リアルタイムボイドスポットアッセイ

Marianela G. Dalghi; Nicolas Montalbetti; Travis B. Wheeler; Gerard Apodaca; Marcelo D. Carattino

doi:10.3791/64621

Method Article

リアルタイムボイドスポットアッセイ

DOI:

10.3791/64621

⸱

February 10th, 2023

Marianela G. Dalghi¹ , Nicolas Montalbetti¹ , Travis B. Wheeler² , Gerard Apodaca¹ , Marcelo D. Carattino¹^,²

¹Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, ²Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、従来のボイドスポットアッセイにビデオモニタリングを組み込むことで、マウスの排尿行動を研究する新しい方法について説明します。このアプローチは、排尿イベントに関する時間的、空間的、および体積情報と、その日の明期と暗期におけるマウスの動作の詳細を提供します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

正常な排尿行動は、神経系の適切な制御下にある膀胱、尿道、および尿道括約筋の協調機能の結果です。マウスモデルにおける随意排尿行動を研究するために、研究者は、動物のケージの床に並ぶろ紙に沈着した尿斑の数と面積を測定する方法であるボイドスポットアッセイ(VSA)を開発しました。技術的には単純で安価ですが、このアッセイをエンドポイントアッセイとして使用する場合、排尿イベントの時間的分解能の欠如や、重複する尿スポットの定量化の難しさなど、制限があります。これらの制限を克服するために、リアルタイムVSA(RT-VSA)と呼ばれるビデオ監視VSAを開発し、排尿頻度を決定し、排尿量と排尿パターンを評価し、その日の暗期と明期の両方で6時間の時間枠で測定を行うことができます。このレポートに記載されている方法は、健康状態および疾患状態における自発的排尿の生理学的および神経行動学的側面を調査するさまざまなマウスベースの研究に適用できます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尿の貯蔵と排尿は、骨盤神経と下腹部神経を介して膀胱充満状態に関する情報を受け取る中枢回路(中枢神経系)によって調整されます。尿路上皮は、尿路を腎盂から近位尿道まで裏打ちする上皮であり、尿中に存在する代謝老廃物や病原体に対する強固な障壁を形成します。これは感覚網の不可欠なコンポーネントであり、膀胱の充満状態を感知して下にある組織や求心性神経に伝えます^1,2。尿路上皮関門の破壊、または尿路上皮メカノトランスダクション経路の変化は、頻度、切迫感、夜間頻尿、失禁などの下部尿路症状とともに排尿機能障害を引き起こす可能性があります^3,4,5,6,7。同様に、老化、糖尿病、下部尿路感染症、間質性膀胱炎、および膀胱に影響を及ぼす他の疾患プロセス、またはその機能を制御する関連回路は、膀胱機能障害を引き起こすことが知られている⁸、⁹^、¹⁰、11、12....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尿路上皮ピエゾ1/2ダブルノックアウトマウス(Pz1/2-KO、遺伝子型:ピエゾ1 fl^/fl;ピエゾ2 fl^/fl;Upk2^CRE+/-)およびコントロール(Pz1 / 2-C、遺伝子型:ピエゾ1 fl^{/ fl};ピエゾ2 fl^/fl;Upk2^CRE-/-)は、ジャックス研究所から得られた親株(Piezo1 fl^/fl株#029213;ピエゾ2^{fl / fl}ひずみ#027720;Upk2^CRE+/-株#029281)。雌(1.5〜3ヶ月齢、体重17〜20g)と雄(2〜4ヶ月齢、体重23〜29g)の両方のマウスを実験に使用しました。シクロホスファミド誘発性膀胱炎の実験には、野生型C57Bl/6J雌(生後3ヶ月、体重~20g)を用いた(ジャクソン研究所、株#000664)。動物は収容され、実験はピッツバーグ大学施設動物管理使用委員会の承認の下でピッツバーグ大学動物管理施設で実施されました。すべての動物実験は、実験動物の人道的管理および使用に関する公衆衛生サービスポリシーおよび動物福祉法の関連するガイドラインおよび規制に従って実施されました。

1. リアルタイムボイドス....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尿路上皮 ピエゾ1/2 ノックアウトマウスの排尿行動

排尿サイクルの貯蔵段階では、尿路上皮は、膀胱に蓄積された尿によって加えられる張力を感知し、この機械的刺激を漿膜ATP放出などの細胞応答に変換すると仮定されます^1,3。我々は以前に、機械的に活性化されたPIEZO1およびPIEZO2チャネルがマウス尿路上皮^3,36で発現されることを示した。尿路上皮PIEZOチャネルが正常な排尿行動に重要であるかどうかを判断するために、尿路上皮条件ピエゾ1/2ダブルノックアウトマウス(Pz1/2-KO)マウスおよび年齢および性別を一致させた対照(Pz1/2-C;図9)。雌マウスと雄マウスの両方を、その日の暗期と明期に6時間テストし、ステップ.......

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Discussion

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ビデオ監視の組み込みは、従来のVSAに比べていくつかの利点を提供する費用対効果の高い変更です。エンドポイントアッセイとして一般的に使用される従来のVSAでは、重複するボイドスポットを区別することは困難です。マウスは、アッセイが数時間延長されると、通常はケージの隅で同じ領域で複数回排尿する傾向があるため、これは些細な問題ではありません。したがって、RT-VSAの第一の利点は、研究者が部分的または全体的に互いに重ね合わされた個々のスポットを容易に識別できることである。このことは、 図12に示す実験でよく示されています。この場合、ビデオ録画は、マウスが同じコーナーで3回ボイドし、重なり合うボイドスポットを堆積させたことを確認します。実験の最後にのみろ紙を分析した場合、VSAの典型的な方法で、1つのスポットしか区別できませんでした。したがって、古典的なエンドポイントVSAは、排尿行動の大きな違いを特定するのに役立ちますが、より微妙な表現型を区別できない可能性があります。現在の遺伝学の進歩とトランスジェニック動物の生成に伴い、排尿行動を正確に評価できる方法の開発が不可欠です。

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、NIH助成金R01DK119183(GAおよびMDCへ)、P30DK079307によるパイロットプロジェクト賞(MGDへ)、米国泌尿器科学会キャリア開発賞およびウィンターズ財団助成金(NMへ)、およびピッツバーグ腎臓研究センター(P30DK079307)の細胞生理学およびモデル生物腎臓イメージングコアによってサポートされました。

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00インチX 1.00インチTスロットプロファイル - 4つのオープンTスロット– 10インチにカット	80/20	1010	金額: 20
1.00"X 1.00インチTスロットプロファイル - 4つのオープンTスロット– 12インチにカット	80/20	1010	量: 6
1.00 インチX 1.00インチTスロットプロファイル - 4つのオープンTスロット– 40インチにカット	80/20	1010	量: 4
1.00"X 1.00インチTスロットプロファイル - 4つのオープンTスロット–14.75インチにカット	80/20	1010	量: 12
1.00"X 1.00インチTスロットプロファイル - 4つのオープンTスロット–32インチにカット	80/20	1010	量: 5
1/4-20 ダブルスライドインエコノミーTナット	80/20	3280	量: 16
1/4-20 トリプルスライドインエコノミーTナット	80/20	3287	量: 18
10 & 25 シリーズ2穴 - 18mmスロット付き内側コーナーブラケット、デュアルサポート付き	80/20	14061	量: 6
10 シリーズ3穴 - ストレートフラットプレート	80/20	4118	量: 8
10 シリーズ 5 穴 - "L" フラットプレート	80/20	4081	量: 8
10 シリーズ 5 穴 - "T" フラットプレート	80/20	4080	量: 8
10 シリーズ 5 穴 - ティーフラットプレート	80/20	4140	量: 2
10 シリーズ標準リフトオフヒンジ - 右手アセンブリ	80/20	2064	量: 2
10 から 15 シリーズ 2 穴 - ライトトランジション内側コーナーブラケット	80/20	4509	量:
6 24 インチ - 長い UV チューブライト	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	量: 2 20W 電球 – 24 インチ波長:365nm
アクリルミラーシート	プロフェッショナルプラスチック		量:1 82.5 cm x 26.5 cm
ミラーシート	プロフェッショナルプラスチック		量:2 26.5 cm x 30.5 cm
ミラーシート	プロフェッショナルプラスチック		量:2 82.5 cm x 30.5 cm
ARポリカーボネート(UV耐性)	80/20	65-2641	量: 2 4.5mm 厚さ, 透明, 38.5 cm x 26.5 cm
AR ポリカーボネート (耐紫外線性)	80/20	65-2641	量: 4 4.5mm 厚さ, 透明, 38.5 cm x 21.5 cm
AR ポリカーボネート (耐紫外線性)	80/20	65-2641	量: 4 4.5mm 厚さ, 透明, 26.5 cm x 21.5 cm
AR ポリカーボネート (耐紫外線性)	80/20	65-2641	量: 4 4.5mm 厚さ、透明 37.5 cm x 23.9 cm
AR ポリカーボネート (耐紫外線性)	80/20	65-2641	量: 4 4.5mm 厚さ、透明、24.4 cm x 23.9 cm
クロマトグラフィー紙 (薄い紙)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	57144
コスモスあぶらとり紙(厚紙)	ブリックアートマテリアルズ	10422-1005
Excel	マイクロソフト株式会社
GraphPad プリズム	GraphPad	ソフトウェア Version 9.4.0	グラフ作成・統計ソフト
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		透明フィルム
Quick Time Player 10.5 ソフトウェア	アップル		のマルチメディアプレーヤー
セキュリティスパイ	ベンソフトウェア		ビデオ監視ソフトウェアシステム
標準エンドファスナー、1/4-20	80/20	3381	量:80
UV透過アクリル	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	量:2 38.5 cm x 26.5 cm
ウォーターゲル:HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
ウェブカメラ	Logitech	C930e	数量:4

アクリルアクリル

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621(2020).
de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327(2....

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