどの一般的に使用されるkOA動物モデルは、通常、長期的なモデリングを必要とし、病理学的および疼痛の評価のみを可能にするため、医薬品開発の効率に限界があります¹¹。手術モデルに加えて、モノヨードアセテート(MIA)やパパイン注射などの化学モデルも軟骨欠損を引き起こしますが、欠陥の程度はうまく管理できず、状態は臨床的現実からかけ離れています¹¹。衝突は、より大きな動物の軟骨欠損をモデル化するための別のアプローチですが、この方法は特定の器具の使用に依存し、めったに適用されません¹²。

要約すると、既存のkOAモデルは、軟骨欠損の病因の研究や新薬の開発には理想的ではなく、軟骨欠損の特異的で標準化されたモデルが必要です。本研究では、ラットの大腿滑車溝に穴を開けることにより、全層軟骨欠損(FTCD)モデルを確立しました。モデル評価のために肉眼的観察、疼痛行動検査、および組織病理学的分析を行った。kOAの他の動物モデルとは異なり、このモデルはラットの全身状態にほとんど影響を与えません。このモデリングアプローチはアクセスしやすく、適切に管理でき、軟骨欠損からkOAへの進行の理解と効果的な治療法の開発をサポートします。このモデルは、変形性関節前関節の欠陥を治癒することによってkOAを予防する治療法の試験にも使用できます。

Protocol

動物実験は、実験動物の使用と世話に関する中国の法律に準拠した浙江中医薬大学の医療基準および倫理委員会によって承認されました。本研究では、体重150〜180 gの6週齢の雄のSprague-Dawley(SD)ラットを使用しました。動物は商業的供給源から入手した( 材料表を参照)。

1. ラットにおける全層軟骨欠損モデルの確立

1. 新しい環境に1週間順応した後、ラットをランダムかつ均等に2つのグループに分けます(n = 8ラット/グループ)。偽グループのラットは偽手術を受け、モデルグループのラットは大腿滑車溝に穴を開ける実験手術を受けます。
   注意: ラットのつま先を保護するために、各ケージは滅菌トウモロコシの穂軸パッド( 材料の表を参照)で覆われている必要があります。
2. ペントバルビタールナトリウム(40 mg / kg)の腹腔内注射(i.p.)によってラットを麻酔します。.次に、ラットのつま先をそっと押して、適切な麻酔を確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、ラットの目に獣医軟膏を使用してください。
   注意: 動物の手術は、オートクレーブ滅菌された手術器具を使用して専用の手術室で行う必要があります。オペレーターは、手術中は清潔な白衣、フェイスマスク、ヘッドカバー、滅菌手袋を着用する必要があります。手術部位の上に滅菌パッドを置き、使用前にすべての機器を滅菌してください。手順全体を通して熱サポートを提供します。
3. ラットを仰臥位で手術台に置き、左右の後肢を剃り、手術用石鹸で膝関節領域を洗浄した後、消毒剤ポビドンヨード溶液とアルコールを無菌条件下で3回交互に投与します。ラットの上に滅菌ドレープを置き、消毒した膝関節のみを露出させます。
4. ラット膝関節の中央をメスの刃(番号11)で上から下に1cm切開し、表在解離後に膝蓋骨の内側縁に沿って関節包と大腿四頭筋腱を切断します。
   注:大腿四頭筋腱は、膝関節¹³の屈曲中に膝蓋骨と大腿骨顆に取り付けられています。関節包に見られる溝は大腿滑車溝であり、遠位大腿骨顆は内側および外側顆を形成する。
5. 膝蓋骨を外側に向け、脛骨と腓骨を90°の角度で曲げて、大腿骨顆の滑車を完全に露出させます。直径1.6 mmの円形ドリルビット( 材料表を参照)を軟骨表面に垂直に4,000 rpmで10秒間使用して、大腿骨滑車溝に深さ0.1 mmの全層軟骨欠損を1つ作成します。
   注意: 穴あけ手順中の周囲の骨組織への熱外傷を最小限に抑えるために、生理食塩水を断続的に使用してください。
6. 0.9%生理食塩水に浸した綿球で手術部位を拭き、膝蓋骨を交換し、膝を伸展位置に保ち、非吸収性の4-0縫合糸で切開部を層ごとに縫合します( 材料の表を参照)。
   1. 動物を胸骨横臥のある加熱パッドの上に置き、目覚めるまで監視してからケージに戻します。痛みを和らげるために、手術後8時間ごとにブプレノルフィン(0.05 mg / kg)を3回皮下注射します。.
7. セクション2で説明されているように、手術後3日、10日、および17日目にすべてのラットの痛みに関連する行動をテストします。

2.機械的引き出ししきい値(MWT)

注:ラットの両側後足底のMWTは、古典的なフォンフレイフィラメント疼痛測定法¹⁴によって測定されました。

1. ラットを金網のプラットフォーム上の単一のプラスチックチャンバー(17 cm x 11 cm x 13 cm)に置き( 材料表を参照)、金網のベースをテーブルの50 cm上に置きます。適応の30分後にMWTを測定します。
2. フォンフレイフィラメント( 材料表を参照)を各ラットの後足の足底面で垂直に押し、後足の中心の最も厚い部分を避けて、ブラシを約2秒間曲げます。
3. 肯定的な反応(足の撤退または足の舐め)が発生するまで、刺激の重量を最低4 gから徐々に増やします。
   注意: 各刺激の間隔は1分以上である必要があります。MWTは、5つの刺激における3つの陽性反応として定義されます。刺激の重みをグラム単位で記録します。
4. 記録された最小刺激重量(グラム単位)に従って、偽グループとモデルグループの平均値を計算します。

3. 病理組織学的・免疫組織化学的解析

1. 手術後17日目と56日目に、ラットに40 mg / kgのペントバルビタールナトリウム(i.p.)で麻酔をかけ、心臓から採血してすべてのラットを犠牲にします。大腿骨中部と脛骨中部の骨を切って膝を隔離し、周囲の筋肉組織を解剖します。組織学的分析のために膝関節を取り外します。
2. 膝関節を20 mLの10%パラホルムアルデヒド溶液に室温で48時間固定した後、20 mLの10%EDTA溶液でオービタルシェーカーで4°Cで8週間脱灰します。 EDTAソリューションは毎日交換してください。
3. 埋め込みボックスのサイズに合わせて膝関節をトリミングします。脱水した膝関節を100%パラフィン¹⁵に埋め込みます。
4. パラフィン包埋膝関節をミクロトームのホルダーに置き、角度を調整し、表面が平らになるまでパラフィンサンプルをブレードでトリミングします。
5. パラフィンスライスの厚さを3μmに設定し、40°Cの水浴中でスライスを平らにする。
6. スライスをスライドガラスに貼り付け、乾燥するまで45°Cのベーキングマシン( 材料表を参照)に入れ、室温で保管します。
7. 脱ろうと再水和:スライスを60°Cのオーブンで4時間脱ろうし、スライスを100%キシレン(3回)、100%エタノール(2回)、95%エタノール、80%エタノール、75%エタノールに5分間連続して入れます。
8. ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色
   1. スライスを脱ワックスし、再水和し、二重蒸留水で2分間洗浄します。
   2. スライスを0.5%ヘマトキシリン( 材料表を参照)で3分間染色し、スライス表面にヘマトキシリンの残留物がなくなるまでスライスを二重蒸留水で洗浄します。
   3. スライスを1%塩酸アルコールに3秒間浸し、スライスを二重蒸留水で2分間洗浄します。
   4. スライスを1%アンモニア水に10秒間浸し、スライスを二重蒸留水で2分間洗浄します。
   5. スライスをエオジン( 材料の表を参照)で1分間染色し、スライス表面にエオジンの残留物がなくなるまでスライスを二重蒸留水で洗浄します。
   6. スライスを95%エタノール、100%エタノール、100%キシレン(3回)に連続して1分間浸漬します。
   7. 各スライスに中性樹脂( 材料表を参照)を一滴加え、カバーガラスで密封します。
9. サフラニンO/ファストフリーン(SO)染色
   1. スライスを脱ワックスし、再水和し、二重蒸留水で2分間洗浄します。
   2. スライスを0.05%ファストグリーン( 材料表を参照)で3分間染色し、スライスの表面にファストグリーンの残留物がなくなるまでスライスを二重蒸留水で洗います。
   3. スライスを1%酢酸溶液に10秒間浸し、スライスを二重蒸留水で2分間洗浄します。
   4. スライスを2.5%SO( 材料表を参照)で2分間染色し、スライス表面にSO残留物がなくなるまでスライスを二重蒸留水で洗浄します。
   5. スライスを95%エタノール、100%エタノール、100%キシレン(3回)に連続して1分間浸漬します。
   6. 各スライスに中性樹脂を一滴加え、カバーガラスで密封します。
10. トルイジンブルー(TB)染色
    1. スライスを脱ワックスし、再水和し、二重蒸留水で2分間洗浄します。
    2. スライスを1%TB溶液( 材料表を参照)に2分間浸し、スライスの表面にトルイジンブルーの残留物がなくなるまでスライスを二重蒸留水で洗浄します。
    3. スライスを95%エタノール、100%エタノール、100%キシレン(3回)に連続して1分間浸漬します。
    4. 各スライスに中性樹脂を一滴加え、カバーガラスで密封します。
11. マッソン染色
    1. スライスを脱ワックスし、再水和し、二重蒸留水で2分間洗浄します。
    2. Bouin溶液( 材料表を参照)をスライスに滴下し、37°Cで2時間染色し、スライス表面の黄色が消えるまで二重蒸留水で洗浄します。
    3. スライスをセレスタイトブルー( 材料表を参照)で3分間染色し、スライス表面にセレスタイトブルーの残留物がなくなるまでスライスを二重蒸留水で洗います。
    4. スライスをヘマトキシリンで3分間染色し、スライス表面にヘマトキシリンの残留物がなくなるまで、スライスを二重蒸留水で洗浄します。
    5. スライスを酸性エタノールに5秒間浸し、スライスを二重蒸留水で2分間洗浄します。
    6. スライスをポンソーフクシン( 材料表を参照)で10分間染色し、スライス表面にポンソーフクシンの残留物がなくなるまで、スライスを二重蒸留水で洗います。
    7. スライスをリンモリブデン酸( 材料表を参照)に10分間浸し、次にTB溶液に5分間浸し、スライスの表面にTB残留物がなくなるまでスライスを二重蒸留水で洗浄します。
    8. スライスを弱酸性溶液に2分間浸し、スライスを二重蒸留水で2分間洗浄します。
    9. スライスを95%エタノール、100%エタノール、100%キシレン(3回)に1分間連続して浸します。
    10. 各スライスに中性樹脂を一滴加え、カバーガラスで密封します。
12. すべてのスライスを二重盲検設定で顕微鏡で観察し、Mankinのスコアリングシステム¹⁶に従って関節軟骨変性の程度を決定します。
13. 免疫組織化学
    1. スライスを定期的に脱ワックスして水和し、スライスをPBSで2分間洗浄します。
    2. スライスをクエン酸ナトリウム溶液に浸し、スライスを60°Cのオーブンに4時間入れて抗原を修復します。スライスをPBSで3回ずつ3分間洗います。
    3. スライスを0.3%Triton X-100溶液に10分間浸し、毎回3分間PBSでスライスを2回洗浄します。
    4. 室温で30分間メタノール中の3%H 2 O₂溶液を添加することによって内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。スライスをPBSで2回、毎回3分間洗います。
    5. 切片をPBS中の5%ヤギ血清とともに室温で30分間インキュベートして、非特異的結合をブロックします。スライスをPBSで2回、毎回3分間洗います。
    6. PBSで希釈した一次抗体(抗col1、1:50、抗col3、1:50、抗col2、1:100、抗MMP13、1:100、 材料表参照)を100 μL加え、4°Cで一晩インキュベートします。 スライスをPBSで2回、毎回3分間洗います。
    7. 各スライスを100 μLのPBS希釈(1:100)二次抗体(ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス、 材料表を参照)とともに室温で20分間インキュベートします。スライスをPBSで2回、毎回3分間洗います。
    8. 各スライスに100 μLの3,3'-ジアミノベンジジン(DAB、 材料表を参照)作業溶液を追加します。
    9. 顕微鏡下で茶色の出現時間を観察し、記録する。発色反応により、エピトープ部位が茶色^{になります17}。残りのサンプルを同じ記録された反応時間で処理します。
    10. スライスが茶色に変わったら、スライスを二重蒸留水で3分間2回洗います。
    11. スライスをヘマトキシリンで1分間再染色し、スライスを二重蒸留水で2分間洗浄します。
    12. スライスを塩酸に3秒間浸し、スライスを二重蒸留水で2分間洗浄します。
    13. スライスを1%アンモニア水に10秒間浸し、スライスを二重蒸留水で2分間洗浄します。
    14. スライスを95%エタノール、100%エタノール、100%キシレン(3回)に連続して1分間浸漬します。
    15. 各スライスに中性樹脂を一滴加え、カバーガラスで密封します。

Results

本研究では、大腿骨滑車溝に穴を開け、その後の痛み行動と組織病理学的変化を検出することにより、FTCDのラットモデルを確立しました。図1に示すように、モデリング後3日目には、偽群と比較して、モデル群のラットのMWTが有意に低下し、FTCDによる痛覚過敏が示唆された。モデリング後17日目に、モデル群のラットの機械的離脱閾値は低レベルのままであり、疼痛感作が少なくとも17日間続く可能性があることを示しています。病理組織染色の結果,偽群では関節軟骨の構造が明瞭で,軟骨表面は無傷で,軟骨細胞は均一に分布し,II型コラーゲンが高発現していた。逆にモデル群では、軟骨表面がくぼみを形成し、軟骨細胞が消失し、マトリックスメタロプロテイナーゼMMP13の発現が増加し、II型コラーゲンの発現が低下した(図2、図3)。

Discussion

この研究では、ラットの大腿滑車溝に穴を開けることによって臨床軟骨欠損を模倣するための動物モデルについて説明します(補足図1)。軟骨損傷後、末梢侵害受容器の興奮性または応答性が増強され、疼痛閾値の低下および刺激に対する応答性の増強をもたらし得る¹⁸。前臨床試験では、異なる種の動物における軟骨欠損のモデリングは常に痛みを引き起こしてきました¹⁹。臨床研究では、軟骨損傷患者の痛み視覚アナログスケール(VAS)スコアは、健康な個人のスコアよりも有意に低いことも示されています²⁰。FTCDモデルを用いてFTCD治療の効果を検証したところ、MWTの減少は一過性ではなく、短期間でMWTが迅速に回復しなかったことが示された。治療期間の後、モデル群のMWTは依然として有意であったが、治療群は緩和された(データは示されていない)。臨床効果は一般に1ヶ月の治療コースに基づいて評価されるため、数ヶ月後に回復が起こったとしても、このモデルの実験的適用には...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3, 3 '-ジアミノベンジジン	杭州正波バイオテクノロジー株式会社	ZLI-9019	IHC染色用色素
抗コラーゲンIII抗体	Novus	NB600-594	IHC
抗コラーゲンII抗体	アブカム(UK)	34712	IHC
抗コラーゲンI抗体	Novus	NB600-408	IHC
Bouin溶液	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381
Celestite blue	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	マッソン染色用コーン
コブパッド用色素	小河科技有限公司		動物用寝具
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	HE染色用色素
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	SO染色用色素
ヤギ抗マウス抗体	ZSGQ-BIO(中国、北京)	PV-9002	IHC
ヤギ抗ウサギ抗体	ZSGQ-BIO(中国、北京)	PV-9001	IHC
ヘマトキシリン	Sigma-Aldrich	H3163	HE染色用染料
Masson	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	マッソン染色用色素
マイクロドリル	Rwd Life Science Co., Ltd	78001	手術用機器
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (米国マサチューセッツ州ダンバース)	69926	IHC用一次抗体
モジュール式組織包埋センター	サーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国)	EC 350	パラフィンブロックの作製
中性樹脂	杭州正博バイオテクノロジー(株)	ZLI-9555	IHC
非吸収性縫合糸	州Huawei Medical Supplies Co.,Ltd.	4-0	手術用機器
ペントバルビタールナトリウム	杭州正波バイオテクノロジー株式会社	WBBTN5G	麻酔動物
ホスホモリブデン酸	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. (上海元業技術有限公司)	R20381	マッソン染色用染料
Ponceau fuchsin	Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.	R20381	マッソン染色用染料
ロータリーおよびスライディングミクロトーム	サーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国)	HM325	精密パラフィン切片
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	SO染色用色素
ブレード	Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.	11	手術用ク
エン酸ナトリウム溶液(20x)	Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.	HK1222	IHC
Sprague Dawley (SD) ラット	上海スレーク実験動物有限公司	SD	Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (日本)		真空浸透プロセッサー
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	The dye for TB staining
Von Frey filament	UGO Basile (Italy)	37450-275	MWTアッセイ用
装置ワイヤーメッシュプラットフォーム	上海玉燕楽器有限公司		MWTアッセイ用機器