ラット Ex Vivo 肺灌流モデルの設計と実装

サマリー

ex vivo 肺は、 in vivo 実験の交絡変数を除外しながら生理学的データを収集するためのさまざまな実験に役立ちます。商用セットアップは、多くの場合、高価で、収集できるデータの種類が限られています。ここでは、さまざまな研究デザインに適応できる、完全にモジュール化されたセットアップを構築する方法について説明します。

要約

ex vivo 肺製剤は、多くの異なる研究分野に翻訳できる有用なモデルであり、対応する in vivo および in vitro モデルを補完します。孤立した肺を使用したい研究室は、手頃な価格で信頼性が高く、関心のあるトピックに簡単に適応できるセットアップを確立するための重要なステップと固有の課題を認識する必要があります。この論文では、心拍出量の変化とは無関係に、肺血管緊張に対する薬物およびガスの影響を研究するための 、ex vivo ラット肺換気および灌流のDIY(Do It Yourself)モデルについて説明します。このモデルの作成には、a) 装置の設計と構築、b) 肺の隔離手順が含まれます。このモデルにより、商用の代替手段よりも費用対効果が高く、特定の研究課題の変化に適応するのに十分なモジュール化されたセットアップが得られます。さまざまな研究トピックに使用できる一貫したモデルを確保するためには、さまざまな障害を解決する必要がありました。このモデルが確立されると、さまざまな問題に非常に適応性が高く、さまざまな研究分野に合わせて簡単に変更できることが証明されています。

概要

Ex vivo 肺灌流(EVLP)技術¹ は、肺移植²、虚血/再灌流³、肺代謝⁴、免疫応答⁵を研究する手段として、過去10年間で使用が増加しています。孤立しているが無傷の人工呼吸器および灌流肺は、ニューロンやホルモンの入力や in vivoでの血行動態の変化などの潜在的な交絡因子なしに、潜在的な介入および/または治療に対する肺血管系を含む肺の反応を直接評価する非常に重要な能力を提供します。同時に、 in vitro 条件とは対照的に、換気と灌流の生理学的相互作用を維持します。例えば^、肺の免疫応答5を調べる提案では、肺移植のためのドナープールサイズ⁶ の増加に焦点を当てた研究と同じ品質のデータが必要である。EVLPは、マウス³、ラット^{7、8、9、10、11、12}、ブタ¹³、ヒト²など、さまざまな種で使用できます。そのため、さまざまな実験パラメータから信頼性の高いデータを生成できるモデルを確立する必要があります。臨床的関連性は、EVLP モデルをツールとして使用して、その後の研究で生成されます。

ほとんどの種で商用セットアップが購入できますが、多くの場合、コストがかかり、研究者は特定のブランドの機器や独自のソフトウェアに縛られることがあります。既成概念にとらわれないセットアップからの逸脱(例えば、ある種から別の種への移動)には、先見の明と提供されたセットアップを回避する必要がありますが、これは困難または不可能であることが判明する可能性があります。以下では、モジュール式で費用対効果の高いラット隔離肺のDIY(Do It Yourself)セットアップと、肺を隔離するための外科的処置について説明します。

プロトコル

実験の in vivo 部分(全身麻酔から安楽死まで)は、それぞれの動物施設管理委員会(IACUC)による事前承認が必要です。ここに記載されているすべての手順は、テネシー州ナッシュビルのヴァンダービルト大学医療センターのIACUCによって承認され(プロトコル番号M1700168)、ARRIVEガイドライン¹⁴に準拠して実施されました。実験に先立ち、すべてのラットは研究所の動物管理施設に収容され、水と餌に無料でアクセスできました。この原稿の範囲外のさまざまな研究を含めて、これまでに体重が250 gから400 gの7〜10週齢の雄のSprague Dawleyラットを合計148匹使用しました。

1. 装置製作

注意: 各メーカーを含むすべての部品は、 材料表に記載されています。

1. 各機器を所定の位置に保持するには、新しいデバイスの構成と組み込みを容易にするために、特注の格子を構築します(図1)。アルミニウム製のポール(長さ1〜2フィート、直径1cm、金物店で入手可能)をクロスクランプを使用して互いに取り付けて3D格子を作成し、プラスチックトレイ(30インチ×21インチ)に置いて液体のこぼれを防ぎます。
2. 圧力トランスデューサーを肺と同じ高さに取り付け、肺動脈(PA)、肺静脈(PV)、および換気チューブのラインに接続します。
   注:これらのトランスデューサーは、データ収集システム(DAQ)とそのソフトウェアに接続されたそれぞれのバイオアンプにデータを送信します。
3. 市販のカニューレを使用するのではなく、幅2mmの硬質プラスチックチューブのセグメントからカスタムカニューレ(図2)を作成し、端でフレアし、裸火を使用して縫合糸をしっかりと固定できるようにします。吊り下げ時の肺へのストレスを軽減し、肺室に収まるように、それらをU字型に曲げます。
4. 肺を換気して灌流するチャンバーを作るには、1,000 mLビーカーを1,500 mLビーカーの中に入れ、2つのビーカーと1,000 mLビーカーの間に水浴を挟み、1,000 mLビーカーの内側にダブルボイラーを作成します。これらのビーカーを48°Cに設定された加熱プレートに置き、湿度が高く、温度の変動に強い肺のチャンバーを作成します。
5. 実験用のバッファーを150 mLメスフラスコに入れ、37°Cに設定した加熱プレートに保管してください。 磁気攪拌バーを使用して、ビーカー内のバッファーを循環させます。バッファーの半月板を肺から 4 cm 上になるように高さに設定し、PV に 4 cmH₂O の圧力を内在的に作り出します。手術中は、静水圧浮腫の形成を減らすために、動物の肺が緩衝液と同じ高さにあることを確認してください。
   注意: フラスコを使用すると、室内の空気と接触する表面積が最小限に抑えられ、ガスの拡散が最小限に抑えられます。
6. ローラーポンプを使用して、肺に灌流する前に、加熱コイルとエアトラップで構成される回路を介してバッファーを移動します。PVからの排水をメスフラスコにリサイクルします。ヒーティングコイルとエアトラップの両方を、同じく37°Cに設定された循環水浴に接続します。 ポンプ速度に応じてウォーターバスの温度を調整し、灌流液の温度が37°Cに一定になるようにします。

2. 手続き

1. 実験を開始する前に、セットアップを準備します。
   1. ソフトウェアが実行され(下記参照)、データが適切に収集されていることを確認します。
   2. すべての圧力トランスデューサーを毎日校正して、ドリフトしていないことを確認します。
   3. 緩衝液を調製し(4%ウシ血清アルブミン[BSA]を含む生理食塩水の成分については表1を参照)、pHが7.4であることを確認し、HClを使用してそれに応じて調整します。温めたバッファー(表1)を全体に循環させて灌流システムを設置し、気泡が存在しないことを確認します。実験開始の少なくとも30分前にBSAを添加し、溶解するのに十分な時間を確保します。酸素供給器がない場合、65%N₂、30%O₂、および5%_CO2のガス組成のBSAを添加する前に、気泡ガスを灌流バッファーに注入して、in vivo肺の_CO2レベルを模倣します。これにより、BSAを添加した溶液が発泡するのを防ぎます。
   4. 必要なすべての手術器具、縫合糸、テープで手術領域を準備します。手術台を15°の角度で傾けると、麻酔をかけたラットの頭が体の他の部分よりも高くなるように配置でき、気管と心肺ブロックを簡単に操作できます。
   5. 適切な個人用保護具を着用し、ラットの体重を測定し、ペントバルビタール(65 mg / ^kg-1)の腹腔内注射を行います。.10分後、つま先をつまんで全身麻酔の手術面に到達したことを確認します。必要に応じて、より多くの麻酔薬を投与します。
2. ラットを手術領域に移し、前足を別々にテープで固定し、続いて後足を一緒にテープで固定し、麻酔が十分に深くない場合に痛みの反射を視覚化できるように前脚が十分に緩くテープで固定されていることを確認します(図3A)。
3. まだ自発的に呼吸しているラットの舌や空気の流れを制限することなく、前歯の後ろに長くて細いストリップで口をテープで留めて、ラットの頭を固定します(図3B)。
4. 鉗子を使用して気管の上の皮膚をつまみ、手術用ハサミで切断することにより、気管切開術を行います。湾曲した鉗子を使用して、筋肉と組織を鈍く解剖して気管に到達します。このステップ中に出血がないことを確認してください。
   1. 湾曲した鉗子を気管の下に通し、それらを開いて、下に3-0縫合糸を通すスペースを確保し、ボックスノットに事前に結ぶことができます(図3B)。気管の軟骨リングの間に小さな切開を行い、気管カニューレを挿入します(先端の周りに直径1mmのチューブを接着してノッチを作成するために18Gの針を修正します)。縫合糸を結び、気管切開部から空気が逃げないように、またカニューレが気管に負担をかけないようにします。
5. 換気装置を 30%_O2、5%_CO2、 および65%_N2のガス混合物で運転するように設定し、 一回換気量(VT) は 10 mL / kg、呼 気終末陽圧(PEEP) は 0 cmH₂O、 および60回の呼吸/分の速度で運転します。
6. 気管カニューレが縫合糸で固定されたら、上記の設定でラットの換気を開始します。
   注:使用される外科的方法は、Nelsonら⁹ から適応され、段階的に説明されています。
7. 大きな手術用ハサミと鉗子を使用して、ラットの腹部から毛皮を取り除きます。
   注:脱毛軟膏は、実験開始前にも使用できます。
8. 鉗子で剣状突起を保持しながら、肋骨の下に小さな水平切開を行い、横隔膜が無傷のままになるようにします。内臓が安全に見えるようになったら、横切り口を広げて横隔膜全体を露出させます。
9. 肺に穴を開けないように細心の注意を払いながら、ヘパリン(3,000 U/^kg-1)を22G注射器で下大静脈(IVC)に注入します。
10. 繰り返しになりますが、鉗子で剣状突起を保持し、肺を切断しないように常に視覚化しながら、胸骨に沿って頭蓋状に切断します。
11. 心肺ブロックを正しく見るには、2つの大きな鉗子を使用して胸郭を広げ、肋骨を骨折しないように注意してください。これにより、鋭い骨片が肺に穴を開ける可能性があります(図3C)。
    注:胸郭が開いたら、人工呼吸器の呼気肢に取り付けられたウォーターロックによって設定された2〜3 cmH₂OのPEEPを使用して、無気肺を回避します。
12. このとき、IVCを切断してネズミを放血で安楽死させます。ヘパリンの注射から少なくとも1分が経過していることを注意深く確認し(ステップ2.9を参照)、肺の循環と微小血栓の防止に十分な時間を与えます。.
13. 灌流カニューレを留置する際は、急激な変化が起こらないように、常に圧力を確認してください。
    注意: ポンプが一定速度で稼働しているときに圧力が急激に上昇した場合は、閉塞が形成されていることを示し、急激な低下は漏れを示している可能性があります。
14. 余分な胸腺をトリミングして、肺血管系の視覚化を容易にします。PAの位置を特定し、下に小さく湾曲した鉗子を通し、再び下に3-0縫合糸を通し、ボックスノットに事前に結びます。
15. 心臓の右心室に小さな切開を行い、PAカニューレ(縫合糸を結び付けることができるように、端を直火で広げた直径2mmのプラスチックチューブでできています)を挿入します。縫合糸と灌流を使用して、1.5 mL/^min-1 からカニューレを固定します(図 3D)。
16. 肺に圧力がかかるのを避けるために、すぐに心臓の頂点を切除します。小さく湾曲した鉗子を使用して、僧帽弁を破裂させ、鉗子が左心房に無制限に入ることができることを視覚的に確認します。
17. 心房の下の心臓の周りに事前に結ばれた3-0縫合糸を配置します(図3E)。
18. PVカニューレ(PAカニューレと同様の構造)を左心房に挿入し、縫合糸を結ぶ前にバッファーがそこから流れ出ることを確認します。
    注:PVカニューレは、PVを傷つけたり流れを妨げたりするほど深く配置されないようにしながら、適切に結ぶことができるように、僧帽弁を越えて配置することが重要です(図3E)。縫合糸を緩めすぎると流れが失われ、きつく結びすぎると心臓が損傷し、カニューレの配置が弱くなり、漏れを引き起こす可能性があるため、縫合糸の結び方には特に注意してください。
19. 胸腔と気管切開部の間の余分な組織を、先端が鈍いハサミを使用して切り込み、気管の損傷を防ぎます。気管カニューレの下の気管全体と心肺ブロック全体が見えることを確認します。
20. 気管カニューレを保持し、湾曲した先端の鈍いハサミで気管の後ろの結合組織を切除することにより、心肺ブロックと気管を切除し、食道を取り付けて追加の構造的サポートを行います(図3F)。
21. 流量を徐々に増やし、最大流量40mL/^kg-1/^min-1まで上げます。最初の50 mLのバッファーをシステムから流出させて、放出される可能性のある炎症性サイトカインを除去します(図3G)。
22. 隔離された肺を、2つのビーカーで作成されたダブルボイラーチャンバーに静かに動かします。肺を動かしたり吊るしたりするときに、PA、PV、または気管カニューレがねじれないようにしてください。
    注:肺の回収およびセットアップへの接続中の無気肺の予防は、特にEVLPがすでに損傷した肺に使用される場合、またはEVLPの前の介入が計画されている場合に重要です。これは、例えば、人工呼吸器¹⁵に移す前に、吸気後の気管に小さなクリップを装着することによって達成することができる。

3. データ取得

1. データ収集には、市販のA/DコンバータおよびDAQシステムを使用します。
2. サンプリング周波数が所与の目的(ここでは200Hz)に十分であること、およびバイオアンプおよび他の入力デバイスからのすべての関連する従属パラメータが同時に収集されること(このプロトコルで選択された気道内圧、PA、およびPV圧)¹⁶に留意してください。
3. 独立したパラメータ(灌流速度、換気速度、換気ガス組成、緩衝電解質組成、肺重量など)を記録します。

結果

10分間の安定化とベースラインの読み取りに続いて、10匹の雄のSprague Dawleyラットの最初のセットを5つの小さなグループに無作為に割り付けました:5、7.5、8、9、または10分間の全体的な非流動虚血(グループあたりn = 2)とそれに続く再灌流;これらの限定的な予備的な用量設定実験は、気道圧と浮腫形成の急激で不可逆的な増加が最終的に発生する前に、十分な換気と再灌流を可能にするための可能な限り長い虚血時間を特定するために実施されました。重要なことは、虚血中に換気を停止せず、換気速度を 60 回から 20 回/分^-1 に減らして、 その場 外肺の収縮と不可逆的な無気肺を防ぐことを選択したことです。一定のPEEPを適用すると、臨床診療で移植される肺の気管が吸気後にクランプされるのと同様に、同じ目標が達成される可能性があります¹⁷。 図4 は、これらの条件下で、150分の再灌流を許容する最長の虚血時間が8分であったことを示唆しています。

ディスカッション

私たちの研究室では、このセットアップを使用して100以上の実験が成功しています。このカスタマイズされたセットアップのモジュール設計により、実験要件の潜在的な変更に大きな柔軟性がもたらされました。他のセットアップでは、終末器官による一定の酸素消費とCO₂産生を模倣するために脱酸素器¹⁸を利用しているが、この簡略化されたモデルは、肺血管緊張に対する異なるガス組成の影響の研究に焦点を当てているため、この機能を使用していなかった。このアプローチでは、CO₂ は吸気ガス濃度によってのみ制御されるため、微分換気とは無関係に CO₂ の差動制御も可能になりました。

閉回路(図1)を使用して、改変されたクレブスバッファ(表1)を再循環させ、BSA廃棄物を節約しましたが、これは重要なコスト制限ステップです。一定の心拍出量を模倣した一定の流量による灌流を利用して、 in vivo...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1,000 mL ガラスビーカー	パイレックス、イリノイ州
1,500 mL ガラスビーカー	パイレックス、イリノイ州
エアトラップ コンプライアンスチャンバー	Radnoti	130149
バイオアンプ	CWE Inc	BPM-832
クランプ	フィッシャーサイエンティフィック	S02626
DAQ (データ収集)	国内Instruments, Austin, TX	NI USB-6343
Gas Mixer	CWE Inc, Ardmore, PA	GSM-4
Heating Coil	Radnoti, Covina, CA	158822
Heating Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11-100-49SH
Heparin	Pfizer	W63422
LabVIEW Full Development System 2014	National Instruments
ペントバルビタール	ダイヤモンドバック薬	G2270-0235-50
pH700プローブ	オークトン、バーノンヒルズ、イリノイ州	EW-35419-10
Polystatウォーターバス	コールパー	マーEW-12121-02
げっ歯類ベンチレーター	ハーバード装置、ホリストン、マサチューセッツ州モデル	683
ローラーポンプ	コールパーマー、ヴェルトハイム、ドイツ	Ismatec REGLOデジタルMS 2/8
Sprague Dawley ラット	Charles River, Wilmington, MA	ひずみコード 001
VetScan i-STAT	Abraxis, Chicago, IL	i-STAT 1

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