Method Article

ポリトランスフェクションによる細胞状態同定回路の急速開発

DOI:

10.3791/64793

⸱

February 24th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

複雑な遺伝子回路は、設計、テスト、最適化に時間がかかります。このプロセスを容易にするために、哺乳類細胞は、単一のウェル内の回路コンポーネントの複数の化学量論の試験を可能にする方法でトランスフェクトされます。このプロトコルは、実験計画、トランスフェクション、およびデータ解析の手順を概説しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

哺乳類の遺伝子回路は、さまざまな病状を感知して治療する可能性を実証していますが、回路コンポーネントのレベルの最適化は依然として困難で労働集約的です。このプロセスを加速するために、私たちの研究室は、従来の哺乳類トランスフェクションのハイスループット拡張であるポリトランスフェクションを開発しました。ポリトランスフェクションでは、トランスフェクションされた集団の各細胞が本質的に異なる実験を行い、異なるDNAコピー数で回路の挙動をテストし、ユーザーがシングルポット反応で多数の化学量論を分析できるようにします。これまでに、細胞の単一ウェルにおける3成分回路の比率を最適化するポリトランスフェクションが実証されています。原則として、同じ方法をさらに大きな回路の開発に使用できます。ポリトランスフェクションの結果は、一過性回路のコトランスフェクションに対するDNAの最適な比率を見つけたり、安定した細胞株を生成するための回路コンポーネントの発現レベルを選択したりするために簡単に適用できます。

ここでは、ポリトランスフェクションを使用して3成分回路を最適化する方法を示します。このプロトコルは、実験デザインの原則から始まり、ポリトランスフェクションが従来のコトランスフェクション法に基づいてどのように構築されるかを説明しています。次に、細胞のポリトランスフェクションを行い、数日後にフローサイトメトリーを行います。最後に、特定の成分比を持つ細胞のサブセットに対応するシングルセルフローサイトメトリーデータのスライスを調べることによって、データを分析します。ラボでは、ポリトランスフェクションを使用して、細胞分類器、フィードバックおよびフィードフォワードコントローラー、双安定モチーフなどを最適化しています。このシンプルでありながら強力な方法は、哺乳類細胞の複雑な遺伝子回路の設計サイクルをスピードアップします。

Introduction

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哺乳類合成生物学の分野は、培養細胞株における単純な感覚応答部分の開発から、診断および治療における現実世界の課題に対処するための遺伝子の複雑なネットワークの最適化まで、急速に進歩しています1。これらの高度な回路は、マイクロRNAプロファイルからサイトカイン、低分子薬物までの生物学的入力を検出し、トランジスタ、バンドパスフィルタ、トグルスイッチ、発振器などのロジック処理回路を実装することができます。彼らはまた、癌、関節炎、糖尿病、その他多くの疾患の動物モデルで有望な結果を示しています1,2,3,4,5。ただし、回路の複雑さが増すにつれて、各コンポーネントのレベルを最適化することはますます困難になります。

特に有用なタイプの遺伝子回路の1つは、細胞状態を感知して応答するようにプログラムすることができる細胞分類器である。特定の細胞状態でのタンパク質またはRNA出力の選択的産生は、細胞およびオルガノイドの分化をガイドおよびプログラムし、疾患細胞および/または望ましくない細胞型を特定および破壊し、治療細胞の機能を調節す....

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Protocol

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メモ: 表 1 および 表 2 は、このプロトコルの重要なリファレンスです。表 1 は反応の試薬スケーリングを示し、 表2 はプロトコルに記載されているポリトランスフェクションの例(上半分)と可能なフォローアップ実験(下半分)のDNA比算術を示しています。

1. トランスフェクションのための細胞の準備

  1. プロトコルを開始する前に、ヒト胚性腎臓(HEK293)細胞の培養が60%〜80%コンフルエントであることを確認してください。これを行うには、2日前に100 mm x 15 mmの組織培養ペトリ皿に1 x 106 細胞を播種し、5%CO2で37°Cでインキュベートします。
    注:私たちのプロトコルはHEK293細胞に焦点を当てていますが、他の細胞タイプで代用することもできます。
  2. 以下に説明するように、トランスフェクション用の培地と細胞を準備します。
    1. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%非必須アミノ酸(NEAA; 材料の表を参照)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の溶液の少なくとも20 mLを37°Cに予熱します。 少なくとも2.4 mLのトリプシンと2.4 mLのリン....

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Results

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図1では、コトランスフェクションとポリトランスフェクションを比較しています。コトランスフェクションでは、すべてのプラスミドが同じトランスフェクションミックスで送達されるため、単一細胞が受け取る各プラスミドの量に高い相関が生じます(図1A)。各細胞に送達されるプラスミドの総数は大きく異なりますが、集団全体の個々の細胞における2つのレポータータンパク質の蛍光はよく相関しており、2つのプラスミドがかなり一定の比率で同時送達されていることを示しています。トランスフェクションされた細胞は、ほとんどまたは多くの複合体を取り込むことができますが、各複合体は各プラスミドの相関量を持っているため、コトランスフェクションは2つのプラスミド間の濃縮空間の小さな対角領域のみを探索します。対照的に、ポリトランスフェクションでは、プラスミドは複数のトランスフェクション複合体で送達されるため、異なるトランスフェクションミックスでのプラスミドの非相関送達が得られます(図1B)。トランスフェク.......

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Discussion

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コンピューター支援設計(CAD)、ブレッドボード、3D印刷などのラピッドプロトタイピング手法は、機械、電気、土木工学の分野に革命をもたらしました。特定の課題に対して考えられる多くのソリューションをすばやく検索する機能は、この分野の進歩を大幅に加速します。ポリトランスフェクションは生物工学の類似技術であり、遺伝子回路のラピッドプロトタイピングを可能にすると考えています。さらに、他のラピッドプロトタイピング技術では、複数の可能な溶液をハンズオンで順次反復する必要がありますが、ポリトランスフェクションは多くのソリューションを同時に探索することができます。ポリトランスフェクションは、遺伝子回路成分比の多数の組み合わせを単一のウェルで試験することを可能にし、いくつかの公開された遺伝子回路を最適化するために使用されてきた10、11、13。実験プロトコルは、標準的なコトランスフェクションの単純な拡張であり、多くの哺乳類細胞研究者による直接的な採用を可能にします。一般.......

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Disclosures

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R.W.はStrand TherapeuticsとReplay Bioの共同創設者です。R.W.とR.J.は、細胞型分類器に関連する仮特許を出願しました。

Acknowledgements

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ポリトランスフェクション法の開発とその細胞分類器への応用を主導または貢献した元Weiss Labメンバー、Jeremy Gam、Bre DiAndreth、およびJin Huhに感謝します。さらなるメソッド開発/最適化に貢献した他のWeissラボメンバー:Wenlong Xu、Lei Wang、Christian Cuba-Samaniego。ジョシュ・レオナルド教授とパトリック・ドナヒューとヘイリー・エーデルスタインを含むグループメンバー、ポリトランスフェクションのテストとフィードバックの提供。ニカ・シャキバ教授がこの原稿を招待し、フィードバックを提供してくれました。また、国立衛生研究所[R01CA173712、R01CA207029、P50GM098792]にも感謝します。国立科学財団[1745645];NCIからのがんセンター支援(コア)助成金[P30CCA14051、一部]、および国立衛生研究所[P50GM098792]がこの作業に資金を提供してくれました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15mL コーニング ファルコン コニカル チューブサーモフィッシャー サイエンティフィック14-959-53A
24 ウェル ペトリ皿任意の(非発熱性、滅菌、RNase、DNase、DNA およびパイロジェン フリー)
ウシ血清アルブミンNEBB9000S
遠心分離機任意の15mL ファルコン チューブを 300 rcf
にさらすことができますCountess 3 自動セルカウンターThermoFisher ScientificAMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermoFisher ScientificC10228
Cytoflow 非商用ソフトウェアパッケージhttps://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEMVWR10-013-CV細胞タイプに適した培地を使用してください
EDTA サーモフィッシャーサイエンティフィック03690-100ML
ウシ胎児血清シグマ・アルドリッチF4135
HEK細胞ATCCCRL-1573実験には適切な細胞タイプを使用してください。HEK細胞は非常に効率的にトランスフェクションする傾向があります。
HeLa細胞ATCCCRL-12401実験には適切な細胞タイプを使用してください。
リポフェクタミン 3000 および P3000 エンハンサーサーモフィッシャー サイエンティフィL3000001細胞タイプに適した試薬を使用してください。 トランスフェクションおよびエンハンサー試薬
LSRFortessa フローサイトメーターBD BiosciencesN/A
MEM 非必須アミノ酸溶液Gibco11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL任意の会社
Opti-MEMサーモフィッシャーサイエンティフィック31985070還元血清中
リン酸緩衝生理食塩水サーモフィッシャーサイエンティフィック70011044
レインボーキャリブレーションビーズSpherotechURCP-100-2H
アジ化ナトリウムSigma AldrichS2002
トリプシンVWR25-053-CI
選択の会社 選択の会社 ック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
  2. Sayeg, M. K., et al.

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Poly TransfectionGenetic CircuitsCell State IdentificationMammalian CellsFlow CytometryCo TransfectionDNA Ratio OptimizationFluorescent ReportersCell ClassifierSynthetic Biology

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