Method Article

全層軟骨欠損ラットモデルの開発と評価

DOI:

10.3791/64475

⸱

May 19th, 2023

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1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine

In This Article

Summary

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このプロトコルは、ラットの大腿滑車溝に穴を開け、その後の痛みの行動と組織病理学的変化を測定することにより、全層軟骨欠損(FTCD)モデルを確立します。

Abstract

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外傷による膝関節の軟骨欠損は、クリニックで一般的なスポーツ関節損傷であり、これらの欠陥は関節痛、運動障害、そして最終的には変形性膝関節症(kOA)を引き起こします。しかし、軟骨欠損やkOAに対する効果的な治療法はほとんどありません。治療薬の開発には動物モデルが重要ですが、軟骨欠損の既存のモデルは不十分です。本研究では、ラットの大腿滑車溝に穴を開けて全層軟骨欠損(FTCD)モデルを確立し、その後の疼痛行動と病理組織学的変化を読み出し実験として使用した。手術後、機械的離脱閾値が低下し、損傷部位の軟骨細胞が失われ、マトリックスメタロプロテイナーゼMMP13発現が増加し、II型コラーゲン発現が減少し、ヒト軟骨欠損で観察された病理学的変化と一致しました。この方法論は簡単で簡単に実行でき、損傷直後の肉眼的観察を可能にします。さらに、このモデルは臨床的な軟骨欠損をうまく模倣することができ、軟骨欠損の病理学的過程を研究し、対応する治療薬を開発するためのプラットフォームを提供する。

Introduction

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関節軟骨は、軟骨細胞と細胞外マトリックス1からなる高度に分化した高密度組織である。関節軟骨の表層は硝子軟骨の一種であり、表面が滑らかで、摩擦が少なく、強度と弾力性が高く、機械的ストレス耐性に優れています2。細胞外マトリックスはコラーゲンプロテオグリカンと水からなり、コラーゲン全体の約90%を占めるII型コラーゲンがコラーゲンの主成分です3。軟骨組織には血管や神経が存在しないため、損傷後の自己修復能力が不足しています4。したがって、外傷によって引き起こされる軟骨欠損は、診療所では常に難治性の関節疾患でした。さらに、この関節疾患は若者を襲う傾向があり、世界的な発生率は増加しています5,6。膝関節は軟骨欠損の最も一般的な部位であり、ここでの欠損は関節痛、関節機能障害、関節軟骨変性を伴い、最終的には変形性膝関節症(kOA)につながります7。膝関節の軟骨欠損は、患者に経済的および生理学的負担をもたらし、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼします8。この病気は、差し迫った解決策のない重大かつ緊急の臨床的課題をもたらします。現在、軟骨欠損の治療は手術....

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Protocol

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動物実験は、実験動物の使用と世話に関する中国の法律に準拠した浙江中医薬大学の医療基準および倫理委員会によって承認されました。本研究では、体重150〜180 gの6週齢の雄のSprague-Dawley(SD)ラットを使用しました。動物は商業的供給源から入手した( 材料表を参照)。

1. ラットにおける全層軟骨欠損モデルの確立

  1. 新しい環境に1週間順応した後、ラットをランダムかつ均等に2つのグループに分けます(n = 8ラット/グループ)。偽グループのラットは偽手術を受け、モデルグループのラットは大腿滑車溝に穴を開ける実験手術を受けます。
    注意: ラットのつま先を保護するために、各ケージは滅菌トウモロコシの穂軸パッド( 材料の表を参照)で覆われている必要があります。
  2. ペントバルビタールナトリウム(40 mg / kg)の腹腔内注射(i.p.)によってラットを麻酔します。.次に、ラットのつま先をそっと押して、適切な麻酔を確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、ラットの目に獣医軟膏を使用してください。
    注意: 動物の手術は、オートクレーブ滅菌された手術器具を使用して専用の手術室で行う必要があります。オペレーターは、手術中は清潔な白衣、フェイスマスク、ヘッドカバー、滅菌手袋を着用する必要があります。手術部位の上に滅菌パッドを置き、使用....

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Results

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本研究では、大腿骨滑車溝に穴を開け、その後の痛み行動と組織病理学的変化を検出することにより、FTCDのラットモデルを確立しました。図1に示すように、モデリング後3日目には、偽群と比較して、モデル群のラットのMWTが有意に低下し、FTCDによる痛覚過敏が示唆された。モデリング後17日目に、モデル群のラットの機械的離脱閾値は低レベルのままであり、疼痛感作が少なくとも17日間続く可能性があることを示しています。病理組織染色の結果,偽群では関節軟骨の構造が明瞭で,軟骨表面は無傷で,軟骨細胞は均一に分布し,II型コラーゲンが高発現していた。逆にモデル群では、軟骨表面がくぼみを形成し、軟骨細胞が消失し、マトリックスメタロプロテイナーゼMMP13の発現が増加し、II型コラーゲンの発現が低下した(図2、図3)。

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Discussion

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この研究では、ラットの大腿滑車溝に穴を開けることによって臨床軟骨欠損を模倣するための動物モデルについて説明します(補足図1)。軟骨損傷後、末梢侵害受容器の興奮性または応答性が増強され、疼痛閾値の低下および刺激に対する応答性の増強をもたらし得る18。前臨床試験では、異なる種の動物における軟骨欠損のモデリングは常に痛みを引き起こしてきました19。臨床研究では、軟骨損傷患者の痛み視覚アナログスケール(VAS)スコアは、健康な個人のスコアよりも有意に低いことも示されています20。FTCDモデルを用いてFTCD治療の効果を検証したところ、MWTの減少は一過性ではなく、短期間でMWTが迅速に回復しなかったことが示された。治療期間の後、モデル群のMWTは依然として有意であったが、治療群は緩和された(データは示されていない)。臨床効果は一般に1ヶ月の治療コースに基づいて評価されるため、数ヶ月後に回復が起こったとしても、このモデルの実験的適用には.......

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Disclosures

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著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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この研究は、浙江省自然科学財団(助成金番号LQ20H270009)、中国自然科学財団(助成金番号82074464および82104890)、浙江省伝統中国医学財団(助成金番号2020ZA039、2020ZA096、および2022ZB137)、および浙江省衛生委員会の医療健康科学技術プロジェクト(助成金番号2016KYA196)の支援を受けました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3, 3 '-ジアミノベンジジン  杭州正波バイオテクノロジー株式会社ZLI-9019IHC染色用色素
抗コラーゲンIII抗体NovusNB600-594IHC
抗コラーゲンII抗体アブカム(UK)34712IHC
抗コラーゲンI抗体NovusNB600-408IHC
Bouin溶液Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381
Celestite blueShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381マッソン染色用コーン
コブパッド用色素  小河科技有限公司 動物用寝具 
EosinSigma-Aldrich861006HE染色用色素
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252SO染色用色素
ヤギ抗マウス抗体ZSGQ-BIO(中国、北京)PV-9002IHC
ヤギ抗ウサギ抗体ZSGQ-BIO(中国、北京)PV-9001IHC
ヘマトキシリンSigma-AldrichH3163HE染色用染料
MassonShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381マッソン染色用色素
マイクロドリルRwd Life Science Co., Ltd78001手術用機器
MMP13Cell Signaling Technology, Inc. (米国マサチューセッツ州ダンバース)69926IHC用一次抗体
モジュール式組織包埋センターサーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国)EC 350パラフィンブロックの作製
中性樹脂杭州正博バイオテクノロジー(株)ZLI-9555IHC
非吸収性縫合糸州Huawei Medical Supplies Co.,Ltd.4-0手術用機器
ペントバルビタールナトリウム 杭州正波バイオテクノロジー株式会社WBBTN5G麻酔動物
ホスホモリブデン酸 Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. (上海元業技術有限公司)R20381マッソン染色用染料
Ponceau fuchsinShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381マッソン染色用染料
ロータリーおよびスライディングミクロトームサーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国)HM325精密パラフィン切片
Safranin-OSigma-AldrichS2255SO染色用色素
ブレードShanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.11手術用ク
エン酸ナトリウム溶液(20x)Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.HK1222IHC
Sprague Dawley (SD) ラット 上海スレーク実験動物有限公司SDExperimental animal
Tissue-Tek VIP 5 JrSakura (日本)真空浸透プロセッサー
Toluidine BlueSigma-Aldrich89640The dye for TB staining
Von Frey filamentUGO Basile (Italy) 37450-275MWTアッセイ用
装置ワイヤーメッシュプラットフォーム 上海玉燕楽器有限公司MWTアッセイ用機器
の一次抗体 の一次抗体 の一次抗体 を染色するMasson用染料用二次抗体 用二次抗体用シール杭メスの抗原賦活化

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
  2. Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions.

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