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方法論記事

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

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DOI:

10.3791/65137

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2023年5月12日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、力に敏感な生体分子を最大1.2kHzの速度でナノメカニカル測定を行う高速磁気ピンセットのセットアップについて説明します。モデル系としてDNAヘアピンやSNARE複合体への応用を紹介しますが、メカノバイオイベントに関与する他の分子にも応用できます。

要約

1分子磁気ピンセット(MT)は、核酸やタンパク質などの生体分子を強制的に調べるための強力なツールとして機能しており、メカノバイオロジーの分野で役立つ態勢を整えています。この方法は一般に磁気ビーズの画像ベースの追跡に依存しているため、画像の記録と分析の速度制限、およびビーズの熱変動は、標的分子の小さくて速い構造変化を観察するためのその応用を長い間妨げてきました。本稿では、生体分子とその複合体のナノスケール、ミリ秒のダイナミクスを解析できる高分解能MTセットアップの構築と操作の詳細な方法について説明します。応用例として、DNAヘアピンやSNARE複合体(膜融合機構)を用いた実験を、ピコノートンスケールの力の存在下でそれらの過渡状態や遷移をどのように検出できるかに焦点を当てて説明します。今後も高速MTにより、細胞内の力を感知・伝達・発生する分子の高精度なナノメカニカル計測が可能となり、メカノバイオロジーの分子レベルでの理解が深まることが期待されます。

概要

細胞は機械的刺激を積極的に感知し、反応します。そうすることで、多くの生体分子は力に依存する特性を示し、動的な構造変化を可能にします。よく知られている例としては、機械感受性イオンチャネルや細胞骨格要素があり、周囲の環境から細胞に重要な機械的情報を提供します。

また、独特の力を持つ性質を示す分子も、より広い意味で機械感受性と見なすことができます。例えば、核酸二本鎖の局所的な形成と融解、およびG-quadruplexなどの高次構造は、複製、転写、組換え、そして最近ではゲノム編集において重要な役割を果たします。さらに、シナプスコミュニケーションに関与するいくつかのニューロンタンパク質は、典型的な分子間相互作用のレベルを超える物理的な力を生成することによってそれらの機能を果たす。いずれの例を用いても、関与する生体分子のナノメカニクスを高い時空間精度で調べることは、関連するメカノバイオロジカルプロセスの分子メカニズムを明らかにする上で非常に有用であることがわかります1,2,3。

単一分子力分光法は、生体分子の機械的特性を調べるための強力なツールとして役立っています2,4,5,6。核酸やタンパク質の構造変化を力を加えると同時にモニタリングし、力依存性を調べることができます。よく知られている2つのセットアップは、光ピンセットと磁気ピンセット(MT)で、ミクロンサイズのビーズを使用して分子を操作します5,6,7,8。これらのプラットフォームでは、ポリスチレン(光ピンセット用)または磁気ビーズ(MT用)は、通常は二本鎖DNA(dsDNA)の短い断片でできている分子「ハンドル」を介して標的分子(核酸やタンパク質など)につながれています。次に、ビーズを動かして力を加え、画像化して、標的分子の構造変化を報告するビーズの位置を追跡します。光ピンセットと磁気ピンセットは、その用途ではほぼ互換性がありますが、力を制御するためのアプローチには重要な違いがあります。光ピンセットは、ビーズを所定の位置にトラップする本質的に位置クランプ装置であり、ターゲット構造の形状が変化すると、加えられる力が変動します。展開などによる伸展の増加は、テザーを緩めて張力を低下させ、逆もまた同様です。光ピンセットの力を制御するためにアクティブフィードバックを実装することができますが、MTは自然にフォースクランプデバイスとして動作し、永久磁石による安定した遠方界磁力を利用して、環境の摂動にも耐えることができます。

MTは、その長い歴史とシンプルな設計にもかかわらず、主に高速ビードトラッキングの技術的課題のために、高精度測定へのアプリケーションにおいて光ピンセットに遅れをとっています。しかし、最近では、いくつかのグループが共同でMT機器のハードウェアとソフトウェアの両方の多面的な改善を主導しています2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 .本研究では、1.2kHzで動作するこのようなセットアップの例を紹介し、それを使用して力に敏感な生体分子のナノメカニカル測定を実行する方法について説明します。モデルシステムとして、DNAヘアピンと神経細胞SNARE複合体を用いて、ピコニュートンレジームにおけるそれらの速い構造変化を調べます。DNAヘアピンは、明確に定義された力範囲20,21で単純な2状態遷移を示すため、ピンセットセットアップの性能を検証するためのおもちゃモデルとして機能します。SNAREタンパク質は、膜融合22を駆動する力に敏感な複合体に集合するため、単一分子力分光法14、23、24、25によっても広く研究されています。データを分析し、熱力学と動力学に関する有用な情報を抽出するための標準的なアプローチが提示されています。この記事が、メカノバイオロジー研究における高精度MTの採用を促進し、読者が関心のある独自の力に敏感なシステムを探求するように動機付けることを願っています。

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プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての材料と機器は、 材料の表に記載されています。以下に説明する高速MTセットアップを操作するためのLabVIEWソフトウェア、およびサンプルデータを解析するためのMATLABスクリプトは、GitHub(https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers)に公開されています。

1. 装置構成

注:高速MT構造の一般原理は、高速相補型金属酸化膜半導体(CMOS)カメラと高出力のコヒーレント光源を使用する点を除いて、標準の従来のMTシステムと同様です(図1)。標準MT機器5,26,27の詳細については、他のソースを参照してください。

  1. 防振光学テーブルに倒立顕微鏡を設置します。高速CMOSカメラとフレームグラバーを取り付けます。
  2. 磁石を3Dで操作するための平行移動ステージを構築します。電動リニアステージ(トラベル>20 mm)を手動XYステージの上に垂直に取り付けます。
    注意: 垂直方向の動きは力を制御しますが、XYステージはセットアップの初期構築のために磁石を光軸に手動で位置合わせするためのものです。
  3. 回転ステッピングモーターと回転磁石用のベルトとプーリーシステムを取り付けます。
    注意: ベルトは、モーターシャフトと数センチ離れた磁石の間の回転運動を伝達します。磁石の回転は並進操作の内部にあります。
  4. 磁石を取り付けます。2つの同一の磁石を並列にしっかりと収納できるアクリルホルダー(製造会社から注文、 補足図S1を参照)を使用し、磁石間に1mmのギャップを明確にします(図1B)。所定の磁石のペアで得られる最大の力を利用するには、平行移動ステージの垂直位置を調整して、磁石の底面がサンプル平面に最も低い位置に移動したときに位置が揃うようにします。
    注:磁石28のホルダーの設計と構成の詳細については、Lipfertらを参照してください。磁石の高さと向きは、LabVIEWソフトウェアとデータ集録によって制御されます。
  5. 低倍率の対物レンズで見る場合は、磁石を視野の中心に合わせます。磁石を回転させても、磁石ペアの中心が大きくずれないことを確認してください。
    注意: 磁石間の中点が回転軸を中心に回転する場合は、ホルダーが不完全であるために磁石の中心がずれている可能性があります。磁石の回転はテザーをチェックし、特定のアプリケーションでトルクを適用するためだけであるため、ギャップサイズに対するわずかなレベルのミスアライメントは許容されます。
  6. ビーズの照明用のスーパールミネッセントダイオード(SLD)を取り付けます。2つの磁石の間の1mmのギャップにビームを通します。ビームがギャップに収まるように適切にコリメートされ、照明が磁石によって影を落とされていないことを確認してください。
  7. ノーズピースにピエゾレンズスキャナーを取り付け、ビーズトラッキング用の100倍油浸対物レンズ(開口数[NA]:1.45)を取り付けます。結果の追跡で潜在的なアーチファクトを回避するには、磁石を移動したときに照明が均一に維持されるようにしてください。最後に、ピクセルを飽和させずに、光のレベルを最大輝度に調整します。
    注:ビーズの高速トラッキングのためのさまざまな光源の比較については、Dulinら29を参照してください。

2. 磁力の校正

  1. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR; 表1参照)を用いて、一方の端がビオチン(表面付着用)で標識され、他方の端がアジ化物(ビーズ付着用)で標識された5 kbp dsDNAフラグメント(プライマーB、プライマー Z_5k、およびλ-DNAを使用)を調製します。
  2. セクション6に続いて、5 kbp分子を含むフローセルを準備します。
  3. セクション7に続いて、その伸長と回転を検証して、適切なビーズテザー構造を特定します。特に、中心から外れたアタッチメント30,31によるビードの高さオフセットを最小限に抑えるために、回転軌道が最小のビード(半径<200 nm)のビードを選択してください。良好なテザーが特定されたら、セクション9を参照してビードトラッキングを開始します。
  4. セットアップが新しい場合は、信頼性の高い高分解能測定のためにノイズと安定性を特徴付けます。フローセル表面から磁石~3mmを置き(>10pNを印加し、ビーズのブラウン運動を抑制するため)、1.2kHzでビーズのz位置を追跡し、z座標時系列32,33からアラン偏差(AD)を計算します(図2C)。高速領域(<0.1秒)で数ナノメートルのAD値が達成可能であり、差動トラッキング(基準ビーズに対する磁気ビーズ位置)が長いタイムスケールでADを減少させることを確認します。
    注:通常、最大レート(1.2kHzまたは0.83msの分解能)で<3nmのADが得られ、ADは少なくとも最大10秒まで減少し続け、ドリフトが最小限であることを意味します。他の人は、同様のセットアップ9、10、11、12、34で同様の値を報告しています。
  5. 磁石を静止位置(F ~ 0 pN)にして、テザービードの x座標と y座標を1.2kHzで記録します。ブラウン運動が十分にサンプリングされるように、十分に長い期間(すなわち、変動の特性緩和時間35よりも十分に長い)位置を記録する。
    注: ここで、x方向は磁場の方向に沿っていますが、 y 方向の動きは磁場に垂直な横方向の動きを表しています。
  6. 磁石をフローセルに近づけ、磁石がフローセルの上部に軽く触れるまでビード位置の測定を繰り返します。磁石がサンプル面から7 mm以上離れている場合は大きなステップ(たとえば、1〜2 mm)で移動しますが(磁石の遠方界では加えられる力がゆっくりと増加するため)、ステップサイズを徐々に小さくします(例:0.1〜0.5 mm)より高い力レベルでより細かいキャリブレーションのために(図2B)。
  7. 2つの代替方法のいずれかを使用して、各磁石位置 dでの力を計算します(両方の方法を含むMATLABスクリプト「force calibration.m」が提供されます; 補足ファイル1を参照)。
    1. ビーズのy座標 figure-protocol-1 (図2D)と最低位置に対するビードの平均z位置figure-protocol-2(図2B、下)の分散を測定します。次に、式 (1)7,27,36 を使用して力を推定します (固定ビーズ半径 R = 1,400 nm、熱エネルギー kRT = 4.11 pN∙nm の場合)。
      figure-protocol-3(1)
    2. または、y座標Syのパワースペクトル密度(PSD)を計算します(図2E)。式(2)を用いて測定されたSyに二重ローレンツモデル37を当てはめて、加えられた力Fを求める。
      figure-protocol-4(2)
      ここで、Rはビード半径、figure-protocol-5γyおよびγφはそれぞれ並進抗力係数および回転抗力係数(ストークス・アインシュタイン式から推定)、kRTは熱エネルギー、f+およびf-は式(3)を用いて求められる2つの特性周波数である。
      figure-protocol-6 (3)
      注:テザー延長Lは、確立されたワームライクチェーン(WLC)モデルに従う力の関数であるため、上記の式ではFを唯一のフィッティングパラメータとして残します(Rはすべての力レベルで共有され、正確な値は結果に大きく影響しないため、簡単にするためにRを1,400 nmに固定します)。必要に応じて、カメラベースの画像取得によるモーションブラーとエイリアシングを考慮する必要がありますが38,39ですが、5 kbpテザーを使用した1 kHzを超える高速測定では、この影響はごくわずかです。
  8. さらにいくつかのコンストラクトについて、手順2.4〜2.7を繰り返します。3〜5種類のビーズを調べて、磁気ビーズ間の力の変動を平均化します。
    注:平均化のための適切な構成数を決定するために、使用中の磁気ビーズ間の力の変動を考慮する必要があります。このばらつきは小さいが、市販品31であっても、測定力に1pN以上の誤差を生じ得る。関係する力の絶対的な決定が重要ではないほとんどのアプリケーションでは、3〜5個のビーズのキャリブレーション結果を平均するだけで十分です。この変動を説明する別の方法は、実験の開始時に個々のテザーで力を測定することですが、これには時間がかかる場合があります。別の選択肢は、既知の力レベルで解凍するヘアピン構造を各構成体31に埋め込むことである。
  9. 測定された力を磁石の距離の関数としてプロットし、式(2)を使用してデータ(図4F)に二重指数関数を当てはめます。
    figure-protocol-7(4)
    ここで、F0(ベースライン)、A1とA2(振幅)、およびd1とd2(減衰定数)はフィッティングパラメータです。2つの方法の力の値と、結果として得られる二重指数適合がほぼ一致することを確認します(図2F、G)。
    注意: 力のキャリブレーションが適切に行われていることを確認するには、伸張と測定された力をプロットして、プローブされた構成の力と伸長の関係を確認します。
  10. 磁気ビーズ30,31の力依存的な傾きに起因するビード高さオフセットzoffを補正するには、式(5)を用いてビード半径を有する中心外れテザーの形状を考慮して、横方向オフセットxoffからzoffを推定し、その値を測定された延長値に適用する。この手順は、MATLAB スクリプト "force calibration.m" (252 行目から 254 行目) に実装されています。
    figure-protocol-8(5)
    注:この補正は、特に回転半径が小さい(<200 nm)ビーズの場合、伸長に小さな変更を加えますが、図2Hから図2I30,31への変化に見られるように、このオフセットは弾性応答に重大な影響を与えることがよくあります。
  11. 永続性の長さ Lp を確認するには、拡張可能な WLC モデルを式 (6) を使用してデータに適合させます。
    figure-protocol-9(6)
    ここで、L0は輪郭長(5kbpの場合は1.7μm)、K0はエンタルピー延伸の弾性率である。
    注:dsDNAのLpは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの典型的な緩衝液では40〜50 nmであることが広く受け入れられていますが、短分子(<5 kbp)に適用されるWLC式は、L0が31,40減少するにつれてLpを体系的に過小評価します。これは、従来の WLC モデルでは、鎖長が持続長よりも十分に長いポリマーを想定しているためです。ここでは、5 kbpコンストラクトについてLp = 40 ± 3 nmが得られ(図2H)、伸長補正によりさらに1,100 ± 200 pNの均質なK0が得られました(図2I)。有限WLCモデル31,40を適用し、拡張分布41における非ガウス性の補正を適用すると、Lpがわずかに増加します。
  12. 力のキャリブレーションが検証されたら、得られた二重指数モデルのフィットパラメータを付属のLabVIEWソフトウェア(補足ファイル2)に適用し、ソフトウェアがモータの読み取り値(磁石の位置など)からリアルタイムで電流を計算するのを待ちます。逆関数 d(F) の解析式は利用できないため、d目標力水準の数値推定により、0.1 pNステップで d 対 F のルックアップ表を用意する。このテーブルをソフトウェアにも保存して、力制御を指揮します。

3. DNAヘアピンの合成

注:MT実験用のDNAヘアピンコンストラクトは、λ-DNAの510 bp領域を2つのカスタムプライマーでPCR増幅することによって調製され、そのうちの1つは5'末端にヘアピン構造を含みます(図3A)。このようにして、ヘアピンモチーフがPCR産物の一端に配置される。

  1. プライマーを準備します。
    1. フォワードプライマー:ガラス表面付着用に5′-ビオチン標識され、λ-DNAに結合するプライマー B_hp。このプライマーは、8 bpのステムと6 ntのループ(λ結合領域に5')を持つヘアピンモチーフを含んでいます。
    2. リバースプライマー:磁気ビーズ付着用に5′-アジド標識され、フォワードプライマーから1 kbp離れたλ-DNAに結合するプライマー Z_hp。
  2. λ-DNA(テンプレート)、nTaqポリメラーゼ、および標準PCR条件でPCRをセットアップして実行します( 表1を参照)。市販の精製キットで製品をクリーンアップします。
  3. 260 nm(A260)でのUV吸収によりDNA濃度を測定し、アガロースゲル電気泳動(2%ゲル)( 表2参照)を行い、製品サイズを検証します。標準的な収率は、~35 μLの~600 nM溶液です。

4. SNAREタンパク質の調製

注:ニューロンSNARE複合体は、 大腸菌から発現した3つの精製ラットタンパク質(VAMP2/シナプトブレビン-2、シンタキシン-1A、およびSNAP-25)を組み合わせることによって組み立てられます(図3B)。それらの組み立てを容易にするために、シンタキシンとSNAP-25はVAMP2フラグメント(N末端領域を欠く、「ΔN-VAMP2」と呼ばれる)と「ΔN-複合体」と呼ばれる構造に共発現され、DNAハンドル付着後に完全長VAMP2と混合されて完全な複合体を形成します。

  1. SNAREタンパク質を発現させるためのcDNAを含むプラスミドを調製します(すべてのプラスミドのDNA配列は 材料表に記載されています)。
    1. 膜貫通ドメインを欠く6×Hisタグ付きVAMP2を調製する(2-97;ジスルフィド結合のL32C/I97C)をpET28aベクターにクローニングした。
    2. Habcおよび膜貫通ドメイン(ジスルフィド結合の191-267、I202C/I266C置換)を欠失したシンタキシン-1Aを、6×Hisタグ付きΔN-VAMP2(49-96)とともにpETDuet-1ベクターに調製します。
    3. 完全長SNAP-25アイソフォームb(2-206、全てのCからA)をpET28aベクターにクローニングして調製する。これはΔN錯体の調製に使用されます。
    4. 6×Hisタグ付き完全長SNAP-25アイソフォームb(1-206、すべてのCからA)をpET28aベクターにクローニングして、MTアッセイバッファーに直接添加し、展開後にSNARE複合体を再構成できるように調製します。
  2. ロゼッタ(DE3)大腸菌細胞の2本のチューブを準備し ます。 1つのグループをVAMP2プラスミドで形質転換し(ステップ4.1.1から)、1つのグループをシンタキシン-1A/ΔN-VAMP2とタグなしSNAP-25プラスミド(ステップ4.1.2および4.1.3から)の両方でΔN複合体を発現させ、もう1つのグループをHisタグ付きSNAP-25プラスミドで形質転換します(ステップ4.1.4から)。
  3. 形質転換細胞を適切な抗生物質(ここでは、VAMP2およびHisタグ付きSNAP-25の場合はカナマイシンおよびクロラムフェニコール、ΔN複合体の場合はカナマイシン、クロラムフェニコール、およびアンピシリン)を用いてLuria-Bertaniブロス(LB)に移します。ブロスの光学密度(OD)が0.7〜0.9に達するまで、振とうインキュベーター(220 rpm)で37°Cでそれらを成長させます。
  4. 1 mMイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えてタンパク質発現を誘導し、細胞を振とうインキュベーター(220 rpm)で37°Cで3〜4時間インキュベートします。
  5. 培養物を4,500 × g で4°Cで15分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。
  6. タンパク質精製用のバッファーを調製します( 表2を参照)。
  7. SNARE発現細胞ペレットを40mLの氷冷溶解バッファーに懸濁し、氷上で超音波処理することによって細胞を溶解する(15%振幅、5秒オンおよび5秒オフ、合計30分)。
  8. ライセートを15,000 × g で4°Cで30分間遠心分離し、不溶性物質を除去します。
  9. 上清を1 mLのNi-NTA樹脂を充填した重力カラムに通します。レジンを洗浄バッファーAで洗浄し、次に洗浄バッファーBで洗浄し、10 mLの溶出バッファーでタンパク質を溶出します。
  10. 脱塩カラムを使用して、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)とイミダゾールを溶離液から除去します(製造元の指示に従ってください)。サンプルをPBSで溶出します。
  11. 遠心フィルター(カットオフ 10 kDa)でタンパク質を PBS (通常 2 mL 生成) に維持しながら、~70 μM まで濃縮します。タンパク質濃度は、280 nm(A280)での紫外線(UV)吸収またはブラッドフォードアッセイのいずれかによって測定します。
  12. 少量のアリコートを準備し、液体窒素で瞬間凍結し、使用するまで-80°Cで保存します。
    注:完全なSNARE複合体は、DNAハンドル上でΔN複合体を結合させた後に組み立てられます(下記参照)。

5. DNAハンドルの付着

注:片末端に第一級アミン基を含む2つの510 bp dsDNAハンドルを最初にPCRによって調製し、次に二官能性架橋剤SM(PEG)2を使用してアミン基をマレイミド基に変換します。次に、2つのハンドルは、部位特異的結合のためにシステイン基 を介して SNARE複合体に共有結合で結合されます(図3B)。

  1. プライマーを準備します。
    1. フォワードプライマーの準備:ガラス表面付着用に5′-ビオチン標識され、λ-DNAに結合するプライマーB(ハンドルBを増幅するため)。プライマーZ(ハンドルZを増幅用)は、磁気ビーズ付着用に5′-アジド標識され、プライマーBと同じ配列を有する。
    2. リバースプライマーを準備します:タンパク質結合用に5′-アミン標識され、フォワード プライマーから510 bp離れたλ-DNAに結合するプライマーN(ハンドルBとハンドルZで共有)。
  2. λ-DNA(テンプレート)、nTaqポリメラーゼ、および標準PCR条件( 表1を参照)を使用して、2セットのPCR反応(各ハンドルに200 μL反応の18チューブ)をセットアップして実行します。PCRクリーンアップキットで製品をクリーンアップし、各ハンドルを45 μLの超純水で溶出します。後のステップで効果的な反応のために高濃度のハンドルを得るために、最小限の量の水を使用してください。
  3. A260によりDNA濃度を測定する。標準的な収率は、各ハンドルあたり~650 μLの~2 μM溶液です。アガロースゲル電気泳動で後で検証できるように、少量のサンプルを離して保管してください。
  4. 各ハンドル (PBS 中 1 μM) を 5 mMM(PEG)2 と反応させます。穏やかに回転しながら室温でインキュベートします。1時間後、DNA精製キットを使用して未反応のSM(PEG)2を除去します。各ハンドルを250 μLのPBSで溶出して、~2 μMの溶液を得ます。
  5. ハンドルBとΔN複合体の溶液を1:16のモル比で混合し(例:1 μMハンドルBと16 μMのΔN複合体)、撹拌しながら室温で2時間インキュベートします。アガロースゲル電気泳動用の少量のサンプルを離してください。
  6. 前のステップで使用したΔN錯体に対して2.5倍のモル過剰量のVAMP2の溶液を追加します。混合物を撹拌しながら室温でさらに1時間インキュベートする。フルSNARE複合体は、このステップで組み立てられます。
  7. 新鮮なPBSおよび遠心フィルター(100 kDaカットオフ)とのバッファー交換により遊離タンパク質を除去します:14,000 × g で4°Cで5分間遠心分離し、少なくとも6回繰り返し、最後のスピンのために15分間実行します。A260/A280比の増加を測定して、遊離タンパク質の除去を監視します。アガロースゲル電気泳動用の少量のサンプルを離してください。
  8. ハンドルZをハンドルBの15倍モル過剰で溶液に加え、反応を促進するためにハンドルZの濃度を少なくとも1μM以上に保ちます。混合物を撹拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。
  9. 中間体(ハンドルBとそのタンパク質コンジュゲート)と最終生成物(2つのハンドルを持つSNARE複合体)をアガロースゲル電気泳動(図3B、挿入図)で確認します( 表2を参照)。
    注:タンパク質がハンドルBに正常に結合すると、移動度シフトが検出されます。特に、DNAハンドル上での完全なSNARE複合体の形成は、SDSで分解され、DNAにシンタキシンのみが結合したままになるΔN複合体とは異なり、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に対する耐性によって確認できます( 図3Bのbとcを比較してください)。
  10. 少量のアリコートを準備し、液体窒素で瞬間凍結し、使用するまで-80°Cで保存します。
    注:最終溶液には未反応のハンドルが含まれていますが、フローセルでのサンプルアセンブリ中に、ビオチンとアジドで二重に標識された目的のコンストラクトのみが選択されます。

6. フローセルの製作

注:MT測定用のフローセルは、両面テープで接着された2つのガラスカバースリップで構成されています(図3C)。1つのカバーガラスは、PEGとビオチン化ポリエチレングリコール(PEG)の混合物でコーティングされており、非特異的結合を回避し、ビオチン-ニュートラアビジン結合 を介した 標的分子の特異的テザリングを可能にします(図3D)。次に、MT実験用材料の溶液をシリンジポンプを用いてフローセルに順次注入します(図3C、D)。

  1. ガラスカバーガラスを上面(24mm×50mm、厚さ1.5番)と底面(24mm×60mm、厚さ1.5番)にそれぞれ1枚ずつ用意します。30分間1 M KOHで超音波処理によってカバーガラスをきれいにします。超音波処理後、カバーガラスを蒸留水ですすぎ、次のステップまで水中に保ちます。
  2. PEGylateは、公開されているプロトコル42,43に従って下部カバースリップを塗ります。シラン化にはN-[3-(トリメトキシシリル)プロピル]エチレンジアミンを使用し、100 mM重炭酸塩バッファー中のビオチン-PEG-SVAとmPEG-SVAの1:100(ww)混合物を使用します。PEG化カバーガラスを-20°Cで乾いた状態に保ち、数週間保管します。
  3. 実験当日、PEG化カバーガラスを取り出し、窒素ガンでブロー乾燥します。汚れがないか目視検査して、汚れがないことを確認します。
  4. サンプルチャンネルを作成するには、~2 mm幅の両面テープを用意し、4つのストリップを下部カバースリップ(PEG化面を上にして)に平行に、互いに~5 mm離して置きます(図3C)。
    注:このようにして、1つのフローセルに3つの5 mm幅のサンプルチャンネルを作成できます。
  5. 下部カバースリップの中央に上部カバースリップを置き、短い方の端にチャネルの入口と出口用のスペースを~5 mm残します。トップカバースリップの背面をピンセットでそっと押して、チャネルをしっかりと密閉します。
  6. インレットリザーバーを作成するには、200 μLのピペットチップの端を切り取ります。広い開口部から~10 mmを切り取り、~200 μLの溶液を保持できるようにします。3つの流路用に3つ作成します。出口を構成するには、シリンジポンプのチューブに適合する3本のシリンジ針を準備します。
  7. 5分間のエポキシを使用して、リザーバーとニードルハブをフローセルに接着します。漏れを防ぐために完全なシールが形成されていること、およびチャネルが余分な接着剤で塞がれていないことを確認してください。少なくとも30分間乾燥させます。

7.ビーズテザー構造の組み立て

注:ビーズテザーコンストラクト用のものを含むMT実験用の材料の溶液は、シリンジポンプを使用してフローセルに順次導入されます(図3C、D)。

  1. 磁気ビーズを準備します。ストック溶液から5 mgのM270-エポキシビーズ(167.5 μLのジメチルホルムアミド中の~3.3 ×10 8 ビーズ)を取り出し、ビーズの磁気分離により溶媒をリン酸緩衝液( 表2参照)と交換します。
  2. 1 M硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液中で、ビーズを~1.1 × 109 mL−1 で調製し、2 mMジベンゾシクロオクチン(DBCO)-NH2と反応させます。混合物を室温の回転ミキサーで3時間インキュベートします。反応後、ビーズを新鮮なリン酸緩衝液で3倍洗浄し、未反応分子を除去します。
    注:洗浄されたビーズは、使用前に数週間、4°Cで余分な回転なしで保管できます。
  3. フローセルチャネル出口の針をポリエチレンチューブでシリンジポンプに接続します。PBSでチャネルを平衡化します。
  4. ポンプで吸引することにより、次の溶液をチャネルに順次導入します:ニュートラアビジン、ターゲットコンストラクト(DNAヘアピンまたはDNAハンドルを持つSNARE複合体)、リファレンスポリスチレンビーズ、およびDBCOコーティングされた磁気ビーズ。使用前に、ビーズ溶液を完全にボルテックスして、潜在的なビーズ凝集体を分散させます。
  5. 0.1pNの力を加えながら、結合していないビーズを洗い流します。
    注意: 小さな上向きの力を加えると、結合していないビーズの除去が容易になり、特別に結合したビーズテザー構造の破裂を回避するのに役立ちます。
  6. SNARE複合体を用いた実験では、最終バッファーに1.5 μM SNAP-25を含めます。
    注:遊離SNAP-25分子は、アンフォールディング後にSNARE複合体を再結合し、単一の複合体で繰り返し測定することができます。

8. ターゲットコンストラクトの同定

  1. フローセルチャネルの表面で、ターゲット構築物の単一分子によってつながれている磁気ビーズを検索します。参照ビーズが近くにあることを確認してください。
  2. 候補ビードを回転させ、自由に回転することを確認します。ビーズが複数の分子によってつながれている場合、ビーズは拘束された動きを示します。
  3. ビードを数回回転させ、回転半径を調べます(この機能は付属のソフトウェアに実装されています)。好ましくは、回転半径の小さいビードを選択する。
    注:この半径は、ビード−テザーアセンブリ30,31の間にランダムに決定されるテザー軸からビードがどれだけ中心からずれているかを示す。すべての実験において、ビードの最小限のオフセンタリングは、使用する高いビード半径対テザー伸長比に関連する多くのアーティファクトを軽減します。
  4. 力を0から5 pNに増やして、良好なシングルテザービーズを特定します。1 kbpのテザー(または同等の2つの510 bpハンドル)の伸張に起因するビーズの回折パターンの大きな変化を探します。回折パターンが大きく変化しない場合は、力をゼロに下げて、別の候補ビーズをスキャンします。
    注:ビードの~300 nmの浮き上がりは、実際にトラッキングプロセスを開始しなくても、生の画像からすぐにわかります。

9. 伸展測定のためのビードトラッキング

メモ: ビーズの追跡は、この記事に付属のLabVIEWソフトウェアでビーズ画像をリアルタイムで解析することによって実行されます。追跡方法およびその変形は、従来のMTシステムのほとんどで使用されており、以前の文献2、5、7、26で説明されている。固定基準ビーズに対する磁気ビーズの位置を測定する(すなわち、差動トラッキング)ことにより、位置測定は外部摂動に対して非常にロバストになります。

  1. 適切な磁気ビーズが基準ビーズと一緒に配置されたら、[ キャリブレーション ]ボタンをクリックしてビードトラッキングの準備を開始します。
  2. 画像内のビーズをクリックして、ビーズの位置を定義します。次に、画像をビーズの周囲の関心領域(ROI)(たとえば、3 μmビーズの場合は150 x 150ピクセル)にトリミングし、さらに分析して正確なビード座標を抽出します。
  3. 磁石の回転が完了するのを待ちます。このプロセスは、ビーズ31の中心から外れた取り付けを記録するために磁石を回転させながら、ビーズのx座標およびy座標を(2D相互相関44を計算することによって、またはビード画像の半径方向対称性45を使用することによって、同等の性能で)記録する。
  4. z方向でトラッキングするには、焦点面から異なる距離にあるビーズの回折画像のルックアップテーブルがソフトウェアによって生成されるのを待ちます。これは、対物レンズをピエゾスキャナーで等距離にステップアップし、各位置で変動平均ビード画像を記録することによって行われます。次に、実際の実験におけるビーズのz座標は、リアルタイムのビーズ画像を補間7でルックアップテーブルと比較することによって決定されます。
  5. ルックアップテーブルの生成が終了したら、トラッキングとオートフォーカスを有効にします(トラックとAFを押しますか?ボタン)をクリックし、[取得]ボタンをクリックしてビード位置の記録を開始します。
    メモ:オートフォーカスはオプションですが、集録中の z 単位のステージドリフトを補正することをお勧めします。

10.強制適用スキーム

  1. フォースランプ実験: 構成体の力と伸展の関係を確認するには、一定の荷重速度(± 1.0 pN s−1)で力ランプを上下に適用します(図4A)。たとえば、0-20-0 pN サイクルを 3 回適用して、構成の全長とハンドルの力-伸展曲線を確認します。
  2. ソフトウェアでテザーパラメータを指定することで、測定データの上にWLC力延長曲線を重ね合わせ、ターゲットビーズが適切なDNAハンドルを備えた本物のサンプルコンストラクトによってつながれているかどうかを判断します。コンストラクトの既知の輪郭長(例:1 kbp dsDNAの場合は~340 nm)およびWLC持続長(短いdsDNA31の場合は30〜45 nm)を開始点として使用します。必要に応じて、手順2.11で説明した拡張子の修正方法を適用します。
  3. コンストラクトが検証されたら、力伸長応答を詳細に調べて、標的分子-ヘアピンまたはSNARE複合体に起因する追加の伸長を探します。
  4. コンスタントフォース実験: 加えられる力を個別のステップで徐々に変化させて、標的分子の力感度を調べます(図4B)。
    注:MTは、磁石が静止しているときに加えられた力が一定に保たれるため、簡単で効果的な定力実験を可能にします。
    1. DNAヘアピンの場合、0.2〜0.5 pNステップで4〜8 pNの力を加え、各力レベルで~10秒間ビーズの位置を測定します。
    2. SNARE複合体の場合は、0.1〜0.2 pNステップで14〜16 pNの力を加え、各力レベルで~10秒間ビード位置を測定します。
  5. フォースジャンプ実験: SNARE複合体の遷移事象を観察する。
    注:フォースジャンプ実験は、コンスタントフォース実験と同様に、フォースレベルの変化を伴います。ただし、フォースジャンプは、加えられた力のより急激な変化を採用し、タンパク質複合体の突然の破裂など、プローブされた分子内の力によって引き起こされるイベントを監視できます。例えば、SNARE複合体はフォースサイクル23において構造ヒステリシスを示すので、フォースジャンプ実験を行い、遷移までの潜時を測定することは有益である(図4C)。
    1. 解凍： 無傷の三元SNARE複合体からVAMP2分子を剥離し、シンタキシン-1AおよびSNAP-25のバイナリ複合体を残す。
    2. 再圧縮: 解凍したVAMP2分子をジッピングして、無傷のSNARE複合体を再生します。
      1. 展開： SNAP-25の完全な解離を伴うSNARE複合体の完全な分解。VAMP2およびシンタキシン分子のみが、展開後にコンストラクトに残ります。
      2. リフォールディング： バッファーからの遊離SNAP-25分子の結合によるSNARE複合体の再生。
  6. 2 pNで、遊離SNAP25分子の会合を待機(~30秒)することにより、無傷のSNARE複合体の集合を誘導します。SNARE複合体の形成時に伸長の急激な減少が観察される。
  7. 解凍イベントを観察するには、10〜12 pNで数秒待ってから、可能な限り最大モーター速度で突然14〜15 pNに移動します。ターゲットの力に応じて、SNARE複合体は、部分的に解凍された中間体間の可逆的な遷移(一定の力の実験のように)またはランダムな待機時間(または遅延)の後に~25nmのより高い解凍状態へのジャンプのいずれかを示します。
  8. 再圧縮イベントを観察するには、解凍が観察された直後に力を10〜12pNに下げます。ここでも、SNAREコンプレックスは、ランダムなレイテンシーの後、より低いジッパー状態への確率的遷移を示します。解凍後に展開が発生した場合、SNAP-25分子が失われるため、複合体は再圧縮に失敗します。
  9. 展開イベントを観察するには、解凍が観察された後、さらに長い期間待って、伸展のさらなる増加(~2 nm)を検出します。

11.データ分析

注:MTデータを使用して実行できる分析の種類は、ターゲットシステムによって異なります。ただし、 図 4 で説明したそれぞれの実験から有用な情報を抽出するには、一般的な方法があります。すべての分析は、この記事で提供されているカスタムコードを使用してMATLAB(R2021a)で実行されます。これらのコードは、この記事で紹介したのと同じデータを使用してプロットを生成します。100 Hzトラッキングの生データは分析のために直接取得されましたが、1.2 kHzトラッキングからのデータは通常、ノイズを低減するために分析前に中央値フィルタリング(5ポイントのスライディングウィンドウを使用)されたことに注意してください(ノイズ分析を除く)。

  1. フォースランプ実験: 力と伸長の関係(ポリマーの弾性など)を解析し、力を遷移させてナノメカニカル特性の情報を抽出します。
  2. コンスタントフォース実験: 状態集団と滞留時間(または遷移率)を力の関数として分析し、構造変化の構造(遷移に関与する領域など)、熱力学的(自由エネルギー差など)、および運動(エネルギー障壁など)パラメータを抽出します。
  3. フォースジャンプ実験: 破裂速度論(タンパク質間相互作用や受容体-リガンド結合など)や一過性中間体の寿命(生体分子のアンフォールディングなど)を分析して、標的分子の安定性とその状態を抽出します。
  4. 代表的なアプリケーションとして、DNAヘアピンおよびSNARE複合体のサンプルデータを分析します。
    1. DNAヘアピンの2状態遷移: 解凍力、開口距離、集団シフトの力依存性、隠れマルコフモデル(HMM)による状態割り当てと遷移率の測定(MATLABコードを提供)。
    2. SNARE複合体のコンフォメーション変化: アンジップ力、中間状態の力依存性とアンジップ待ち時間、リジップのヒステリシス、アンフォールド/リフォールディング挙動。
      注:DNAハンドル、DNAヘアピン、およびSNARE複合体立体配座の力拡張モデルは、以前の参考文献14,31に記載されています。

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結果

力のキャリブレーション
2つの力測定方法(ビーズの横方向変位分散とパワースペクトル分析)の結果は、0〜2pN異なりました(図2G)。 図2Fの結果によると、通常のネオジム磁石で最大30pNまで確実に到達できます。

8 bp DNAヘアピンの2状態遷移
まず、短いDNAヘアピンのナノメカニクスを調べました(図5)。DNAヘアピンは、従来の単一分子力分光法によって広範囲に特徴付けられているため、比較するための膨大な参照ソースが利用可能です。短いヘアピンの解凍は通常可逆的であるため、その再圧縮イベントは、解凍が発生するのと同じ力の範囲でも観察されます(図5A)。0 pNと20 pNの間のフォースランプを適用することにより(図5B

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ディスカッション

本研究では、生体分子の構造変化を高い時空間精度で観察できる1分子力分光装置を導入しました。高速CMOSカメラは、1,280 x 1,024の解像度で1,200フレーム- 1を取得し、1.2kHzのビーズトラッキングを可能にします。ただし、現在、測定速度はビーズトラッキングソフトウェアによって制限されているため、高速測定ではROIは通常、より小さな領域に低下します。SLDの高出力は、最大数kHzの帯域幅までの高速ビーズイメージングに不可欠な明るい照明を提供します。さらに、ビームの空間コヒーレンスは、ビーズの周りに高コントラストの同心円状の回折リングを生成し(図1A、挿入図)、対称性に基づいてビードの位置を正確に決定することができます。

ビーズ−テザー構築物に及ぼされる磁力は、テザービーズ35、37、38のブラウン揺らぎ...

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開示事項

著者には、宣言する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、韓国政府(MSIT)が資金提供する韓国国立研究財団(NRF)の助成金(NRF-2022R1C1C1012176、NRF-2021R1A4A1031754、およびNRF-2021R1A6A1A10042944)の支援を受けました。S.-H.R.はNRF助成金(2021R1C1C2009717)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コンストラクト合成のための材料
アガロースゲル電気泳動システムAdvanceMupid-2plus
DNAラダーバイオニアD-1037
nTaqポリメラーゼ酵素P050A
PCR精製キットLaboPassCMR0112
PEGylatedSMCC架橋剤 / SM(PEG)2ThermoFisher Scientific22102SNARE–DNAカップリング
Primer BBioneer5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3'For5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hpIDT5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTTattt
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		ヘアピンコンストラクト
Primer NBioneer5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3'ForDNA handles
プライマーZバイオニア5'-アジド/TCGCCACCATCATTTCCA-3'DNAハンドル用
プライマー Z_5kバイオニア5'-アジド/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'5-kbp		フォースキャリブレーションコンストラクト
プライマーZ_hp バイオニア5'-アジド/GTGGCAGCATGACACC-3'ヘアピンコンストラクト
SYBR Safe DNA ゲル染色サーモフィッシャーScientificS33102
λ-DNABioneerD-2510
SNAREタンパク質のPCRDNA配列用テンプレート鎖
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タンパク質精製用材料
2-メルカプトエタノールSIGMAM3148-25ML
寒天LPS 溶液AGA500
アンピシリン、ナトリウム塩PLS AC1043-005-00
クロラムフェニコールPLSCR1023-050-00
コンピテントセル (大腸菌)Novagen70956ロゼッタ(DE3)pLysS
グリセロールSIGMAG5516-500ML
HEPESSIGMAH4034-100G
塩酸/HClSIGMA320331-500ML
イミダゾールSIGMAI2399-100G
イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド/IPTGSIGMA
硫酸カナマイシンPLSKC1001-005-02
ルリア・ベルタニ(LB)ブロスLPS溶液LB-05
Ni-NTA樹脂キアゲン30210
PD MiniTrap G-25 (脱塩カラム)CytivaGE28-9180-07手順については、以下を参照してください。 https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
フェニルメチルスルホニルフッ化物/ PMSFサーモフィッシャーサイエンティフィック36978
家でクローニングされたSNAREタンパク質用プラスミドN/Aご要望に応じて利用可能
プロテアーゼ阻害剤genDEPOTP3100
ナトリウムSIGMAS5886-500G
リン酸二塩基性ナトリウム / Na2HPO4SIGMAS7907-100G
リン酸ナトリウム一塩基性 / NaH2PO4SIGMAS3139-250G
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン / TCEPSIGMAC4706-2G
トリズマベースSIGMAT1503-250G
サンプルアセンブリ用材料
ビオチン-PEG-SVALAYSANBIO-PEG-SVA-5K-100MG &MPEG-SVA-5K-1gPEG化
用 ジベンゾシクロオクチン-アミン/DBCO-NH2SIGMA761540-10MGビーズコーティング用
両面テープ3M136フローセルアセンブリ用
エポキシ接着剤DEVCONS-208フローセルアセンブリ用
底面用ガラスカバースリップVWR48393-251長方形、60回;24 mm、#1.5
上面用ガラス カバーガラスVWR48393-241長方形、50回;24 mm、#1.5
磁気ビーズThermoFisher Scientific14301Dynabeads M-270 エポキシ、2.8 μm
mPEG-SVALAYSAN BIOmPEG-SVA 1gPEG化用
N,N-ジメチルホルムアミド/DMFSIGMAD4551-250MLビーズコーティング用
N-[3-(トリメトキシシリル)プロピル]エチレンジアミンSIGMA104884-100MLPEG化用
ニュートラビジンサーモフィッシャーサイエンティフィック31000サンプルテザリング用
リン酸緩衝生理食塩水/PBS、pH 7.2PLSPR2007-100-00
プラスチックシリンジNorm-jectA55 ml、ルアーチップ
ポリエチレンチューブSCIBB31695-PE/4PE-60
リファレンスビーズSPHEROTECHSVP-30-5ストレプトアビジンコーティングポリスチレン粒子; 3.0-3.4 & マイクロ;m
シリンジ針Kovax21G-1 1/4''21 G
シリンジポンプKD SCIENTIFIC788210
磁気ピンセット装置用機器
1軸電動マイクロトランスレーションステージPIM-126.PD1磁石の垂直位置決め用
2軸手動平行移動ステージST1LEE400光軸への磁石のアライメント用
磁石用アクリルホルダーDaiKwang 精密注文ご要望に応じて図面作成可能
フレームグラバーアクティブシリコンAS-FBD-4XCXP6-2PE8
高速CMOSカメラMikrotronEoSens 3CXP
倒立顕微鏡オリンパスIX73P2F-1-2
ネオジム磁石LG磁石ND 10x10x12t寸法:10 mm × 10 mm × 12 mm; 2 必要な
対物レンズオリンパスUPLXAPO100XO油浸、NA 1.45
対物レンズ ナノポジショナーMad City LabsNano-F100S
回転ステッパーモーターAUTONICSA3K-S545W回転磁石用
スーパールミネッセントダイオードQPHOTONICSQSDM-680-2680 nm
Software
LabVIEWNational Instrumentsv20.0f1
MATLABMathWorksv2021a
10724815001カクテル 塩化

参考文献

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