改変自家馴化血清の作製とマウス角膜上皮における治癒能の ex vivo 評価

サマリー

この記事では、プロセスを簡素化し、自家コンディショニング血清(ACS)の調製をより安価にするプロトコルについて説明します。特別な注射器や表面コーティングされたガラスビーズは必要ありません。さらに、修飾ACS(mACS)は、マウス眼の角膜創傷治癒において、 エキサイビボで従来の自家血清よりも競争上の優位性を有する。

要約

ヒト血液由来の局所療法は、ここ数十年で臨床医に恩恵をもたらしてきました。自家血清(AS)および多血小板血漿(PRP)は、角膜創傷治癒に不可欠な上皮向性成長因子が豊富に含まれています。ASとは異なり、PRPは差動遠心分離システムに基づいており、より多くの血小板由来成長因子を生成します。自家馴化血清(ACS)は、ASおよびPRPの調製を保存するだけでなく、炎症性疾患において重要な免疫調節特性にも焦点を当てています。

標準化されたプロトコルの欠如と高い準備コストは、ACSの臨床応用の限界です。このビデオ実験は、修正された自己条件化血清(mACS)点眼薬を調製するための標準的な操作手順を示しています。まず、低酸素インキュベーション中に血球安定剤としてグリセロールをヘパリン注射器に添加した。血球を活性化するために、37°Cで4時間のインキュベーションを開始した。その後、血液サンプルを室温で10分間3,500× g で遠心分離した。上清を0.22 μmのフィルターでろ過した後、mACS点眼薬を十分に調製しました。

mACSの治療効果の暫定的なトライアウトは、 それがex vivo マウス眼における角膜創傷治癒において従来のASよりも競争上の優位性を有する可能性があることを示した。本研究で用いたASは、公表された研究と当院での臨床診療に従って調製された。したがって、眼の表面疾患に対するmACSの有効性は、 in vivo 動物実験および臨床試験を通じて将来の研究で評価される可能性があります。

概要

ドライアイ疾患における自家血清(AS)の治療効果は、1980年代にFoxらによって最初に報告されました¹。ASの潤滑特性と必須のエピテリオトロピック生化学的成分の両方が、天然の涙を模倣して、角膜上皮細胞の増殖に利益をもたらすと考えられています。過去数十年にわたって、これに基づいていくつかの研究が行われてきました。栄養成分には、上皮成長因子(EGF)、ビタミンA、トランスフォーミング成長因子β(TGF−β)、および他のサイトカインが含まれる。興味深いことに、血清にはTGF-βとビタミンAが豊富に含まれており、これらは表皮増殖に極めて重要な役割を果たしていると考えられています^2,3,4,5。さらに、眼表面疾患の患者を治療する場合、いくつかの研究は、患者が報告した結果、他の客観的なドライアイパラメータ^6,7、および細胞密度⁸などの顕微鏡所見におけるAS点眼薬のいくつかの利点を示しています。メタアナリシス研究では、AS点眼薬治療で患者の症候群を改善することにいくつかの利点があるかもしれないことが明らかになりましたが、長期的な結果と観察はまだ不足しています^9,10。

ASとは異なり、多血小板血漿(PRP)は、調製中に抗凝固剤を添加することに由来し、血小板のさらなる差遠心分離と化学的活性化を伴う。ASと比較して、TGF-β、血管内皮成長因子(VEGF)、およびEGFなどの多数の化学物質および成長因子がPRPに存在する。また、症状緩和に臨床的利益をもたらす眼表面疾患にも適用されています¹¹。

上皮欠損と炎症の間の架橋は複雑です。特に、免疫病態生理学は眼の表面疾患におけるもう一つの重要な問題である。IL-1βおよびIFN-γなどの炎症誘発性サイトカインは、炎症カスケードにおける極めて重要なメディエーターであると考えられている¹²。したがって、免疫メカニズムの理解に基づいて、新しい治療の道が開かれます。インターロイキン−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra)および他の抗炎症性サイトカインの産生を含むこの炎症過程を止めるための戦略もまた、眼表面疾患において重要な役割を果たす可能性がある¹³、^14、15。

1998年以来、商品化された自家コンディショニング血清(ACS)であるオルソカインは、変形性関節症(OA)、関節リウマチ(RA)、および脊椎疾患に苦しむ整形外科患者に臨床的に使用されてきました¹³。ASおよびPRPと比較して、化学的にコーティングされたガラスビーズによる処理および単球を活性化するための低酸素インキュベーションは、ACS¹⁶の特徴です。理論的には、細胞に生存ストレスを加えることによってより多くの抗炎症因子が分泌され、その結果、IL-1Raを含む必須免疫調節成分の濃度が高くなります。ASと比較して、OAにおけるACSの治療効果の改善も報告されています¹⁷。眼表面疾患は、いくつかの点で整形外科炎症性疾患と同様の免疫背景を共有しています。したがって、整形外科分野でのヒト血液由来治療の成功結果に基づいて、ACSは、エピテリオトロピックおよび免疫調節特性によって、臨床診療における従来の治療よりも優れている可能性があります。ACSは整形外科の炎症性疾患で広く使用されていますが、眼科での臨床応用はまだ検討する必要があり、コストが高いこと、文献サポートの欠如、および調製プロセスの標準化の欠如によって妨げられる可能性があり、その結果、多様な性能が得られます。

このビデオ記事では、修飾ACS(mACS)、または成長因子に富む血漿(PRGF)を生成するための、新しく費用効果が高く、便利な方法が実証され、商品化されたACSに匹敵する実用的な価値を持つ点眼液が製造されました。抗凝固剤を添加し、ストレスインキュベーションによって血球に抗炎症性サイトカインを分泌させるという重要なアイデアは保持されましたが、CrSO4コーティングガラスビーズや市販キットに基づく方法などの化学的に誘発される方法とは異なり、臨界ストレス状態は低酸素インキュベーションによって物理的に誘発されますこの方法。さらに、グリセロールは、血球の膜の安定性の向上、適切な浸透圧細胞外液圧の維持¹⁸、および細胞に過度のストレスを避ける低酸素状態での適切な栄養源を含む追加の利点を提供するために添加されました。

プロトコル

研究は、プロトコルセクションの冒頭にある制度的ガイドラインに準拠して実施されました。すべてのプロトコルと手順は、ヘルシンキ宣言に従って実施され、長宮医療財団治験審査委員会によってレビューおよび承認されました。すべてのボランティアは、この研究の性質を知らされ、インフォームドコンセントフォームに署名しました 含める前に。実験手順全体に必要な消耗品は、図 1 と 図2、および 材料表に示されています。

1. mACS点眼剤の製造に必要な材料の準備

1. 250 mLの10%グリセロール溶液を調製し、21 Gの蝶の羽の輸液セット、針なしの3 mLシリンジ、およびヘパリン158 USPユニットを含む6本の10 mLバキュテイナーチューブを準備します(図1)。
2. 21 Gの採血針を3 mLシリンジに接続し、3 mLの10%グリセロール溶液を準備したシリンジに引き出します。
   注意: 針を挿入する前に、すべての材料を滅菌する必要があります。
3. 10%グリセロール溶液を順番にバキュテイナーチューブに分配し、それぞれに約0.5mLの10%グリセロール溶液を入れます(図3A)。
   注意: 試験管内の負圧のため、3mLのグリセロール溶液を6本の試験管に均等に分配するには、針が入った直後に針を出す必要があります。
4. 75%アルコール滅菌綿棒で患者の皮膚を滅菌します。18 Gの採血針で患者の上肢の表在静脈を穿刺します。表在静脈から合計60〜70mLの静脈血を採取します。

2.mACS点眼剤の準備

1. 採取した静脈血10 mLを6本のバキュテイナーチューブのそれぞれに順次注入します(図3B)。
   注意: このステップは、真空の負圧に依存してチューブを満たします。血球破壊や溶血を避けるために、陽圧をかけないでください。
2. 6本のバキュテイナーチューブを37°Cの一定温度のインキュベーターに4時間入れます(図3C)。
   注:低酸素状態は、グリセロールを受け取った密閉チューブ内の残りの負圧によって維持および安定化されます。
3. 4時間後にチューブをインキュベーターから取り出し、室温で10分間3,500 × g で遠心分離します。
4. この時点で、滅菌した点眼ボトル、針付き3 mLシリンジ、0.22 μmフィルター、18 G針、滅菌手袋など、mACS抽出用の材料を準備します(図2)。
   注意: 無菌環境を確保するために、手術台は75%アルコールで拭く必要があります。遠心分離後の上清は、すでにmACSの半製品です。
5. 6本のチューブをチューブラックに置き、完全に遠心分離した後、キャップを開きます(図3D)。
   注意: このステップでは無菌は必要ありません。
6. 滅菌手袋を着用し、18Gの針が付いた3mLシリンジを使用してmACSを1つずつ引き出します。
   注意: このステップでは、下の血球層を描画しないように注意してください(図3E)。
7. 針を引き出し、0.22 μmフィルターに接続し、元の3 mLシリンジを備えた23 G、1.5インチ採血針を下の出口に接続します(図3F)。
8. 針を0.22 μmフィルターを通して、準備した滅菌点眼ボトルにそっと押し込みます(図3G)。
9. すべてのmACSがろ過され、点眼ボトルに保存されるまで、上記の手順を繰り返します(図3H)。
10. mACS点眼薬は、すぐに使用できるように4°Cで保管してください。長期保存のために-20°Cで保存してください。
    注意: 2°Cで4週間以上、または-3^°Cで20か月以上^9,19保管しないでください。

3. マウス角膜上皮の 生体外 創傷治癒モデル

注:以下の ex vivo 動物モデルは、角膜上皮²⁰の機械的損傷に関するHungらの以前の経験に基づいていました。次の手順を顕微鏡下で実行して、十分に外接した一貫した角膜上皮創傷を作成する必要があります。

1. C57BL / 6マウスを3%〜4%イソフルランで麻酔します。皮膚生検パンチをマウス中央角膜の上にインデントし、均一な創傷縁として上皮に浅い円を残します。
   注意: 眼球の破裂を避けるために優しくしてください。
2. 確認された領域内の角膜上皮をボーマン層までデブライドし、0.5mmのバリを備えた角膜サビリングリムーバーを使用します。
3. 機械的角膜創傷の ex vivo 動物モデルを確立するには、眼球を採取し、培養物を十分に準備します。
   1. 最初にマウスを安楽死させます。次に、マウスの上眼窩縁と下眼窩縁をそっと押し、鉗子の先端を球後腔に導入し、眼球を取り出し、鉗子で保持します。
   2. 眼球を完全に隔離するために角膜ハサミで視神経と眼窩周囲軟部組織を切断します。
   3. その中に溶けたワックスを入れた96ウェルプレートを準備します。鉗子の先端を使って丸い穴をすばやく作成し、固まるのを待ちます。
4. テストする培地を準備します:比較のために0.5%mACS、0.5%AS、陰性対照としての通常の生理食塩水、およびダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)。
   注:mACSは上記のプロトコルを使用して取得されます。
5. ex vivo培養では、採取した眼球を準備済みの96ウェルプレートに置きます。各培地200 μLを96ウェルプレートに加えます。
6. 96穴培養プレートを5%_CO2を含む37°Cのインキュベーターに入れます。培地が24時間ごとに交換されることを確認してください。
7. 逐次創傷治癒効果を確認するには、フルオレセイン染色により8時間ごとに顕微鏡下で上皮創傷領域をモニターします。
   1. フルオレセイン紙上のフルオレセインを生理食塩水で溶解します。
   2. フルオレセイン色素をマウス中央角膜に滴下し、顕微鏡で観察して記録します。典型的な結果を 図4に示します。
      注:観察にはフルオレセイン色素1滴(約0.05 mL)で十分です。

結果

図1と図2は実験に必要な材料を示し、図3はmACSの調製中の連続したステップと成功した中間生成物を示しています。まず、0.5 mLの10%グリセロール溶液を各10 mLの滅菌試験管に添加した(図3A)。次に、患者から60〜70mLの静脈血を採取し、各チューブに10mLの血液を注入した(図3B)。患者の血液は、血液の質が標準に達していることを確認するために、準備の前に徹底的な定期的な臨床検査を受けなければなりません。最も一般的な低品質の血液製剤は脂質異常症によるものであり、遠心分離後に血清の上層が濁り、除去が困難です。点眼薬のさらなる調製は継続できない(図5A)。

次いで、密封された試験管を37°Cのインキュベーターに4時間入れる...

ディスカッション

この研究では、mACSの調製のためのプロトコルが説明され、動物モデルの創傷治癒におけるmACS点眼薬の利点がさらに示されています。このmACSプロトコルの重要な変更は、各試験管に約0.5 mLの10%グリセロール溶液を添加することであり、37°Cでの4時間のインキュベーション中に適切な低酸素状態を作り出します。 この設定は、ASに適切なストレスを与え、細胞が創傷治癒を助けるために必要な成長因子を分泌するように促します。0.22μmのフィルターは、高分子タンパク質、血球、不純物を除去するのに役立ち、最終製品を純粋で接着性の低いものにします。

血液を37°Cで4時間インキュベートし、さらに遠心分離とろ過を行います。最終製品を適切な温度で調製および保管する際の無菌性への厳密な注意も重要です。最終血清製品の高い栄養素含有量は、細菌にとって優れた培養培地です。したがって、調製中の不適切な保管または汚染は点眼薬を損なう可能性があります。汚染されたmACSは、結膜炎や感染性角膜炎などの病気を引き起こす可能性があります。

患者の血液の質も重要...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル培養プレート	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
バロン真空パンチ 8.0 mm	katena	K20-2108	濾紙切断用
BD 10.0 mL ヘパリンを含む 158 USP ユニット	ベクトン、ディキンソン アンド カンパニー、US	367880	少なくとも 6 本のチューブ、その後の実験のために血液を収集し、血液凝集を避けるために必要
BD 21 G 蝶の翼を持つ輸液セット	ベクトン、ディキンソン アンド カンパニー、米国	367281	グリセロール溶液
C57BL/6マウス	国立動物実験動物センター	RMRC11005	マウスモデル
カストロビエージョ鉗子0.12mm	カテナ	K5-2500
遠心分離機	エッペンドルフ、ドイツ	5811000428	3,500 x g 10
分間 Cheng Yi 10.0 mL 滅菌済み点眼器ボトル	Cheng Yi Chemical, 台湾	CP405141	無菌でなければならず、最終製品の保存容器として
角膜錆リング除去剤 0.5 mm バリ	Algerbrush IITM;Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
濾紙	東洋老師株式会社	1.11
フルオレセインナトリウム眼科用ストリップUSP	OPTITECH		角膜上皮欠損の染色
インキュベータ	ーFirstek、台湾	S300S	37 °C 4時間用
カナム滅菌手袋	カナムラテックスインダストリーズ、インド	EN455	無菌操作用
メルク 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	A least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	血液細胞に適した膜安定化効果と細胞外浸透圧を提供するには
生理食塩水	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
皮膚生検パンチ 2mm	STIEFEL	22650
実体顕微鏡	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	手術用顕微鏡
Terumo 18 G 針	Terumo, 台湾	SMACF0120-18BX	3.0 mL 注射器 18 G 針付き 遠心分離後に上清を抽出する
Terumo 20.0 mL 注射器	テルモ, 台湾	MDSS20ES	最初の遠心分離後に血清を採取し、二次遠心分離に使用するために使用できます。
23Gニードル入りテルモ3.0mLシリンジ	モ、台湾	MDSS03S2325	3.0mLシリンジを使用して、遠心分離後に上清を抽出します。次に、フィルターと23G針を接続して点眼薬ボトルに注入します。
ウェストコット腱切開はさみミディアム	カテナ	K4-3004

の均等な分布  OPTFL100 テル