方法論記事

DESI-MSIを用いた漢方薬の空間メタボロームで同定された代謝物の可視化

DOI：

10.3791/64912

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2022年12月16日

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1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Tianfu Chinese Medicine Innovation Harbour, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4China Resources Sanjiu (Ya’an) Pharmaceutical Co., Ltd.

この記事について

サマリー

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本研究では、プラントからDESI-MSIサンプルを調製するための一連の方法を提示し、DESIアセンブリの設置、MSIデータの取得、および処理の手順を詳細に説明します。このプロトコルは、植物における空間メタボローム情報を取得するためのいくつかの条件に適用することができる。

要約

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伝統的な漢方薬の薬用使用は、主にその二次代謝産物によるものです。これらの代謝産物の分布の可視化は、植物科学において重要なテーマとなっています。質量分析イメージングは、組織スライスを分析することにより、膨大な量のデータを抽出し、これらに関する空間分布情報を提供できます。高スループットと高精度の利点により、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング(DESI-MSI)は、生物学研究や伝統的な漢方薬の研究でよく使用されます。ただし、この研究で使用される手順は複雑で手頃な価格ではありません。この研究では、切片作成とDESIイメージング手順を最適化し、代謝物の分布を特定し、植物組織中のこれらの化合物を分類するためのより費用効果の高い方法を開発しました。本研究では、代謝物分析におけるDESIの活用と、研究関連技術のための伝統的な漢方薬/民族医学の標準化を促進します。

概要

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代謝物分布の可視化は、植物科学、特に漢方薬において、植物内の特定の代謝物の形成過程を明らかにする重要なトピックとなっています。伝統的な漢方薬(TCM)を参照して、有効成分に関する情報を提供し、製薬用途における植物部品の応用をガイドします。通常、代謝物の可視化はin situハイブリダイゼーション、蛍光顕微鏡、免疫組織化学などによって行われますが、これらの実験で検出される化合物の数では、限られた化学情報しか伝えられません。組織染色と組み合わせることで、質量分析イメージング(MSI)は、ミクロンレベル1の組織スライスをスキャンして分析することにより、大量のデータを提供し、化合物の空間分布情報を提供できます。MSIは、サンプル表面からの脱離とイオン化に分析物を使用し、その後、得られた気相イオンの質量分析とイメージングソフトウェアの適用により、情報を統合し、特定のイオン存在量を記録した2次元画像をプロットします。この技術は、標的組織および器官における薬物およびそれらの誘導代謝産物の特徴的な分布を検出することにより、外因性分子および内因性分子の両方を決定することができる2,3,4,5。

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プロトコル

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1. サンプル調製

  1. 2年生の サルビアミルティオルリザ 植物(図1A)からきれいにした根と葉を集め、手で約3〜5 mmの断面の厚さで直接スライスします。次に、両面テープを使用してサンプルを接着顕微鏡スライドガラス上に貼り付けます(図1B)。
    注意: 両面テープのサイズがサンプルよりも大きいことを確認してください。ティッシュが乾燥している場合は、スライスする前に水または4%パラホルムアルデヒドに一晩浸します。
  2. 別の顕微鏡スライドガラスをサンプルの上に置き、2つのスライドガラスをサンドイッチのようなシーリングフィルムで包みます(図1C)。サンドイッチサンプルを-80°Cで少なくとも4時間凍結し、次に次の設定パラメータを使用して2時間空気真空にさらします(図1D):トラップ温度は-75〜-82°C、真空計は2.5〜3.7Paです。
    注意: サンプルの表面を無傷に保つために、シーリングフィルムを包むときは、2つのスライドガラスが平行であることを確認してください。植物組織の水分含有量が高い場合は、空気真空の時間を3時間に延長します。5時間を超えないでください、そうでなければ組織は容易に骨折します。

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結果

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このプロトコルは、植物サンプル中の化合物の同定と分布につながる可能性があります。特定のm/zのMS画像では、各ピクセルの色はm/zの相対強度を表しているため、サンプル全体の自然分布と代謝物イオンの存在量に関連付けることができます。収集位置での化学物質の量が多いほど、色は明るくなります。写真のバー(図4A-D)は、色のグラデーションを示しています。ここでは、S. miltiorrhizaの薬用使用に価値のある2つの化合物を選択しました。図4A-Dに示すように、目的化合物であるタンシノンIIA(m/z:333.0893、M+H)とロスマリン酸(m/z:705.1848、2M+H-O)の分布は、根のさまざまな領域で見られます。一方、図4E-Hに示す.......

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ディスカッション

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MS技術の出現は、近年の分子レベルでの天然物研究に新しい洞察を開きました24。高感度と高スループットを備えたMS装置は、微量濃度25でも天然物中の代謝物の標的分析と非標的分析を可能にします。したがって、MSは現在、伝統的な漢方薬(TCM)化学の分野で広く使用されています。TCMの化学組成に関する定性的および定量的研究は、医薬品の成分とその関連化合物に関する情報を提供することができ、薬理学的研究に適した参照を提供するだけでなく、TCM26の品質基準システムを構築するための基礎も提供します。その上、天然物では、代謝シグネチャは通常、形態学的および組織学的特徴に関連しています27;したがって、in situ 分析を実施して、さまざまな生物的および非生物的ストレス条件に対する植物のメカニズムと応答を特定することは非常に価値があります28。ただし、従来のMS分析のサンプルは、特定の天然物または.......

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開示事項

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著者は開示するものは何もありません。

謝辞

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この研究は、四川省自然科学財団(第2022NSFSC0171号)および成都TCM大学の興林人材プログラム(第030058042号)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-プロパノールフィッシャーCAS:67-63-0HPLCグレード
アセトニトリルSigma-aldrichNumber-75-05-8LC-MSグレード
接着顕微鏡スライドCitotest scientific80312-3161顕微鏡ガラススライド に接着できる 
空冷式ドライ真空ポンプEYELAFDU-2110-80°Cの空気真空装置。C
ギ酸ACSF1089 | 64-18-6LC-MS グレード
LE (ロイシン エンケファリン)Waters186006013-1LC-MS グレード
メタノールSigma-aldrichNumber-67-56-1LC-MS グレード
パラフィルム Bemis Companysc-200288ラボ用シーリング フィルム
パラホルムアルデヒドSigma-aldrichV900894試薬グレード
Q-TOF 質量分析計 ( DESI ソースWatersSynapt XS
付き)

参考文献

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  1. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  2. Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and....

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