方法論記事

マウスにおける肝部分切除後の再生肝細胞の単離

DOI：

10.3791/64493

⸱

2022年12月2日

 , 
1Swiss HPB Laboratory, Department of Visceral & Transplant Surgery, University Hospital Zurich (USZ)

この記事について

サマリー

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脂質を含んだ肝細胞は肝臓の再生に固有のものですが、通常は密度勾配遠心分離で失われます。ここでは、脂肪肝細胞を保持する最適化された細胞分離プロトコルを提示し、マウスの部分肝切除後に再生肝細胞の代表的な集団を生み出します。

要約

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部分肝切除術は、マウスの肝再生を調べるために広く使用されていますが、下流の単一細胞アプリケーションのために生存可能な肝細胞の高収率の単離は困難です。再生肝細胞内の脂質の顕著な蓄積は、マウスの正常な肝臓再生の最初の2日間に観察されます。.このいわゆる一過性再生関連脂肪症(TRAS)は一時的なものですが、主要な増殖期と部分的に重複しています。密度勾配精製は、初代肝細胞を単離するための既存のほとんどのプロトコルのバックボーンです。グラジエント精製は細胞の密度とサイズに依存するため、非脂肪性肝細胞集団と脂肪性肝細胞集団を分離します。したがって、脂肪性肝細胞はしばしば失われ、非代表的な肝細胞画分を生じる。

提示されたプロトコルは、脂質含量に関係なく、再生肝細胞の in vivo 単離のための簡単で信頼性の高い方法を記載しています。雄のC57BL / 6マウスからの肝細胞は、肝切除術の24〜48時間後に、古典的な2段階のコラゲナーゼ灌流アプローチによって単離されます。標準的な蠕動ポンプは、門脈からの流出を伴う逆行性灌流技術を使用して、カテーテル挿入された下大静脈 を介して 温められた溶液を残骸に駆動します。肝細胞は、グリッソンカプセルからの放出のためにコラゲナーゼによって解離されます。洗浄と慎重な遠心分離の後、肝細胞はあらゆる下流の分析に使用できます。結論として、この論文は、マウスの部分肝切除後の再生肝細胞の代表的な集団を単離するための簡単で再現性のある技術について説明しています。この方法は、脂肪肝疾患の研究にも役立つ可能性があります。

概要

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肝臓は、大きな組織喪失の後でもそれ自体を再生することができます。このユニークな再生能力は、1931年にヒギンズとアンダーソンによってラットで最初に記述された部分的(70%)肝切除術の実験モデルによって明示的に示されています1。このモデルでは、肝臓の70%が、より大きな肝葉を切り取ることによって動物から外科的に除去されます。その後、残りの葉は代償性肥大によって成長し、元の肝臓構造の回復はありませんが、手術後約1週間以内に元の肝塊を回復します2,3。肝臓の残骸が小さすぎて回復できない86%拡張肝切除術など、さまざまな量の組織除去を伴う追加の肝切除術が開発されており、最終的には肝切除後肝不全(PHLF)とその後の動物の30%〜50%で死亡します4,5,6。これらのモデルは、切除された組織の量に応じて、正常な肝再生と失敗した肝再生の研究を可能にします(図1)。

肝切除術のマウスモデルは長年にわたって成功裏に使用されてきましたが、最近になってようやく、より高度な分析方法が可能にな....

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プロトコル

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すべての動物実験は、スイス連邦動物規則に準拠し、チューリッヒ獣医局(n° 007/2017、156/2019)によって承認され、人間のケアが保証されました。10〜12週齢の雄C57BL / 6マウスは、食物と水に自由にアクセスできる12時間の昼/夜のサイクルで維持されました。各実験群は6〜8匹の動物から成っていた。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1.マウスの肝部分切除術

  1. 標準的な肝切除術(70%)では、左外側葉、正中葉の右側部分、および正中葉の左部分を結紮して切除します(図1B)。拡張肝切除術(86%)4の場合は、尾状葉と右前葉も切除します(図1C)。
  2. 注:標準的な肝切除術は、長年にわたって肝再生研究で使用されてきた手順です。この手順のためのプロトコルは、ミッチェルおよびウィレンブリング18のビデオ支援プロトコルを含む3,17が利用可能である。肝切除術のために....

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結果

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TRASは肝切除後16時間でピークに達し、標準的な肝切除術後32〜48時間で徐々に消失しますが、拡張肝切除術後48時間を超えて持続します。肉眼的には、TRASは肝臓の残骸の淡い顔色として容易に見え(図1F)、手術後16時間から48時間の間に肝切除マウスで観察できます。

推定最終収量は、マウスの70%肝切除後の10〜15×106 肝細胞および拡張86%肝切除後の4〜9 × 106 であり、平均最終生存率はそれぞれ78%および65%である。これは、マウス肝臓全体からの50〜70×106 の総収量と比較して予想されるパーセンテージに対応します(図6A、C)。部分肝切除後、肝細胞は正常な肝臓と比較して細胞サイズの増加を示し、脂質含有量の増加に対応します(図6B)。ゲーティング戦略を 補足図S4

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ディスカッション

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公開されたプロトコルは、FACSソーティング後の単一細胞下流分析または細胞のバルク分析のために、正常および脂肪性マウス肝細胞の高収率を単離するための信頼性が高く簡単な方法を提供します。密度勾配精製に対する明確な利点は、細胞脂質含有量が肝細胞の有効収量に本質的に影響を与えないことです。したがって、脂肪性肝細胞の割合は保持され、下流の分析に含まれます。これは、脂肪原性肝疾患の研究にとって重要であるだけでなく、肝細胞が再生の最初の2〜3日以内に時間的および空間的に動的な脂肪症を示す主要な肝切除後のプロセスの分析にとっても最も重要です。単離された肝細胞の(単一細胞)分析は、肝切除術19,20,21後にすでに実施されているが、分析された細胞集団は、少なくとも部分的に、脂質を含んだ肝細胞を奪われており、したがって、結果は完全に代表的ではなく、痩せた肝細胞に偏っていたと仮定しなければならない。

現在、TRASの.......

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開示事項

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著者は、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

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この研究は、スイス国立財団(プロジェクト助成金310030_189262)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagents
Alexa Fluor 488 Zombie greenBioLegend423111Amine-reactive viability dye
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%Provet AGQN01AB06注意:換気が必要
EDTA溶液Sigma-AldrichE8008-100ML-Ethanol
Sigma-AldrichV001229水で 70% に希釈します
シ胎児血清 (FCS)GibcoA5256701-Hanks
平衡塩溶液 (HBSS)、Ca2+、Mg2+、フェノールレッドSigma-AldrichH9269-6x600ML消化/保存用
ハンクス平衡塩溶液 (HBSS)、Ca2+、 w/o Mg2+、フェノールレッドなしSigma-AldrichH6648-6x500ML灌流緩衝液用
HEPES溶液、1 MSigma-Aldrich83264-100ML-F-Histoacryl
組織接着剤 (ブチル-2-シアノアクリレート)B. Braun1050052カニューレ挿入部位の安定化用
Hoechst 33258 染色染料溶液Abcamab228550-
リベラーゼ研究用グレードロシュ5401119001凍結乾燥コラゲナーゼ I/II
NaCl 0.9% 500 mL エコテイナーB. Braun123-Paralube
Vet 軟膏Dechra17033-211-38-
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco
A1286301-Sudan IV –脂質染色Sigma-Aldrich
V001423-Temgesic (ブプレノルフィン塩酸塩)、注射液 0.3 mg/mLIndivior Europe Ltd.345928麻薬。安全に保管してください。
トリパンブルー、0.4%、滅菌ろ過されたSigma-AldrichT8154Williamsの細胞計数用
ミディアム Eシグマ-アルドリッチW4128-500ML-
<ストロング>材料
25 mL 血清ピペット、Greiner CellstarMerckP7865-50
mL ファルコン チューブTPP-BD
ネオフロン、Pro IV カテーテル 26 GBD ファルコン391349
-セル スクレーパー、回転ブレード幅 25 mmTPP99004-Falcon
Cell Strainer 100 & マイクロ;m ナイロンBD Falcon352360-
穴あき滅菌外科用ドレープ--再利用可能な布素材
サイズ 16# チューブ用充填ノズル (内径 3.1 mm)DriftonFILLINGNOZZLE#16内に入るには
フローサイトメトリーチューブ、5 mLBD Falcon352008-
オス ルアー to バーブ、チューブ内径 3.2 mmDriftonLM41接続チューブシリンジへ
ペトリ皿、96 x 21 mmTPP93100-Prolene
5-0Ethicon8614H胸骨を引っ込める
Prolene 6-0Ethicon8695H皮膚縫合用
Prolene 8-0EthiconEH7470E結紮胆嚢
16#、WT 1.6 mm、ID 3.2 mm、OD 6.4 mmドリフトンSC0374T灌流チューブ
Equipment
BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow CytometerBD-
-Isisげっ歯類のシェーGT421-Isofluran
stationProvet-
-低速遠心分離機–Scanspeed 416Labogene-
ノイバウアー改良計数室マリエンフェルト-
酸素濃縮器 –EverFloリップス 10200070 – 5 L/min
Pipetboy –ピペッターターボ固定TPP94700-
深セン灌流ポンプ–YZ1515xシェンチェンYZ1515x-
手術用顕微鏡–SZX9Olympus-
ThermoLux温暖マットThermo Lux-
Vortex Genie 2、2700 UpMNeoLab7-0092-
ウォーターバス–Precision GP 02Thermoscientific-42°に調整します。ハ
ウ チューブチューブ バーAesculap フィ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
  2. Taub, R. Liver....

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