腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

腸オルガノイド培養は、幹細胞が一次組織の腸陰窩から単離され、ゲルマトリックスに播種される3次元(3D)ex vivoシステムです^1,2。これらの幹細胞は、自己複製、自己組織化、および^{臓器機能2}が可能です。オルガノイドは組織の微小環境を模倣しており、細胞よりも操作性は劣りますが、2次元(2D)in vitro細胞培養モデルよりもin vivoモデルに似ています^3,4。このモデルは、適切な細胞間接着の欠如、細胞-マトリックス相互作用、均質な集団など、2Dモデルで遭遇する障害を排除し、高コストや長期間を含む動物モデルの制限も軽減します⁵。腸管オルガノイド(結腸陰窩由来の幹細胞から増殖したものに対してコロノイドとも呼ばれる)は、本質的に、生体内に存在するすべての細胞型を含む上皮と内腔を含むミニ臓器です。このモデルにより、システムを操作して、幹細胞ニッチ、腸生理学、病態生理学、腸の形態形成など、腸の多くの側面を研究することができます^3,5,6。また、創薬、炎症性腸疾患(IBD)や結腸直腸癌などのヒト腸疾患の研究、患者固有の個別化治療開発、組織再生の研究のための優れたモデルを提供します4,7,8,9。さらに、オルガノイド系は、細胞コミュニケーション、薬物代謝、生存率、増殖、および刺激に対する応答を研究するためにも使用できます^7,8。動物モデルは、腸の病理学的状態の潜在的な治療法をテストするために使用できますが、一度に複数の薬物を研究することは課題となるため、非常に限られています。in vivoにはより多くの交絡変数があり、関連するコストと時間はそれぞれ高くて長いです。一方、オルガノイド培養システムは、より短い期間で一度に多くの治療薬のスクリーニングを可能にし、患者由来のオルガノイド培養の使用による個別化治療も可能にします^4,8。結腸オルガノイドが組織組織、微小環境、および機能を模倣する能力は、再生と組織修復を研究するための優れたモデルにもなります⁹。当研究室では、小腸オルガノイド培養系を確立し、クローディン-7が小腸幹細胞機能に及ぼす影響を研究しています¹⁰。この研究では、大腸オルガノイド培養システムを確立して、条件付きクローディン-7ノックアウト(cKO)モデルで幹細胞の自己複製、分化、増殖能力または能力の欠如を研究します。

クローディン-7は、腸内で高発現する非常に重要なタイトジャンクション(TJ)タンパク質であり、TJの機能と完全性を維持するために不可欠です¹¹。cKOマウスはIBD様表現型に苦しんでおり、重度の炎症、潰瘍、上皮細胞の脱落、腺腫、およびサイトカインレベルの上昇を示します^11,12。クローディンが上皮バリア機能に不可欠であることは広く受け入れられていますが、クローディンの新しい役割が浮上しています。それらは、増殖、遊走、癌の進行、および幹細胞機能に関与しています10、^{12、13、14、15}、^16、17。クローディン-7が幹細胞のニッチと結腸幹細胞の機能にどのように影響するかは現在不明です。腸は約5〜7日ごとに急速に自己更新するため、幹細胞ニッチの維持と活性幹細胞の適切な機能が不可欠です¹⁸。ここでは、結腸幹細胞ニッチに対するクローディン-7の潜在的な調節効果を調べるためのシステムが確立されています。

すべての動物実験と手順は、イーストカロライナ大学(ECU)の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所およびECUのガイドラインに準拠して実施されました。誘導性の腸特異的クローディン-7ノックアウトマウスを、C57BL6クローディン-7-フロックストランスジェニックマウスとVillin-CreERT2マウスと交配することによって作製^した19。この研究では、3ヶ月齢の雄および雌マウスを使用した。

1. 試薬・装置の準備

1. 関連する実験を開始する前に、以下の試薬/機器を冷却してください:陰窩分離中に結腸組織を洗浄するためのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)。上皮解離媒体とのインキュベーションのためのロッカー/ローテーター(4°C冷蔵庫に入れる)。
   1. ゲルマトリックス( 材料表を参照)を-20°Cから取り出し、氷上で解凍してからめっきします。
   2. 遠心分離機を4°Cに予冷してから、メッキ用の陰窩をスピンダウンします。
   3. 0.1%クエン酸ナトリウムバッファー( 材料の表を参照)を冷却し、 in situ 細胞死検出の前に氷上に保ちます。
2. 関連する実験を開始する前に、以下の試薬を温めてください:メッキする前に24時間の96ウェル培養プレート。L-WRNメディア( 材料表を参照)プレートされた陰窩に追加する前、および各メディアを変更する前。
   1. 染色する前にウォーターバスを94°Cに加熱します。

2.マウス結腸陰窩隔離

1. 以下の手順で必要なメディアを準備します。
   注:ここでは、2匹のマウスの結腸組織について培地量が計算されます。
   1. 上皮解離培地を調製する:30 mLの1x PBS + 400 μLの0.5 M EDTA + 50 μLの10 mM Y-27632二塩酸塩( 材料の表を参照)。使用するまで氷の上に保管してください。
   2. クリプト解離培地の調製:10 mLの1x PBS + 10 μLの10 mM Y-27632二塩酸塩。使用するまで氷の上に保管してください。
   3. L-WRN培地の補足:L-WRN培地50 mL + L-グルタミンを含むDMEM高グルコース47.5 mL + L-グルタミン500 μL + ペニシリン/ストレプトマイシン500 μL + B-27サプリメント1,000 μL(50x) + N2サプリメント500 μL(100x) + HEPES(1 M)緩衝液50 μL( 材料表を参照)。
   4. 完全な(補充された)L-WRN培地をろ過し、アリコートして-20°Cで最大3か月間保存します。
      注:解凍した培地は、4°Cで最大2週間安定です。
2. 暗号分離を実行します。
   1. 全身麻酔の場合は、1 mLのイソフルランを綿に加え、0.09立方フィートの麻酔室内のプラスチックカセットに入れます( 材料の表を参照)。呼吸が止まるまで(約3〜5分)マウスを麻酔室に入れ、頸椎脱臼を行います²⁰。
   2. マウスの正中線を約2回切開し、背中の皮膚を固定して腹部を露出させます。近位側から盲腸のすぐ下、遠位側から直腸の上を切断することにより、結腸を隔離する²¹。
   3. 鉗子を使用して、結腸に付着した脂肪組織を取り除きます。鉗子の平らな端を利用して糞便をそっと押し出し、組織を縦方向に切り開きます。
   4. 鉗子を使用して冷たい1x PBSで組織を10〜15回洗浄し、洗浄の合間にPBSで組織を「渦巻く」ようにします。
   5. 清潔で鋭利なはさみを使用して、組織を約3〜5 mmの大きさの小片に切ります。
   6. 2匹目のマウスに対してこのプロセスを繰り返し、冷たい上皮解離培地を含む50 mLチューブで組織片を結合します(ステップ2.1.1)。
   7. 結腸組織片を上皮解離培地中で、穏やかに揺らしながら4°Cで90分間インキュベートします。
   8. 組織片をチューブの底に沈め、組織を破壊することなく上皮解離培地を慎重に廃棄します。冷たい1x PBSで組織を10〜15回洗浄するときに、このプロセスを繰り返します。最終洗浄中にできるだけ多くのPBSを廃棄してください。
   9. 結腸組織片を含む50 mLチューブに陰窩解離培地(ステップ2.1.2)を追加し、手で5〜10分間連続的に振とうします。
      メモ: メディアは、分離された暗号から曇っている必要があります。
   10. 細胞培養フードの下で、組織と培地を70 μmのナイロンセルストレーナー( 材料の表を参照)でろ過し、新しい50 mLチューブに入れます。
   11. 室温で200 x g で10分間遠心分離し、陰窩含有ペレットを乱すことなく上清を廃棄します。
       注:装置によっては、濾した培地を遠心分離用の15mLチューブに移すことができます。
   12. ペレットを~3-4 mLの冷たい1x PBSに再懸濁します。
   13. 単離された陰窩の10 μLを顕微鏡スライド上に一列にピペットで入れます。顕微鏡下で、10 μLあたりの陰窩濃度を推定するために、いっぱいで長い陰窩の数を数えます。
   14. 96ウェルプレートに10個のクリプト/μLをプレート化するためにスピンダウンするクリプトの適切な体積を計算します。

3.クリプトメッキ

1. 1.5 mLマイクロ遠心チューブで適量の単離された陰窩を200 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
2. ペレット化された陰窩を破壊することなく、1,000 μLのピペットを使用して上清を慎重に除去します。
3. 100 μLのゲルマトリックス(9ウェルに十分)をペレット状の陰窩とピペットに注意深く加え、気泡が発生しないようにします。
   注:ゲルマトリックスと陰窩を混合する方法の詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください。通常、9つのウェルに対して100 μLで十分です。
4. ゲルマトリックスを部分的に固化させます(~1〜2分)。
5. プレート10 μLのゲルマトリックスを予め加温した96ウェル培養プレートの各ウェル内の陰窩と混合し、ドーム形状を形成した。
   注意: ドームをウェルの中央に置きます。ゲルマトリックスがウェルの側面に広がらないように注意してください。凝固とメッキの詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください。
6. ゲルマトリックスを5%CO₂を含む37°Cのインキュベーター内で10〜20分間完全に設定します。
7. L-WRNメディアの最終的な作業ソリューションを準備します。
   1. 100 μLのペニシリン/ストレプトマイシンを10 mLアリコートのL-WRN培地に加えます(ステップ2.1.3を参照)(4°Cで2週間安定)。
   2. ペニシリン/ストレプトマイシンを含む900 μLのL-WRN培地にサプリメントを追加します:1 mg/mL EGFの0.9 μL+ 10 mM Y-27632二塩酸塩の0.9 μL。
      注:ボリュームは9つのウェルに基づいています。Y-27632二塩酸塩は、0日目(めっき時)にのみ添加されます。
8. 各ウェルに100 μLの培地を加えます。ドームを乱さないように注意してください。
9. 5%_CO2 を用いて37°Cで24時間インキュベートする。

4.文化におけるクローディン-7ノックアウトの作成

1. 陰窩がメッキ後24時間培養で正常に成長するのを待ちます。
2. 1.5 mLの微量遠心チューブに、2.7 μLの1 mmol / L 4-ヒドロキシタモキシフェン(4OH-タモキシフェン)を900 μLのL-WRN培地(最終濃度3 μmol/L)+ 0.9 μLの1 mg/mL EGFに加えます。
   注:4OH-タモキシフェンの原液は、粉末状の4OH-タモキシフェン( 材料の表を参照)を1x PBSと1 mmol / Lの濃度で混合することによって調製されます。
3. 真空吸引 によって ウェルから古い培地を取り除きます。
4. 100 μLの4OH-タモキシフェン含有培地を各ウェルに加え、クローディン-7 cKO/4OH-TAMとしてラベル付けします。
   注意: DMSOをコントロールウェルに追加する必要があります。新鮮な4OH-タモキシフェン含有培地は2日ごとに追加する必要があります。
5. 次の培地交換(~2-3日)まで37°Cでインキュベートします。

5.結腸オルガノイドの維持

注意: メディアは2〜3日ごとに交換する必要があります。12日までの文化。

1. L-WRN培地の新鮮な最終作業溶液を調製します:900 μLのL-WRN培地+ 0.9 μLの1 mg/mL EGF。
2. 真空吸引 によって ウェルから古い培地を取り除きます。ウェルに新しい培地を追加します。
   注意: ドームを乱さないように注意してください。
3. 次の培地交換まで37°Cでインキュベートします。
   注:培養物は、実験に必要な期間維持および継代することができます。本研究の培養物は通常9〜12日間維持されましたが、さらに15〜20日間継続することもできます。

6. 結腸オルガノイドの採取と包埋

1. 真空吸引 によって ウェルから古い培地を取り除きます。
2. オルガノイドを4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で1時間固定します。
   注意: PFAは有毒物質です。この試薬を使用するときは注意してください。
3. 真空吸引 によって ウェルから4%PFAを除去し、30%スクロースを4°Cで24時間加えます。
4. プラスチック金型にラベルを付け、最適な切削温度(OCT)コンパウンドで90%まで充填します(材料表を参照)。
5. 真空吸引 により ウェルから30%スクロースを除去します。10 μLの1x PBSを各ウェルに加えます。
6. ピペットチップでウェルの底をそっと引っ掻き、オルガノイドを含むドームを解離します。
7. ピペットで、解離したオルガノイドを含むPBSを取り出し、OCTを含む型に液体をロードします。
   注: OCT コンパウンドに気泡を入れないでください。
8. すべてのオルガノイドがすべてのウェルから除去されるまで、このプロセスを続けます。
9. ステンレス鋼のデュワーフラスコに、ドライアイスペレットと2-メチルブタン(ドライアイスペレットを覆うのに十分)を追加します(材料の表を参照)。
10. オルガノイド含有OCTブロックを2-メチルブタンの上にしっかりと保持して瞬間凍結させる。
11. オルガノイド含有OCTブロックは、切片化の準備ができるまで-80°Cで保管します(最大1年間保存できます)。

7.免疫蛍光

1. オルガノイド含有OCTブロックをクライオスタット( 材料表参照)を用いて5 μmの厚さで-20°Cで切片化した。
2. 各切片について、顕微鏡でオルガノイドが捕捉されたことを確認します。切片作成が完了したら、染色の準備ができるまでスライドを-80°Cで保管します(最大6か月間保存できます)。
3. スライドを10 mMクエン酸ナトリウム緩衝液中で94°Cで10分間加熱します。
   注:バッファーは、クエン酸ナトリウムを脱イオン水に溶解することによって作られます。塩酸でpHを6に調整します。
4. スライドをベンチトップで20分間冷まします。蒸留水で5分間すすいでください。
5. スライドを0.2%Triton X-100を含む染色ラック( 材料表を参照)に組み立て、100 mMグリシンで15分間インキュベートします。
6. 1x PBSでそれぞれ5分間3回すすぎます。5%ウシ血清アルブミン(BSA)で室温で45分間ブロックします。
7. クローディン-7抗マウスウサギ一次抗体²² (1%BSAで希釈)とともに4°Cで一晩インキュベートします。 1x PBSでそれぞれ10分間3回すすぎます。
8. Cy3抗ウサギ二次抗体²³ (1%BSAで希釈)とともに室温で1時間インキュベートします。1x PBSでそれぞれ10分間3回すすぎます。
9. DAPIを使用して適切な封入剤( 材料表を参照)を使用してスライドをマウントし、カバーガラスを追加します。

8.細胞死の検出

1. ウェル内のオルガノイドを4%パラホルムアルデヒドで室温で1時間固定します。1x PBSで5分間すすぎます。
2. 培養プレートを氷上で、冷たい0.1%クエン酸ナトリウムバッファー中の0.1%Triton X-100と共に2分間インキュベートします。1x PBSでそれぞれ5分間2回すすぎます。
3. in situ細胞死検出キットであるTMR Redを使用してTUNEL反応^24,25を調製します(材料の表を参照)。50 μLのTUNEL反応試薬を各ウェルに加えます。
4. 加湿雰囲気中で、暗所で37°Cで1時間インキュベートします。
   注意: 残りの手順はすべて暗闇の中で完了する必要があります。
5. 1x PBSでそれぞれ5分間3回すすぎます。1:2,500ヘキスト(1x PBSで希釈、 材料表を参照)で3分間インキュベートします。
6. 1x PBSでそれぞれ5分間3回すすぎます。TRITCフィルターを使用して、蛍光顕微鏡で画像を視覚化します( 材料表を参照)。

結腸幹細胞に対するクローディン-7の調節効果を調べるために、結腸陰窩を上記のようにマウス結腸組織から単離し、 図1Aに示した。陰窩が一次組織から単離されたら、96ウェルプレートの3Dマトリックスに播種して11日間増殖させました(図1)。正常な健康な陰窩は、2日目までに内腔を閉じてスフェロイドになり、最終的には約5日目に出芽し始め、さまざまな上皮細胞タイプを形成します(図1B)。コロノイドは11日目まで成長させ、そこでさらなる実験のために収穫しました(図1B)。培養中のクローディン-7をノックアウトするために、陰窩は24時間正常に成長することを許可された。24時間後、陰窩を3 μmol/L 4OH-タモキシフェン(TAM)で処理し、さらに10日間培養しました。新鮮な4OH-TAMを含む培地を2日毎に交換した。DMSOは、コントロールウェルのビヒクルとして使用されました。クローディン-7欠損陰窩(クローディン-7 KO)は適切なスフェロイドを形成できず、4OH-TAM処理の1日後に急速に死に始めました(図1B)。

図2A は、クローディン-7(対照)を含む通常の陰窩からのコロノイドが培養の9日間を通して進行するにつれて成功した成長を強調しています。これらの陰窩は2日目までにスフェロイドを形成し始め、5日目に出芽し始め、9日目に収穫されるまで成長と出芽を続けました(図2A)。対照的に、クローディン-7(クローディン-7 KO)を欠く陰窩は非常に急速に劣化しました(図2B)。4OH-TAMによる処理の約2〜3日後、クローディン-7 KO陰窩は健康に見えるスフェロイドを形成せず、細胞の円形の塊としてのみ現れました(図2B)。野生型マウスから単離された陰窩を4OH-TAMで処理して、タモキシフェン処理による毒性作用がないことを確認しました。これらの地下室は生き残り、正常に成長することができました。クローディン-7の欠失とクローディン-7 KOコロノイドの生存状態を調べるために、免疫染色法と in situ 細胞死検出キットを利用しました(図3)。回収したコントロールおよびcKOオルガノイドにおけるクローディン-7の免疫蛍光染色により、培養におけるクローディン-7のノックアウトの成功が確認されました(図3A)。9日目の対照コロノイドは、アポトーシスシグナルをほとんど示さなかった(図3B)。しかし、クローディン-7 KOコロノイドは高いアポトーシスを示しました(図3B)。クローディン-7がなければ、幹細胞は生存、自己複製、または分化してコロノイドを形成することができませんでした。

図1:陰窩分離とコロノイドの成長を示す概略図 。 (A)陰窩分離プロセス、3Dマトリックスでのメッキ、および収穫までの成長のグラフィック描写。(B)実験のタイムラインと、コントロールおよびクローディン-7 KO由来の陰窩におけるコロノイドの成長。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:クローディン-7欠損コロノイドは生存および成長できません 。 (A)3日目と9日目のコントロール/DMSOオルガノイドの代表的な画像。(B)3日目と9日目の4OH-TAM/cKOオルガノイドの代表的な画像、n = 10。スケールバー= 200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:クローディン-7欠損コロノイドは急速にアポトーシスを起こし ます。 (A)9日目の対照/ DMSOおよびクローディン-7 cKO / 4OH-TAMオルガノイドにおけるクローディン-7染色、n = 3。スケールバー= 250 μm。 (B)9日目の対照およびクローディン-7 cKO / 4OH-TAMコロノイドにおけるアポトーシス染色、n = 3。スケールバー= 200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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