ヒト神経構築物の埋め込み3D印刷のためのミクロゲル-細胞外マトリックス複合サポート

サマリー

この研究では、自己修復アニーリング可能な粒子-細胞外マトリックス複合材料内の神経幹細胞の自由形状埋め込み3D印刷のプロトコルについて説明します。このプロトコルは、相互接続されたヒト神経組織構築物のプログラム可能なパターニングを高い忠実度で可能にします。

要約

顆粒状サポート培地内の細胞の埋め込み3D印刷は、軟組織構築物のフリーフォームバイオファブリケーションのための強力なアプローチとして過去10年間に登場しました。しかしながら、粒状ゲル製剤は、大量のヒドロゲル微粒子の費用効果の高い生成を可能にする限られた数の生体材料に制限されてきた。したがって、顆粒状ゲル支持培地は、一般に、天然の細胞外マトリックス(ECM)に見られる細胞接着性および細胞指示機能を欠いていた。

これに対処するために、自己修復アニール可能な粒子-細胞外マトリックス(SHAPE)複合材料を生成するための方法論が開発されました。SHAPEコンポジットは、顆粒相(ミクロゲル)と連続相(粘性ECM溶液)で構成されており、これらを組み合わせることで、プログラム可能な高忠実度印刷と調整可能な生体機能細胞外環境の両方が可能になります。この研究は、開発された方法論がヒト神経構築物の正確なバイオファブリケーションにどのように役立つかを説明しています。

まず、SHAPEコンポジットの粒状成分であるアルギン酸微粒子を作製し、コラーゲンベースの連続成分と組み合わせます。次に、ヒト神経幹細胞を支持体材料の内部に印刷し、続いて支持体のアニーリングを行う。印刷された構築物は、印刷された細胞のニューロンへの分化を可能にするために数週間維持することができる。同時に、コラーゲン連続相は軸索伸長および領域の相互接続を可能にする。最後に、この作品は、生細胞蛍光イメージングと免疫細胞化学を実行して、3Dプリントされたヒト神経構造を特徴付ける方法に関する情報を提供します。

概要

in vitroで軟組織を模倣する細胞を含んだヒドロゲル構築物の正確でプログラム可能な3D印刷は、大きな課題を提示します。例えば、軟質ヒドロゲルの直接押出に基づく試みは、in vivo微小環境を再現するために必要な貧弱な機械的特性が構造的完全性の欠如、事前定義された特徴の変形、または製造された構造の完全な崩壊につながるため、本質的に問題がある。この問題の従来の回避策は、最終的な構築物がその形状を維持できるようにする、より硬い生体適合性材料から支持足場を印刷することです。ただし、このアプローチでは設計の可能性が大幅に制限され、隣接するインクのレオロジーの微調整が慎重に必要になります。

従来のレイヤーごとの押出ベースの3D印刷の限界を克服するために、埋め込み3D印刷は、ソフトマテリアルおよびティッシュ製造の強力な代替手段として近年登場しています1,2,3,4,5,6。表面の上部にある周囲空気中にインクを押し出す代わりに、インクは、静止時には固体状であるが、移動する針先の周りで可逆的に流動し、軟細胞を含んだ材料の正確な堆積を可能にするサポートバス内のシリンジ針を介して直接堆積される。堆積した材料は、針の結果として支持体が再固化するにつれて所定の位置に保たれる。そのため、組み込み3D印刷により、ソフトバイオマテリアルからの複雑な構造の高解像度の自由形状製造が可能になり、設計の可能性が広がります^7,8。

粒状ゲルは、低収率応力9,10,11で滑らかで局所化された可逆的な固液転移を示すように配合できるため、埋め込み3D印刷用のサポートバス材料として広く研究されてきました。それらは高解像度印刷のための優れたレオロジー特性を示しますが、粒状ゲルは少数の生体材料に限定されてきました¹²。バルクヒドロゲル製剤に利用可能な幅広い生体材料を考慮すると特に明白である粒状ゲル製剤の多様性の欠如は、単純な化学を使用して多数のミクロゲルを費用効果の高い方法で生成する必要があることによって引き起こされます。顆粒状ゲル支持体の生体材料ランドスケープが限られているため、印刷支持体によって提供される細胞外微小環境のチューニングは、この分野での課題を提示します。

最近、自己修復アニール可能な粒子-細胞外マトリックス(SHAPE)複合材料と呼ばれる組み込み3D印刷サポートの生成のためのモジュラーアプローチが開発されました¹³。このアプローチは、粒状ゲルの明確なレオロジー特性とバルクヒドロゲル製剤の生体機能の多様性を組み合わせたものです。提示されたSHAPEコンポジット支持体は、充填されたアルギン酸微粒子(顆粒相、~70%体積分率)と、粘性コラーゲンベースのECMプリゲル溶液(連続相、~30%体積分率)で満たされた格子間空間の増加で構成されています。さらに、SHAPE支持体はヒト神経幹細胞(hNSC)の高分解能沈着を促進し、支持体浴のアニーリング後、ニューロンに分化し、機能的成熟に達するまで数週間維持することができることが示されている。SHAPEサポートバス内に埋め込まれた3D印刷は、汎用性の高いプラットフォームを提供しながら、神経組織のバイオファブリケーションのための従来の技術に関連する主要な制限のいくつかを克服します。

この研究では、SHAPE支持体内に埋め込まれたhNSCの埋め込み3Dプリントの手順と、その後の機能的ニューロンへの分化について詳述しています(図1)。まず、アルギン酸微粒子は、内部ゲル化中のせん断 を介して 生成されます。このアプローチにより、特殊な装置や細胞毒性試薬を必要とせずに、大量の微粒子を簡単に生成できます。さらに、アルギン酸塩は、多様な細胞タイプの生体適合性ヒドロゲル基質を形成するための広く利用可能で経済的な材料源です。生成したアルギン酸微粒子をコラーゲン溶液と結合させてSHAPE複合担体材料を形成する。次に、hNSCを回収し、3D印刷用のセルラーバイオインクとして注射器に装填します。3Dバイオプリンターは、SHAPEコンポジット内のhNSCの押出ベースの埋め込み印刷に使用されます。3Dプリントされた細胞はニューロンに分化し、空間的に定義された機能的なヒト神経構築物を生み出します。最後に、プロトコルは、生細胞イメージングと免疫細胞化学を使用して、生成された組織構築物をどのように特徴付けることができるかを説明します。さらに、最適化とトラブルシューティングのヒントも提供されます。特に、顆粒相および連続相の両方の成分を他のヒドロゲル製剤と交換して、神経用途を超えた他の細胞および組織タイプによって必要とされるように、異なる生体機能部分、機械的特性、および架橋メカニズムに対応することができた。

プロトコル

1. 緩衝液および試薬の調製

1. L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを含む次のサプリメントをDMEM/F12に添加して細胞増殖培地を調製します:30 mMグルコース、5 μM HEPES、0.5%w/v脂質リッチウシ血清アルブミン、40 μM L-アラニン、40 μM L-アスパラギン一水和物、40 μM L-アスパラギン酸、40 μM L-グルタミン酸、40 μM L-プロリン、1%N2サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および上皮成長因子(EGF)と線維芽細胞増殖因子(FGF)の各20 ng/L。これらの手順は、層流(LAF)ベンチで実行します。
2. 超純水中で1%w/vアルギン酸塩溶液を調製し、60°Cで4時間激しく攪拌します。 溶解した高温アルギン酸塩溶液を、LAFベンチ内の0.45 μmの細孔サイズフィルターで滅菌ろ過します。4°Cで保存してください。
   注意: アルギン酸塩溶液の温度が60°C未満の場合、フィルターを通過させることはできません。
3. 超純水中で37 g/L NaHCO₃ 溶液を調製します。NaOHを用いて溶液のpHを9.5に調整し、LAFベンチでフィルター滅菌します。溶液を4°Cで保存します。

2.形状複合材料の準備

1. アルギン酸微粒子生成
   1. 滅菌ビーカー中の超純水中で2 mg/mLの_CaCO3 溶液を調製します。アルギン酸塩溶液と1:1で混合し、マグネチックスターラーを用いて室温で1時間攪拌する。
   2. 酢酸を1:500の比率で加え、650rpmで一晩攪拌します。
      注意: アルギン酸塩溶液はすぐにゲル化を開始します。成形ゲルの最適で均質な攪拌を確実にするために、使用するガラス製品の直径と同じ長さの攪拌磁石を使用してください。翌日、ゲル化中の攪拌 によって 生成された溶液は粘性に見えます(図2A)。
   3. ゲル化したアルギン酸塩溶液を、LAFベンチに設置したホモジナイザーで15,000 rpmで10分間ホモジナイズすることにより、機械的に微粒子に断片化します(図2B)。
   4. 微粒子を18,500 × g で室温で20分間遠心分離します(図2C)。
   5. LAFベンチ内の上清を注意深く廃棄し、2 mM NaOHおよび1% P/Sを含むDMEMに粒子を再懸濁し、4°Cで一晩インキュベートします(図2D)。
      注意: サスペンションの色は赤に戻るはずです。懸濁液が黄色のままの場合は、NaOHを滴下し、赤くなるまで混合します(図2E)。
   6. 粒子を15,000 rpmで3分間ホモジナイズし、室温で18,500 × g で10分間遠心分離します。
   7. ペレットを観察し(図2F)、上清を注意深く取り除きます。
      注:密に充填されたアルギン酸微粒子のペレットは、さらに使用するまで4°Cで保存できます。アルギン酸塩溶液がフィルター滅菌されていない場合は、微粒子を1週間以内に使い切る必要があります。
2. シェイプコンポジット製剤
   1. 印刷の前日に、ALGINATE微粒子ペレットを4%HEPES(1 Mストック)および4%NaHCO₃ 溶液を含む2倍の容量の成長培地にLAFベンチに再懸濁し、室温で一晩インキュベートします。
   2. ミクロゲル懸濁液を18,500 × g で室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄します。
   3. ALGベンチでアルギン酸微粒子と混合するコラーゲンを中和します。コラーゲンストック溶液を最終濃度1 mg / mLに達するように希釈し、4%HEPESと4%NaHCO₃を加えて中和します。例えば、3 mLのSHAPE複合材料の場合、2 mLのアルギン酸微粒子を1 mLの中和コラーゲン(0.12 mLのHEPES、0.12 mLのNaHCO₃、0.16 mLの増殖培地、および0.6 mLのコラーゲン)と混合します。
      注意: コラーゲンと混合されるすべての材料は、コラーゲンの重合を避けるために氷上で取り扱う必要があります。コラーゲンが中和されるとすぐに、重合はゆっくりと始まります。
   4. アルギン酸微粒子ペレットと希釈および中和コラーゲンを2:1の比率で混合することにより、SHAPE複合材料を生成します。LAFベンチで氷上でゆっくりと上下にピペッティングして、ゲルを完全に混合します。
      注意: サポート材に気泡が導入されるため、ボルテックスはしないでください。
   5. LAFベンチで、生成された複合材料を冷却されたマイクロウェルプレートまたは任意の適切な印刷容器に移し、30分以内に使用します(図3E、F)。

3. hNSC培養およびバイオインク調製

1. 増殖培地中の基底膜エキスコートT75フラスコで細胞を培養する。3Dプリント実験に使用する前に、解凍後に少なくとも2回細胞を継代します。
2. 印刷する前に、0.025%トリプシン溶液を用いて37°Cで5分間酵素的に細胞を解離し、増殖培地でトリプシンを中和し、細胞懸濁液を400 × g で室温で5分間遠心分離します。遠心分離に続いて、上清を吸引し、ペレットを2〜3mLの増殖培地に再懸濁する。
3. 細胞カウントを行い、細胞を400 × gで遠心分離し、0.1%キサンタンガム(細胞の沈降を防ぐため)を添加した増殖培地にペレットを最終濃度9 × 10⁶ cells/mLで再懸濁します。
4. 21 Gの鈍い金属針を使用して、100 μLの密に充填されたアルギン酸微粒子をシリンジに入れます(図3A)。
   注:アルギン酸微粒子でプラグを作成することは、印刷中の押し出し安定性を維持するのに役立ち、ロードされたセルラーインクの完全な押し出しを可能にします(デッドボリュームなし)。
5. 同じ針を使用して、調製した細胞懸濁液をシリンジにロードします(図3B)。
   注意: シリンジの装填手順中に気泡が発生しないように特に注意してください。気泡は印刷中に不安定になります。
6. ローディングニードルを、印刷に使用する27Gの鈍い金属ニードルと交換します(図3C)。

4.組み込み3D印刷

1. 参照されているソフトウェアを使用して、印刷する構造を設計します(材料表を参照)。
   注意: 印刷構造の初期高さをSHAPEコンポジットサポートの深さ内に調整してください。設計の提案は 、図4A (スパイラルおよびウッドパイル設計)にあります。
2. [ 生成]をクリックしてGコードを生成します。
3. 細胞を含んだガラスシリンジを、押出ベースのバイオプリンターの容積測定押出ヘッドに挿入します(図3D)。
4. 細胞を含んだガラス製シリンジの針の長さを測定するには、 針の長さの測定をクリックします。
5. SHAPEコンポジットをロードしたマイクロウェルプレートまたは容器をプリンターに置きます。
   注:支持体の早期架橋を防ぐために、印刷するまでセルプレートまたは容器を4°Cに保ちます。
6. SHM(表面高さ測定)をクリックして、SHAPEゲルがロードされているのと同じマイクロウェルプレートまたは容器内の空のウェルの表面高さを測定します。
   注:または、針でウェルの高さを測定して、表面の高さを手動で決定します。
7. 押出速度を3.6 μL/分、送り速度を0.3 mm/sに設定します。
   注意: 印刷する前に、必ず押し出しをテストしてください。細胞の沈降はノズルの目詰まりを引き起こす可能性があり、実際の埋め込み印刷の前に少量を事前に押し出すか、容積式シリンジに収縮ボリュームを追加することで回避できます。場合によっては、インクの引きずりを避けるために、針がSHAPEゲルに挿入または出るときに送り速度を 0.5 mm / s未満 に保つ必要があります。
8. Gコードをプリンターのユーザーインターフェイスにロードします。
   注意: 設計された構造に変更が加えられるたびに、新しいGコードを生成する必要があります。
9. [実行]をクリックして印刷手順を開始します(図3G)。
10. 印刷直後、SHAPEゲルを細胞培養インキュベーター内に37°Cで30分間入れ、アニーリングを行った。
11. アニールしたSHAPEゲル支持体の上に増殖培地を穏やかに加えます。
12. 翌日、増殖培地を次のように処方された分化培地と交換します:DMEM/F12、L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、30 mMグルコース、5 μM HEPES、0.5%w/v脂質リッチウシ血清アルブミン、40 μM L-アラニン、40 μM L-アスパラギン一水和物、40 μM L-アスパラギン酸、40 μM L-グルタミン酸、40 μM L-プロリン、1%N2サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、100 μMジブチリル-環状アデノシン一リン酸(ジブチリル-cAMP)、 2 ng/mLグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)。
    注意: 培地の交換中にヒドロゲルを損傷しないように注意してください。プレートを傾け、古い培地をそっと取り除きます。新鮮な培地をゲルの真上ではなく、ゲルを含むウェルの壁に滴下して加えます。アスピレーターを使用してメディアを取り除かないでください。
13. 実験エンドポイントまで2日ごとに分化培地をリフレッシュする。

5. 生細胞蛍光イメージング

1. ゲルから余分な培地を取り除きます。
2. 等量の20 μMカルセインAM(ストック溶液から分化培地で希釈)をサポートゲルの容量に加えます。
3. 37°Cで40分間インキュベートします。
4. カルセインAM溶液を取り出し、適切な量の新鮮な分化培地を加えます。
5. プレートを顕微鏡に移してイメージングします。

6. 免疫細胞化学

1. ゲルから余分な培地を取り除きます。
2. 小さなヘラを使用して、DPBSを含む大きな容器にゲルを移します。
3. DPBSで毎回20分間3回洗浄し、プレートをドラフトに移します。
4. DPBSを除去し、ゲルを覆うのに十分な4%ホルムアルデヒド溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。
5. 毎回20分間DPBSで3回洗ってください。
6. DPBSで5%ロバ血清、0.25%洗剤、および0.02%アジ化ナトリウムからなるブロッキング溶液を調製します。
   注:ゲルを覆うのに必要な量の3倍を準備します。これは、後で一次および二次抗体溶液の基礎として使用されます。
7. DPBSで洗浄した後、ブロッキング溶液をゲルに加え、非特異的結合を防ぐために室温で6時間インキュベートします。プレートをそっと揺り動かします。
8. TUBB3抗体をブロッキング溶液で1:1,000の比率で希釈して、一次抗体溶液を調製します。
9. ゲルからブロッキング溶液を除去し、一次抗体溶液を加えて、4°Cで48時間インキュベートします。 プレートをそっと揺り動かします。
10. 毎回20分間DPBSで3回洗ってください。
11. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、1:1,000)と二次抗体(1:200)をブロッキング溶液で希釈して二次抗体溶液を調製します。
12. DPBSで洗浄した後、二次抗体溶液中のゲルを4°Cで24時間インキュベートします。 プレートをそっと揺り動かします。
13. DPBSで毎回20分間3回洗浄し、イメージングするまで4°Cで保存します。
14. イメージングする前に、ヘラで染色したゲルを薄いイメージング底部の皿またはウェルプレートに移します。

結果

内部ゲル化中の剪断薄化とそれに続く機械的断片化 を介した アルギン酸塩ミクロゲル調製は、 図2Gに見られるように、サイズが多分散し、フレーク状形状のアルギン酸塩ミクロゲルをもたらす。これらの不規則な粒子のサイズは、直径が1μm未満から約40μmの範囲です。しっかりと充填すると、微粒子は、対応する細胞培養培地よりもわずかに不透明な透明なバルク材料を形成します(図2F)。サポート材料の透明性は、培養期間中の印刷構造の視覚化、および生細胞色素と免疫細胞化学 の両方で 標識されたコンストラクトの高解像度共焦点顕微鏡を可能にするため、プラットフォームの重要な側面です。緩衝細胞培養培地に浸すと、得られたpH調整ゲルは赤色になり、生理学的条件を示します(図2F)。アルギン酸微粒子のpHを中和することは、2つの理由から重要である。酸性微粒子は細胞に直接害を及ぼす可能性があります。さらに、酸性環境は、コラーゲン重合を妨げるため、SHAPE複合支持体のアニーリングの成功を妨げます。

上記のパラメータを使用してhNSCインクを印刷すると、直径~200μmのセルのフィラメントが得られます(図4A)。プログラムされたジオメトリは、1つの平面で印刷する場合と、構造を互いに重ねて印刷する場合の両方で保持されます。多層印刷の場合、印刷された構造はそのまま残り、最小層間距離は200μmです¹³。細胞の生存率は、インクの調製および押し出し中に大きな影響を受けてはなりません。印刷されたストランドは、丸い形態を有する生細胞が豊富である(図4B、左)。印刷されたストランドのギャップは、製造された構造が印刷直後に変形を示さない場合でも、印刷の翌日に現れる可能性があります。これはおそらく支持体の不均一な混合の結果である。細胞はアルギン酸微粒子と相互作用しないため、アルギン酸塩に富む領域からコラーゲンおよび細胞に富む領域に向かって移動し、印刷された鎖に切断を引き起こします。さらに、エアポケットが印刷の忠実度を妨げる可能性があるため、SHAPEサポートは気泡がないようにする必要があります。

hNSCの分化に成功すると、印刷後30日でニューロンに富む構造が得られ、細胞は小さな細胞体と細長い突起を持つニューロン形態を示します(図4B、右)。さらに、長方形の細胞シートなどの密なパターンが印刷されている場合、分化中に形成される目に見えるギャップや凝集体はなく、細胞の連続した層はそのまま残るはずです(図4C)。このプロトコルでは、3Dプリントされたサンプルの蛍光免疫細胞化学の手順について説明します。細胞質神経マーカーであるTUBB3の染色により、生成された神経ネットワークを直接可視化することができます。分化したプリントの蛍光顕微鏡観察により、TUBB3が豊富で形状が維持された構造が明らかになります(図4D、左)。分化プロセス中、DAPIで細胞核を染色することによって観察できるように、細胞は印刷された鎖から移動しません(図4D、中央)。その結果、ニューロンの体は印刷された幾何学の境界内で観察され、軸索突起は構築物を囲むSHAPE支持体に数百マイクロメートルを発する。周囲の体積の軸索探査は、SHAPEサポートが軸索経路探索を可能にする生体機能的手がかりを提供することを示している。より成熟したニューロンマーカーまたはサブタイプ特異的マーカーを免疫細胞化学において使用して、生成されたニューロン集団をさらに特徴付けることができる。さらに、印刷されたニューロン構築物は、RT-qPCRまたは電気生理学を用いて特徴付けることができた¹³。ただし、どちらのアプローチでも、ヒドロゲル層がRNA抽出とマイクロピペットによる細胞への物理的アクセスの両方を妨げるため、コラゲナーゼを使用してコラーゲンを除去する必要があります。

図1:SHAPE埋め込み印刷アプローチの概念図。 コラーゲン溶液をアルギン酸微粒子と混合してSHAPE複合材料を形成します。SHAPEコンポジットは、アニールされた支持体内でニューロンに分化するhNSCの埋め込み3D印刷のサポート材料として使用されます。SHAPEコンポジットの生体機能特性により、ニューロンは突起を伸ばし、支持体の空の部分に軸索投影を移入することができます。この図はKajtez et ^al.13から修正されたものである。略語:SHAPE =自己修復アニーラブル粒子-細胞外マトリックス;hNSCs=ヒト神経幹細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:アルギン酸微粒子の調製 。 (a)一晩ゲル化させた後のアルギン酸塩溶液。(b)均質化により生成したアルギネート微粒子。(c)遠心分離後の粒子ペレット。(d)pH調整前およびpH調整後にペレットをDMEM(E)に再懸濁する。(f)培地中で一晩インキュベートした後の微粒子を遠心分離する。(g)作製したアルギン酸塩微粒子の明視野像。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:3D印刷プロセスの準備。 (A)スラリープラグ(~100μL)をシリンジに装填し、続いて(B)細胞バイオインクを装填する(ここでは視覚化のために着色ビーズを補充する)。(C)インク装填に使用される円錐形のプラスチックチップ(21 G)を27 Gの鈍い金属針チップに置き換えます。(D)シリンジを3Dプリントヘッドに挿入します。(E,F)SHAPEコンポジットを48ウェルプレートのウェルにピペットで入れます。SHAPEコンポジットを備えたチューブは、取り扱われていないときは氷上に保たれます。(g)印刷針先をSHAPE支持体に挿入し、コンピュータ設計で定義された経路の印刷を開始する(ここでは、らせん状の印刷を描いている)。略語:SHAPE =自己修復アニーラブル粒子-細胞外マトリックス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:SHAPEコンポジットサポート内の3Dプリントされた神経構造 。 (A)支持体ヒドロゲル内の印刷されたhNSCの明視野画像。スパイラル(左)とウッドパイル(右)の構造物のデザインが表示されます。(B)プリントの翌日(左)と神経分化後(右)の3Dプリントされたコンストラクトの生細胞イメージング。(C)スパチュラで培養井戸から取り出した3Dプリントされた正方形の構造物は、構造的完全性を示します。(D)ニューロンマーカー(TUBB3)および対比染色核(DAPI)で免疫標識された同じ正方形構築物の蛍光共焦点画像は、3Dプリントされた構築物内のhNSCの鑑別の成功を確認します。スケールバー= 500 μm(A、右);100 μm (B、D)この図のパネル C および D は、Kajtezら¹³から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

SHAPE複合材料アプローチは、セルラーインクの埋め込み3D印刷用のアニール可能および生体機能サポートバスの製剤化のための汎用性の高いルートを提供します。このプロトコルは神経構築物の3Dプリントの例を提供しますが、SHAPEツールボックスは、さまざまな標的組織タイプの正確なエンジニアリングのために、他の細胞源とのバイオファブリケーションに簡単に適合させることができます。印刷アプローチはまた、複数の細胞タイプの正確なパターン化を可能にして、それらの相互作用を研究したり、細胞コンパートメント(ニューロンやグリア細胞など)の定義された空間配置で組織を設計したりすることもできます。従来の粒状ゲルとは対照的に、SHAPEコンポジットは拡張された間質空間(このプロトコルで提示された製剤の~30%体積分率)を含んでいます。粒状成分は、高解像度の埋め込み印刷に有利な材料特性を複合材料に提供するレオロジー調整剤として機能します。これにより、同じ粒状成分を維持しながら連続成分の処方を変更することにより、細胞の微小環境の合理的な設計への道が開かれます。例えば、他の機能性ECM分子(ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチンなど)をサポートバスに導入したり、異なる架橋メカニズム(酵素、光ベースなど)を利用したりすることができます¹³。さらに、顆粒成分中のアルギン酸塩は、異なるヒドロゲル材料(例えば、ゼラチン⁸、ポリエチレングリコール^14,15、アガロース¹⁶)からの微粒子で置き換えることができ、または異なる組織工学または疾患モデリングアプリケーションのニーズに沿って異なるサイズおよび形状で製造することができる。粒状フェーズと連続フェーズの比率は、個々の3D印刷プロジェクトのニーズに応じて調整できますが、連続フェーズを30%以上に増やすと、印刷の忠実度と解像度が低下する可能性があります。

ミクロゲル製造工程の間、酢酸を添加した後のアルギン酸塩溶液の撹拌がゲル化溶液の体積全体にわたって有効であることが重要である。攪拌速度が低すぎるか、マグネチックスターラーが小さすぎると、攪拌が溶液の上層に到達せず、大量の架橋バルクヒドロゲルになり、下層がせん断されます。一貫性のないせん断されたアルギン酸ヒドロゲルの均質化は、3D印刷用途に最適ではないアルギン酸微粒子の生成をもたらす。さらに、アルギン酸微粒子は、不均一な混合物がコラーゲンを欠く支持材料のパッチをもたらすので、コラーゲン溶液と完全に混合する必要がある。これらのパッチはアニールされないため、細胞インタラクティブ機能が不足します。アルギン酸微粒子を欠いているため、印刷をサポートしていないパッチもある可能性があります。したがって、不均一に混合された印刷サポートは、忠実度の高い印刷をサポートできず、ボリューム全体でアニールされないため、構造的に損なわれます。気泡は細胞に有害である可能性があるためではなく、エアポケットが印刷中に変形を引き起こし、構造のイメージングを妨げる可能性があるため、気泡も避ける必要があります。気泡の一般的な発生源は、ボルテックス(37°Cでの支持体アニーリング中に膨張するコールド支持体内のマイクロバブル)と激しいピペッティングの2つです。

この研究におけるSHAPE複合支持体は、印刷後に除去される犠牲材料としてではなく、幹細胞の分化と神経細胞の成長および機能的成熟の両方のための長期的な生体機能支持体として処方された。アニーリングされたSHAPE複合材料の構造安定性と透明性は、印刷後にアニールされていない粒状ゲルと比較して、固定および免疫標識のプロセス中に繊細なニューロンの特徴を保護する環境を提供するため、抗原の視覚化 による 形態学的特性評価を容易にします。蛍光レポーターは、時間の経過に伴う細胞形態の変化を追跡したり、アニールされた印刷支持体内での細胞の増殖と移動をモニターしたりするためにも使用できます。さらに、カルシウムイメージングアプローチを使用して、自発的な細胞活動(例えば、ニューロンの活動電位の発火、さらには同期ニューロンネットワーク活動)に関する情報を提供することができます。しかしながら、操作された細胞構築物の化学的刺激(例えば、KClを用いたニューロン刺激)は、細胞を取り囲むヒドロゲル層のために困難であり、拡散を遅くし、細胞微小環境の瞬間的な調節を妨げる。光遺伝学的刺激は、SHAPEヒドロゲルが細胞への光学的アクセスを妨げないため、細胞活性の制御のためのより良い選択肢を提示する。

酸素感受性ビーズをバイオインクまたは担体材料に(複合調製中の直接印刷または分散を介して )組み込んで、印刷されたコンストラクトの内部および周囲の酸素張力レベルの生きた空間的および時間的マッピングを高感度で可能にする^{ことができます13}。リン光寿命測定に基づくこの非侵襲的な3D酸素マッピングアプローチは、酸素化が改善され、栄養供給も改善された組織構築物のエンジニアリングへのルートを提供します。酸素化が不十分な場合、印刷されたコンストラクト内に壊死領域が形成され、幹細胞の分化が妨げられ、ニューロン代謝に影響を与える可能性があります。酸素マッピングは、3D印刷設計を変更して、構築物全体で均一な酸素化、生理学的条件に一致する酸素レベルの微調整、または酸素勾配の生成を促進するための読み出しを提供します。

設計されたチャネルは、低温サポートバス内で固化するゼラチンなどの犠牲インクを印刷することにより、アニール可能な印刷サポート内に組み込むこともできますが、37°C ^4,13で簡単に排気できます。チャネルは、設計ベースの酸素張力操作アプローチの能力を超える高い細胞密度または寸法の組織構築物に栄養素と酸素を供給するために必要になります。さらに、血管様チャネルを利用して、細胞同一性のパターン形成を促進し、細胞活動を調節し、または走化性を導く小分子の勾配を作成することができます。

要約すると、SHAPEコンポジット内の組み込み3D印刷は、簡単に適応でき、機械的に敏感な組織の機能モデリングに用途の広い可能性を秘めたモジュラー材料プラットフォームを提供します。ここで紹介するプロトコルは、サポート材料を生成し、セルラーインクを高忠実度で印刷するために必要な手順と基本原則の詳細な説明を提供します。このアプローチは、手頃な価格の材料とアクセス可能な機器を利用しながら、個々の研究者のニーズとアプリケーションへのアプローチをパーソナライズする余地を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL ガスシーチートシリンジ 1001 TLL	ハミルトン	81320
3DDiscovery 3Dバイオプリンター	レゲンHU
酢酸	シグマ・オルドリッチ	A6283
アルブマックス	サーモフィッシャー	11020021
Alexa フルオナ488二次抗体	サーモフィッシャー	A-11001	ヤギ対ネズミ
鈍針、ステリカン(21g)	ブラウン	9180109
鈍針(27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCADソフトウェア	SolidWorks
カルセインAM	サーモフィッシャー	65-0853-39
炭酸カルシウム	シグマ・オルドリッチ	C5929
ジブチルル-cAMP ナトリウム塩	シグマ・オルドリッチ	D0627
カルトレックスラットコラーゲンI(5 mg/mL)	R&Dシステムズ	3440-100-01
ダピ	サーモフィッシャー	62248
DMEM/F-12、グルタマックス	サーモフィッシャー	10565018
ロバ血清	シグマ・オルドリッチ	D9663
DPBS	サーモフィッシャー	14190094
EGF	R&Dシステムズ	236-EG
FGF	R&Dシステムズ	3718-FB
ホルムアルデヒド溶液4%、緩衝、pH 6.9	シグマ・オルドリッチ	100496
GDNF	R&Dシステムズ	212-GD
ゲルトレックス	サーモフィッシャー	A1569601
グルコース	シグマ・オルドリッチ	G7021
HEPESバッファー(1 m)	サーモフィッシャー	15630080
L-アラニン	シグマ・オルドリッチ	5129
L-アスパラギン一水和物	シグマ・オルドリッチ	A4284
L-アスパラギン酸	シグマ・オルドリッチ	A9256
L-グルタミン酸	シグマ・オルドリッチ	G1251
L-プロリン	シグマ・オルドリッチ	P0380
磁気攪拌RETベーシック	イカ	3622000
N-2補足	サーモフィッシャー	17502048
ペニシリン・ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122
S25N-10G分散ツール	イカ	4447100
アルギン酸ナトリウム(80-120 cP)	富士フイルム 和光	194-13321
アジ化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S2002
重炭酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S5761
水酸化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S5881
T18デジタルULTRA-TURAXホモジナイザー	イカ	3720000
トライトン X-100	シグマ・オルドリッチ	X100
トリプシン/EDTAソリューション	サーモフィッシャー	R001100
TUBB3抗体	バイオレジェンド	801213	マウス
キサンタンガム	シグマ・オルドリッチ	G1253