アデノウイルスを介した形質導入を用いた天然膀胱尿路上皮における導入遺伝子の発現

サマリー

大量の組換えアデノウイルスを生成するための方法が記載されており、次いで、それを使用して天然のげっ歯類の尿路上皮を形質導入し、導入遺伝子の発現または内因性遺伝子産物のダウンレギュレーションを可能にすることができる。

要約

高抵抗バリアを形成することに加えて、腎盂、尿管、膀胱、および近位尿道の内側を覆う尿路上皮は、その環境に関する情報を感知して下にある組織に伝達し、排尿機能と行動を促進すると仮定されています。尿路上皮バリアまたはその感覚/トランスデューサー機能の破壊は、疾患につながる可能性があります。これらの複雑な事象の研究は、尿路上皮における遺伝子およびタンパク質発現を変化させるための単純な戦略の欠如によって妨げられている。ここでは、研究者が大量の高力価アデノウイルスを生成することを可能にし、それを使用してげっ歯類の尿路上皮を高効率で比較的簡単な方法で形質導入することができる方法について説明します。cDNAと低分子干渉RNAの両方をアデノウイルス形質導入を用いて発現させることができ、尿路上皮機能に対する導入遺伝子発現の影響を12時間から数日後に評価することができる。これらの方法は、マウスまたはラット動物モデルを用いた正常および異常な尿路上皮生物学の研究に広く適用できます。

概要

尿路上皮は、腎盂、尿管、膀胱、および近位尿道1を覆う特殊な上皮^です。それは3つの層で構成されています:高度に分化し分極したしばしば二核傘細胞の層であり、その頂端表面は尿に浸されています。それらの急性喪失に応答して表在性アンブレラ細胞を生じさせることができる二核トランジット増幅細胞の集団を有する中間細胞層。基底細胞の単層であり、そのサブセットは、慢性損傷に応答して尿路上皮全体を再生することができる幹細胞として機能する。アンブレラ細胞は主に、水や溶質に対する透過性の低い頂端膜(コレステロールとセレブロシドが豊富)や、高抵抗の頂端接合複合体(タイトジャンクション、アドヒアレンスジャンクション、デスモソーム、および関連するアクトミオシンリングで構成される)を含む高抵抗尿路上皮バリアの形成に関与しています¹。.傘細胞の頂端表面とその接合リングの両方が膀胱充填中に拡張し、排尿後に急速に充填前の状態に戻ります¹、²、³、^4、5。バリア機能におけるその役割に加えて、尿路上皮はまた、細胞外環境の変化を感知することを可能にする感覚およびトランスデューサー機能を有すると仮定されている(例えば、伸張)そしてメディエーター(ATP、アデノシン、アセチルコリンを含む)の放出を介してこの情報を、下皮下求心性神経突起を含む下層組織に伝達する^6,7,8。.この役割の最近の証拠は、Piezo1とPiezo2の両方の尿路上皮発現を欠くマウスで発見され、その結果、排尿機能が変化します⁹。さらに、傘細胞層でタイトジャンクション孔形成タンパク質CLDN2を過剰発現しているラットは、間質性膀胱炎の患者に見られるのと同様の炎症と痛みを発症します¹⁰。尿路上皮感覚/トランスデューサーまたはバリア機能の破壊がいくつかの膀胱障害に寄与する可能性があるという仮説が立てられています^6,11。

正常状態および疾患状態における尿路上皮の生物学のより良い理解は、研究者が内因性遺伝子発現を容易にダウンレギュレートしたり、天然組織における導入遺伝子の発現を可能にしたりすることを可能にするツールの利用可能性にかかっています。遺伝子発現をダウンレギュレートする1つのアプローチは、条件付き尿路上皮ノックアウトマウスを生成することですが、このアプローチは、フロックス対立遺伝子を持つマウスの利用可能性に依存し、労働集約的であり、完了するまでに数か月から数年かかる場合があります¹²。当然のことながら、研究者は尿路上皮をトランスフェクトまたは形質導入する技術を開発しており、これによりより短い時間スケールで結果が得られる可能性があります。トランスフェクションのための公表された方法には、カチオン性脂質¹³、アンチセンスホスホロチオ化オリゴデオキシヌクレオチド14、またはHIV TATタンパク質につなが留されたアンチセンス核酸透過性11量体ペプチド¹⁵の使用が含まれる。ただし、このプロトコルの焦点は、広範囲の細胞への遺伝子送達に効率的である十分に研究された方法論であるアデノウイルス媒介形質導入の使用にあり、多数の臨床試験でテストされており、最近では、COVID-19カプシドタンパク質をコードするcDNAをCOVID-19ワクチンの1つの変異体のレシピエントに送達するために使用されました^16。17.アデノウイルスのライフサイクル、アデノウイルスベクター、およびアデノウイルスの臨床応用のより完全な説明については、読者は参考文献¹⁷に向けられる。

尿路上皮を形質導入するためのアデノウイルスの使用における重要なマイルストーンは、N-ドデシル-β-D-マルトシド(DDM)を含む界面活性剤による短い前処理が、β-ガラクトシダーゼ¹⁸をコードするアデノウイルスによる尿路上皮の形質導入を劇的に増強したことを示したRameshらの報告でした。この原理実証研究をガイドとして、尿路上皮のアデノウイルス媒介形質導入は、RabファミリーGTPアーゼ、グアニンヌクレオチド交換因子、ミオシンモーターフラグメント、孔形成タイトジャンクション関連クローディン、およびADAM17 10、¹⁹、20、21、22を含むさまざまなタンパク質を発現するために使用されています10、^19、20、^21、22.同じアプローチが小さな干渉RNA(siRNA)を発現するように適応され、その効果は導入遺伝子²²のsiRNA耐性変異体を共発現することによって救出された。ここで説明するプロトコルには、これらの技術の要件である大量の高濃度アデノウイルスを生成するための一般的な方法、および尿路上皮で導入遺伝子を高効率で発現させるためのRameshらの方法の適応が含まれます¹⁸。

プロトコル

BSL2認証を必要とするアデノウイルスの生成を含む実験は、ピッツバーグ大学環境衛生安全局および施設内バイオセーフティ委員会の承認を受けて実施されました。アデノウイルス形質導入(ABSL2認証が必要)を含むすべての動物実験は、実験動物の人道的管理と使用に関する公衆衛生サービスポリシーおよび動物福祉法の関連するガイドライン/規制に従って、ピッツバーグ大学施設動物管理および使用委員会の承認の下で行われました。手袋、目の保護具、および適切な衣服は、組換えウイルスを含むすべての手順で着用されます。液体または固体の廃棄物は、以下に説明するように処分する必要があります。形質導入後の動物の寝具、および結果として生じる動物の死骸は、バイオハザード物質として扱われ、制度的方針に従って処分されるべきです。

1. 高力価アデノウイルスストックの調製

注:げっ歯類の膀胱の効果的な形質導入は、精製および濃縮されたウイルスストックの使用に依存し、通常はμLあたり1 x 10⁷ 〜1 x 10⁸ 感染性ウイルス粒子(IVP)です。.プロトコルのこの部分は、既存のウイルス調製物から高力価のアデノウイルスストックを生成することに焦点を当てています。すべてのステップは、滅菌試薬とツールを使用して細胞培養フードで実行する必要があります。現在使用されているアデノウイルスの利用可能な株は複製に欠陥がありますが、ほとんどの施設ではアデノウイルスと組換えDNAを使用するために承認が必要です。これには、多くの場合、アデノウイルスを産生および増幅するためのBSL2承認施設としての細胞培養室の指定が含まれます。いくつかの一般的な考慮事項には、ウイルスの生成と精製のすべての段階でのマスク、目の保護具、手袋、および適切な衣服の使用が含まれます。遠心分離を行う際、遠心分離管にしっかりとフィットするキャップがない場合は、安全キャップをお勧めします。汚染された可能性のある遠心分離機の安全キャップ、ボトル、ローターを含むすべての非使い捨て材料は、抗ウイルス溶液( 材料の表を参照)で処理され、水または70%エタノールですすがれます。液体廃棄物は、最終濃度10%(v / v)まで漂白剤を添加することによって処理されます。これらの液体廃棄物の処分は、制度上の方針によって異なります。固形廃棄物は通常、バイオハザード廃棄物として処分されます。

1. HEK293T細胞の培養
   1. HEK293T細胞の凍結バイアルを37°Cの水浴中で解凍し、5 mLピペットを使用して細胞を直径15cmの細胞培養皿に移します。25 mLのピペットを使用して、10%(v / v)ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質(DMEM-FBS-PS)を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)20 mLを皿にゆっくりと加えます。.細胞が80%-90%のコンフルエント(~2 x 10⁷細胞)に達するまで、5%(v/v)の_CO2でガス化された37°Cの細胞培養インキュベーターで細胞をインキュベートします。
   2. 真空源に取り付けられたガラスピペットを使用して、培地を吸引し、次いで25mLピペットを用いて20mLの滅菌PBS(2.7mM KCl、1.5mM_KH2PO4、136.9mM NaCl、および8.9mM Na2HPO4)をディッシュに移して細胞をリンスした。使用済みPBSを吸引し、5 mLピペットを使用して3 mLの温かい(37°C)プロテイナーゼ溶液(材料の表を参照)をディッシュに移し、細胞が剥離するまで(~3-4分)細胞培養インキュベーター内でディッシュをインキュベートします。
      注:効果的なタンパク質分解は、ディッシュをゆっくりと前後に傾けて、ディッシュのすべての部分から移動する液体への細胞の放出を探すことによって最もよく評価できます。HEK293T細胞は長時間のプロテイナーゼ処理に敏感であり、プロテイナーゼ溶液に数分以上放置すると死滅します。
   3. 10 mLピペットを使用して7 mLのDMEM-FBS-PSを剥離した細胞のディッシュに移し、同じピペットを使用して細胞と培地を吸引します。懸濁した細胞を50 mLのコニカルチューブに移し、懸濁液を低速臨床遠心分離機で200 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化します。真空源に取り付けられたガラスピペットを使用して上清を吸引します。25 mL ピペットを使用して、細胞ペレットを 15 mL の DMEM-FBS-PS に再懸濁します。
   4. 19 mLのDMEM-FBS-PSを含む15 cmディッシュ15 cmディッシュのそれぞれに1 mLの細胞懸濁液を追加します。
   5. 細胞が85%〜90%のコンフルエントに達するまで組織培養インキュベーター内で細胞を増殖させます(~3〜4日)。
2. 希釈したウイルス溶液を準備する
   1. 既存のウイルスストック(5-10 IVP/細胞)の~1.5 x 10 9から3 x^{10 9} IVPを、FBSまたは抗生物質を含まない45 mLのDMEMで満たされた50 mLコニカルチューブに追加します。
      注:低濃度のウイルス(1-5 IVP /細胞)を使用することが可能です。ただし、ウイルスの生成には時間がかかります。
3. 培養細胞をウイルスに感染させる。
   1. 真空源に取り付けられたガラスピペットを使用して、ステップ1.1.5でほぼコンフルエントな細胞から培地を吸引します。
   2. 25 mL ピペットを使用して、希釈したウイルス溶液 3.0 mL (ステップ 1.2.1 で調製) を各細胞培養皿に移します。次に、10 mLピペットを使用して、7.0 mLのDMEM培地(FBSまたは抗生物質を含まない)を各ディッシュに追加します。細胞培養インキュベーターで60分間インキュベートした後、20%(v/v)FBSと2x PSを含むDMEM10 mLを各ディッシュに加えます。
      注:15皿の1つをコントロールプレート(ウイルスを添加していない)として使用すると、次のステップでウイルス誘発性の細胞の丸みと感染細胞の死を簡単に特定できます。
   3. 細胞培養インキュベーター内で細胞の大部分が切り上げ始め、細胞の>60%が剥離するまで、細胞を2〜4日間インキュベートします。
      注:ウイルスの力価が低い場合、細胞死が発生するまでに最大1週間かかる場合があります。細胞死が1週間以内に起こらない場合は、ウイルスのより高い力価を使用してこのプロセスを繰り返す必要がある可能性があります。
4. 細胞溶解物からウイルスを回収
   1. セルスクレーパーを使用して各皿の底をこすり、付着した細胞を培地に放出します。
   2. 25 mLピペットを使用して、各細胞培養皿から培地、細胞、および細胞破片を収集し、50 mLのコニカル細胞培養チューブにプールします。
      注:リソースを節約するために、2つのディッシュの培地を1つの50 mLチューブに組み合わせることができます。
   3. 低速卓上遠心分離機を使用した遠心分離によって細胞材料をペレット化します:3,000 x gで室温で5分間。真空装置に取り付けられたガラスピペットを使用して、上清を吸引します。
   4. 10 mLピペットを使用し、粉砕と組み合わせて、得られたすべてのペレット材料を、10 mM EDTA(Tris-EDTA溶液)を含む滅菌ろ過された100 mM Tris-HCl pH 7.4の合計7 mLに固めました。プールした材料を滅菌済みの15 mL細胞培養コニカルチューブに移し、氷上に置きます。
      注:この時点で、ウイルス調製は-80°Cで無期限に凍結できます。
5. 細胞ライセートの調製
   1. 3回の凍結融解サイクルを実行して残りの細胞を破壊し、形成されたウイルス粒子をさらに遊離させます。ステップ1.4.4で、チューブを液体窒素(~30-60秒)に沈めて、プールされた材料を凍結します。チューブを37°Cのインキュベーターに入れてサンプルを急速に解凍します。サンプルを15秒間ボルテックスしてから、急速凍結解凍手順をさらに2倍繰り返します。
      注意: ウイルス溶液は水浴中で37°Cで急速に解凍できますが、温度変動によりチューブにひびが入り、ウイルス溶液が水浴に放出される可能性があるため注意が必要です。これを防ぐには、ウイルス上清を含むチューブをより大きなチューブに入れ、それを水浴にセットします。
   2. 10 mLピペットを使用して、3回凍結融解した細胞材料を超高速遠心チューブに移します。チューブ内の材料を~18,500 x gの4°C超高速遠心分離機で30分間遠心分離します。
   3. ウイルスが豊富な上清を10 mLピペットで~7 mL回収し、15 mLのコニカルチューブに移します。次のステップまでサンプルを氷上に保持します。
      注:この時点で、未精製のウイルス上清のアリコートを、新しいウイルス調製を開始するための前文として(またはバックアップとして)保持することを検討してください。このアリコートを-80°Cで保存してください。
6. 密度勾配遠心分離を使用してウイルスを分離および精製します。
   1. 12 mL PET薄肉透明超遠心チューブ( 材料表を参照)または同等のチューブでCsClの不連続グラジエントを調製します。18 Gの針を備えた3 mLシリンジを使用して、2.5 mLの1.4 g / mL CsCl溶液をチューブの底に注意深く導入し、次に新しいシリンジ/ニードルを使用して2.5 mLの1.25 g / mL CsCl溶液と層状にします。
      注意: 既存の層の上に溶液を直接落とすと、重大で不要な混合が発生します。代わりに、針の斜角部分をチューブの端に当ててから、シリンジプランジャーを非常にゆっくりと押して、溶液がチューブを満たすときに針の位置を上げます。
   2. 10 mLシリンジを使用して、同様の方法で~7 mLのウイルス上清を勾配の上にロードします。ウイルス上清とチューブの上部の間に2〜3 mmを超えるスペースがある場合は、Tris-EDTA溶液を追加して、2〜3 mmのスペースが残るまでチューブを満たします。
   3. 同様に調製したバランスチューブを作り、CsClの層を含むが、ウイルス上清の代わりにTris-EDTA溶液を使用する。
      注意: 超遠心分離機での潜在的に危険な不均衡な負荷状況を防ぐために、2つのチューブは同じ重量(および同様の密度)である必要があります。
7. 速度帯超遠心分離を使用してウイルスを分離します。
   1. ステップ1.6.2〜1.6.3で形成された勾配をSW41ローターまたは同等のバケットにロードします。バケットキャップをねじ込み、ローターを超遠心分離機(4°Cに予冷)に入れ、~150,000 x gで1時間遠心分離します。
   2. 遠心分離中は、以下のステップ1.9.1に記載のカラムを平衡化します。
8. 分離されたウイルス粒子を回収する
   1. 遠心分離ステップの最後に、ローターからバケットを慎重に取り外し、細胞培養フードでバケットキャップを取り外してから、チューブを取り外してラックに入れます。
   2. 1.25 g/mL と 1.4 g/mL の CsCl 溶液の界面に浮遊するウイルス粒子が豊富なバンド状物質を収集します。勾配の入ったチューブを細胞培養皿の下半分(こぼれた物質を捕らえる)にかざし、3 mLシリンジに取り付けられた1インチ18 Gの針を使用して、縞模様のウイルスのすぐ下でチューブに注意深く穴を開けます。ウイルスをゆっくりと吸引し、通常は~1 mLで回収します。
   3. チューブから針を外すと、勾配の残りの材料がチューブから細胞培養皿の下半分に流れ込みます(液体は有害廃棄物として処理する必要があります)。
   4. シリンジ内のウイルス溶液を氷上の滅菌微量遠心チューブに移します。
      注意: このステップでウイルスを回収するときは、針の内腔が上を向くように針を配置し、針がウイルスリッチバンドの数mm下に開きます。縞模様のウイルスの2〜3 mm上に時々観察される不適切に組み立てられたウイルスの薄い帯による汚染を避けてください( 図1Aの細い黒い矢印を参照)。
9. ゲルろ過によりサンプルからCsClを除去します。
   1. サポートスタンドにクランプしたPD-10カラム(Sephadex G-25Mを充填済み)を、10%(v/v)グリセロールを含む0.2 μm滅菌ろ過PBS50 mLで平衡化します。
      注:最初の平衡化ステップは完了するまでに2〜3時間かかり、カラムを安定させるためにメーカーが使用する防腐剤を完全に洗い流すために必要です。
   2. 洗浄液をフリット(カラム培地の上部にある白い物質の保護ディスク)の下に沈め、手順1.8で収集した精製ウイルス溶液をカラムの上部に注意深く移します。ウイルスが豊富な溶液をフリットの下に後退させてから、カラムにPBSグリセロールを充填し始めます。
      注意: フリットの1つの機能は、カラムが乾くのを防ぐことです。その結果、溶離液がカラムに添加されるまでの短い遅延が許容されます。
   3. 溶出液を12本の滅菌マイクロ遠心チューブ(フラクションあたり0.5 mL)に集めます。
10. ウイルス収量を決定します。
    1. 分光光度法を用いてピークウイルス画分を決定する。PBS中の各画分の1:100希釈液を調製し、バッファー単独の1:100希釈をブランクとして使用して、分光光度計でOD₂₆₀ を測定します。ウイルス粒子は、フラクション6付近からボイドボリュームで溶出するはずです。最高のOD₂₆₀ 測定値を含むフラクションをプールします。
    2. プールされたウイルス画分を1:100に希釈し、OD₂₆₀を再測定します。次の式を使用して、ウイルス粒子の最終濃度とプールされた画分中のIVPの数を計算します:mLあたりのウイルス粒子= OD₂₆₀ × 100(これは希釈係数を補正します)×10¹²。一般的な推定では、ウイルス粒子の1%がIVPであり、IVP / mL = OD 260 × 100 ×¹⁰ 10またはIVP / μL = OD₂₆₀ × 100 ×^{10 7}。
11. プールされたウイルス画分(5 x 10⁷ 〜1 x 10⁸ IVPを含む)を滅菌マイクロ遠心チューブまたはクライオバイアルに分注します。サンプルは-80°Cで保存してください。

2.げっ歯類の膀胱の形質導入

注:この手法を初めて使用する場合は、一度に形質転換する動物の数を2〜4匹に制限することをお勧めします。これは、特にステップ2.2の界面活性剤処理中、およびステップ2.3のウイルスインキュベーション中に、各動物の開始時間をずらすことによって達成できます。経験豊富な研究者は、一度に最大6匹の動物を形質転換することができます。

1. 膀胱をカテーテルする
   1. 雌のC57Bl/6Jマウス(通常8-10週齢、~20-25 g)または雌のSprague Dawleyラット(典型的には2-3ヶ月齢、~250 g)を、ノーズコーンを取り付けた気化器を使用して麻酔します。気化器を校正して、マウスの場合は3.0%(v / v)のイソフルラン、97%(v / v)O 2、ラットの場合は4.0%(v / v)のイソフルラン、96%(v / v)O₂を生成します。つま先のつまみに反応しないことを確認して、動物が麻酔をかけていることを確認します(通常は1〜2分後)。
   2. 動物を加熱パッドの上に置いて、動物の体温を維持します。形質導入プロトコル全体を通して動物を監視して、動物が麻酔をかけられ、この手順中に痛みを感じないことを確認します。
   3. イソフルランをマウスの場合は1.5%(v / v)、ラットの場合は2.0%(v / v)に減らし、プロトコルの期間中、動物を麻酔下に維持します。.
   4. 膀胱に空気が入らないようにするには、トランスファーピペットを使用して、IVカテーテルのプラスチックカテーテル部分( 材料の表を参照)および関連するハブに滅菌PBSを充填します。
   5. 動物を仰臥位にして、外口を70%アルコールで拭き取り、滅菌カテーテルを外口、尿道、膀胱の順に挿入します。
      1. このタスクを実行するには、細かい鉗子を使用して、外部口を形成する組織をそっとつかみ、動物から離れて垂直に伸ばします。もう一方の手を使用して、カテーテルを尿道口(膣の開口部のすぐ上の肉の山)に垂直に約3〜4 mm慎重に挿入します。次に、尿道が曲がっているため、外道に挿入されたカテーテルを動物の尾に向かって下げ、恥骨の下を通過する尿道の部分への侵入を容易にし、最終的には膀胱に入ります。
         .注:特にマウスの場合、カテーテルは長すぎる可能性があり、1.0〜1.1 cm以上を動物に挿入しないでください。さもなければ、膀胱粘膜への損傷が起こります。これを防ぐには、カテーテルの先端から~1 cm下にマークを付けてから、このマーキングを超えてカテーテルを挿入しないでください。
   6. 膀胱内の尿が漏れるのを待ちます。クレデの操作を実行して、残りの尿を取り除きます:マッサージし、下腹部の膀胱隆起をそっと押し下げます。
2. 尿路上皮を界面活性剤溶液で処理することにより、形質導入を受け入れられるようにします。
   1. PBSで満たされた滅菌1 mLシリンジをカテーテルハブに取り付けて、マウスまたはラットの膀胱を洗浄します。100 μLの滅菌PBSをマウス膀胱に注射します(またはラットの膀胱の場合は450 μL)。シリンジをカテーテルフィッティングから取り外し、PBSドレーンを許可します。必要に応じて、Credeの操作を実行して余分な膀胱液を取り除きます。
   2. 滅菌した1 mLシリンジを使用して、100 μLの0.1%(w / v)N-ドデシル-β-D-マルトシド(DDM)(PBSに溶解し、0.2 μmフィルター滅菌)をマウス膀胱に注入します。シリンジを所定の位置に残して、DDMを膀胱内に10分間保持します。ラットでは、DDMの容量は450μLに増加します。
   3. シリンジを取り外して排出させることにより、DDMを膀胱から取り外します。必要に応じて、クリードの操作を実行します。
3. 膀胱にウイルスを導入します。
   1. 滅菌1 mLシリンジをカテーテルハブに取り付け、マウスの場合は滅菌PBS100 μL、ラットの場合は450 μLで希釈したアデノウイルス(ステップ1で調製)の0.5 x 10⁷ 〜1^{x 10 8 IVP} を膀胱に注入します。ウイルス溶液が逃げないように、注射器をカテーテルに取り付けたままにします。
   2. 30分後、シリンジを取り外し、ウイルス溶液が膀胱を使い捨てパッドに排出できるようにします。残留ウイルス溶液を吸収性ワイプで拭き取り、パッドを廃棄してバイオハザード廃棄物で拭きます。
      注:グリセロールは細胞毒性があります。そのため、マウスに点滴されるウイルス溶液の最大量は5 μLに制限されています(100 μLのPBSに希釈すると、最終グリセロール濃度は~0.5%[v/v]になります)。さらに、点滴するIVPの数を増やし、ウイルスのインキュベーションを45分に延長することにより、形質導入効率を高めることができます。
   3. オプションのステップ:上記のステップ2.2.1で説明されているように、膀胱をPBSですすぐことができます。ただし、これは必須ではありません。
4. 動物が回復するのを待ちます。
   1. イソフルランの流れを止め、特に動物が集団収容されている場合は、ケージに戻す前に動物が回復して完全に移動できるようにします。.
      注:ウイルス導入 自体は 観察可能な下部尿路症状や痛みを引き起こさないため、通常、術後治療は必要ありません。ただし、コードされた導入遺伝子が有毒である場合は、施設の必要に応じて、手順後の鎮痛または抗生物質が必要になる場合があります。
5. mRNA in situハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット、または免疫蛍光⁹、^10、23などの方法を使用して^、治療後12〜72時間の導入遺伝子発現の影響を分析します(代表的な結果を参照)。

結果

ウイルスの準備
密度勾配遠心分離によるウイルス精製の一例を 図1Aに示す。ロードされた細胞物質と1.25 g / mLのCsCl層の界面に見られる淡いピンク色のバンドは、主に破壊された細胞とその破片で構成されています( 図1Aのマゼンタの矢印を参照)。ピンクがかった色は、プロトコルのステップ1.5から引き継がれた少量の培地に由来します。乳白色のバンドとして現れる目的のウイルス粒子は、1.25 g/mL CsCl溶液と1.40 g/mL CsCl溶液の界面にあります( 図1Aの黄色の矢印を参照)。濃縮されたウイルス粒子の上に2〜3 mm浮かぶ物質の帯を観察することもできます( 図1Aの細い黒い矢印を参照)。組み立てられていないウイルスや破片で構成され、IVPはほとんど含まれていないため、ウイルスサンプルを収集する際には避ける必要があります。

ディスカッション

Rameshらは、膀胱癌の治療にアデノウイルス形質導入を使用する戦略の開発に焦点を当てていました^が18、最近の報告では、正常な尿路上皮生物学/生理学および病態生理学の研究におけるこれらの技術の有用性が実証されています10,18,19,20,21。.このアプローチの重要な特徴は、以下を含む:(i)げっ歯類の膀胱壁全体において、尿路上皮のみが形質導入される10、¹⁹、²⁰、^21、22。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 mLピペット	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4488	滅菌、血清学的ピペット、個別包装
12 mL 超遠心チューブ	ThermoFisher	06-752	PET 薄壁超遠心チューブ
15 mL 円錐形遠心チューブ	Falcon (Corning)	352097	滅菌
18 G ニードル	BD	305196	18 G x 1.5 in ニードル
20 mL ピペット	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4489	滅菌血清学的ピペット、個包装
50 mL 円錐形遠心チューブ	Falcon (Corning)	352098	滅菌済み
5 mL ピペット	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4487	滅菌血清学的ピペット、個包装
Cavicide	HenrySchein	6400012	抗ウイルス液
細胞培養ディッシュ - 15 cm	Falcon (Corning)	353025	無菌、組織培養処理済み (150mm×25mmディッシュ)
細胞スクレーパー	Sarstedt	893.1832	ハンドルの長さ 24 cm、ブレードの長さ 1.7 cm
CsCl	ミリポア シグマ	C-4306	分子生物学グレード ≥ 98%
DMEM 培養培地 (高グルコース)	Gibco (ThermoFisher)	11965092	4.5 g/L グルコース + L-グルタミン + フェノールレッド
EDTA	ミリポア シグマ		EDS Bioiultra グレード ≥ 99%
ウシ胎児血清	Hyclone (Cytiva)	SH30070.03	既定義
ガラスピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-678-20A	5.75 ガラスピペット、オートクレーブ滅菌
グリセロール	ミリポア シグマ	G-5516	分子生物学グレード ≥ 99%
HEK293 細胞	ATCC	CRL-3216	HEK293T細胞は、SV40 large T-antigen Isoflurane を発現する HEK293 細胞の変異体です
	Covetrus	29405
IVカテーテル - マウス	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 in Safety IVカテーテル  放射線不透過性
IVカテーテル - ラット	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 in Safety IVカテーテル 放射線不透過
KCl	Millipore Sigma	P-9541	分子生物学グレード ≥ 99%
KH2PO4	ミリポアシグマ	P5655	細胞培養グレード  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O	ミリポアシグマ	431478	≥99.99%
NaCl	ポアシグマ	S3014	分子生物学グレード≥ 99%
N-ドデシル-&β;-D-マルトシド	ミリポアシグマ	D4641	≥複数の動物のための98%
ノーズコーン	カスタムデザインの		商業オプションには、パークランドサイエンティフィック(RES3200)
PD-10列からのものが含まれます	GE Healthcare	17-085-01	Sephadex G-25M
ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質 (100x)	Gibco (ThermoFisher)	15070063	100x 濃縮溶液
分光光度計	Eppendorf	BioPhotometer
スタンドとクランプ	フィッシャーサイエンティフィック	14-679Qと05-769-8FQ	多数のサプライヤーから入手可能
滅菌フィルターユニット	フィッシャーサイエンティフィック(Nalgene)	09-740-65B	0.2 & マイクロ;m 急流フィルターユニット (150 mL)
滅菌フィルターユニット 0.2 µm(シリンジ)	フィッシャーサイエンティフィック	SLGV004SL	ミリポアシグマミレックス0.22&マイクロ;シリンジに取り付けるmフィルターユニット
超高速遠心分離機	エッペンドルフ	5810R	エッペンドルフF34-6-38固定角ローター(12,000 rpm)
シリンジ(1 mL)	BD	309628	1 mL シリンジ Luer-lok チップ - 滅菌シ
リンジ (3 mL)	BD	309656	3 mL シリンジ スリップチップ - 滅菌
済み卓上遠心分離機(低速)	Eppendorf	5702	スイングバケットローター付き
トランスファーピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-711-9AM	ポリエチレン 3.4 mL トランスファーピペット
トリスベース	ミリポアシグマ	648310-M	分子生物学グレード
TrypLE選択プロテアーゼ溶液	Gibco (ThermoFisher)	12604013	TrypLE発現酵素 (1x)、フェノールレッドなし
超遠心分離機	ックマン・コールター	オプティマ L-80 XP	ベックマンSW41ローター付き (41,000 rpm)
気化器	ジェネラル・アネステティック・サービシズ(General Anesthetic Services, Inc.)	Tec 3	ソフルラン気化器
ボルテックス	ミキサーVWR10153-838		アナログボルテックスミキサー