ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ

Summary

マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。この原稿の目的は、 Trichoderma stromaticum conidiaで刺激されたヒト末梢血単核由来マクロファージの食作用とクリアランス能力を評価する方法を提示することです。

Abstract

マクロファージは重要な防衛線であり、さまざまな組織における病原体の増殖とコロニー形成を防ぐ役割を担っています。分生子食作用は、マクロファージと病原体の相互作用に関与する細胞質および分子イベントの調査、および内在化された分生子の死亡時期の決定を可能にする重要なプロセスです。マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。食作用の回避とファゴソームの脱出は、真菌の病原性のメカニズムです。本稿では、生物防除・バイオ肥料剤として利用され、ヒトへの感染を誘発する真菌である T. stromaticum conidiaの食作用、クリアランス、生存率の解析に用いる手法について報告する。プロトコルは、1) トリコデルマ 培養、2)分生子を得るための洗浄、3)ポリスクロース溶液法を使用した末梢血単核細胞(PBMC)の隔離とマクロファージへのPBMCの微分、4)丸いガラスカバースリップと着色を使用した 生体外 食作用法、および5)分生子食作用後の分生子の生存率を評価するためのクリアランスアッセイで構成されています。要約すると、これらの技術は、マクロファージの真菌クリアランス効率を測定するために使用できます。

Introduction

トリコデルマ属(目:Hypocreales、科:Hypocreaceae)は、他の真菌種の寄生虫であり、商業的に有用な酵素の範囲を生産することができる遍在する腐生菌で構成されています¹。これらの真菌種は、異種タンパク質の生産^2、セルロース³、エタノール、ビール、ワイン、紙の生産⁴、繊維産業⁵、食品産業⁶、農業の生物的防除剤^7,8として使用されています。これらの真菌種に対する産業上の関心に加えて、ヒトにおける感染数の増加により、一部のトリコデルマ種は日和見病原体の地位を得ています⁹。

Trichoderma spp.は培養で急速に成長し、最初は白と綿のコロニーが緑がかった黄色から濃い緑色に変わります¹⁰。それらは広範囲のpHおよび温度条件で生息するように適応しており、日和見種は生理学的pHおよび温度で生き残ることができるため、さまざまなヒト組織にコロニーを形成します11,12,13。重要なことは、トリコデルマ属菌の感染率の上昇は病原性因子と関連している可能性があり、これらは十分に研究されていないことです。さらに、日和見トリコデルマ種に対する免疫応答の理解に焦点を当てた研究はまだまれです。

感染中、好中球とともに、マクロファージは食作用の原因となる防御線を表し、したがって、異なる組織における病原体の増殖およびコロニー形成を防止する。Toll様受容体やC型レクチン受容体などのパターン認識受容体を用いて、マクロファージは貪食菌をファゴリソソームに加工し、呼吸バースト、炎症誘発性サイトカインの放出、および食作用微生物の破壊を促進する¹⁴。しかし、食作用のメカニズムは、真菌細胞のサイズや形状など、さまざまな微生物戦略の影響を受け、回避される可能性があります。食作用を妨げるカプセルの存在。食作用誘導受容体の数を減少させる。細胞質におけるアクチン線維の構造のリモデリング。仮足の形成を妨げる。ファゴソームまたはファゴリソソームは、食作用プロセス後に脱出する¹⁴。

クリプトコッカス・ネオフォルマンスを含む多くの病原体は、マクロファージをニッチとして利用し、宿主内で生存し、播種し、感染を誘発する¹⁵。食作用およびクリアランスアッセイは、病原体に対する免疫応答を評価し、自然免疫系を回避するために採用された微生物戦略を特定するために使用されます15,16,17。この種の手法は、真菌の殺傷を減少させる食作用、ファゴソームの酸性化の遅延、および酸化的バーストの動態の違いを調べるためにも使用できます¹⁸。

貪食、真菌の生存、およびファゴソーム成熟過程の回避を評価するために、さまざまな方法を使用することができる。これらには、貪食、細胞位置、および食作用中に生成される分子を観察するために使用される蛍光顕微鏡法が含まれます¹⁹。フローサイトメトリーは、食作用に関する定量的データを提供し、プロセスに関与するさまざまなマーカーを評価するために使用されます^20,21。生体内顕微鏡検査は、微生物の捕捉とファゴソームの成熟を評価するために使用されます²²。病原体の食作用過程の特異性を評価するために使用される抗体媒介性食作用²³;その他24,25,26,27。

ここに示されるプロトコルは真菌の分生子の食作用そして殺害を評価するのに光学顕微鏡および版の成長の試金を使用して共通の、安価、および直接方法を採用する。このプロトコルは、T. stromaticumに曝露されたヒト末梢血単核由来マクロファージを使用して食作用およびクリアランスアッセイを行うためのステップバイステップの指示を読者に提供します。PBMCが使用されたのは、トリコデルマ分生子が植物病原体に対する生物防除および植物作物のバイオ肥料として世界中で適用されており、トリコデルモ症と呼ばれるいくつかのヒト感染症を引き起こしているためです。それ以外に、トリコデルマ分生子とヒトの免疫系との相互作用に焦点を当てた先行研究は2つしかなく、マクロファージの好中球²⁸とオートファジー29を調べました。本稿では、まずPBMC由来のマクロファージによるT. stromaticumの分生子の貪食を研究し、次に、巻き込まれた分生子の生存率を簡単な顕微鏡ベースの技術を用いて評価する方法を示します。このプロトコルは、マクロファージ関連の免疫応答または免疫系の調節関連メカニズムの研究をさらに促進する可能性があります。

Protocol

倫理的配慮と人間的対象
この研究で説明されている人間を用いたすべての実験は、ヘルシンキ宣言およびブラジル連邦法に従って実施され、サンタクルス州立大学の倫理委員会(プロジェクト識別コード:550.382 / 2014)によって承認されました。

ヒト末梢血は、ブラジルのバイーア州イリェウス市の健康なボランティアから収集され、研究された真菌に関連する職業活動にさらされていません。健康状態が報告されている、または薬を使用している個人は除外されました。すべての被験者は自発的に参加することに同意し、この研究に含める前にインフォームドコンセントフォームに署名しました。

1. 試薬・溶液の調製

注:先に進む前に、以下の試薬と溶液を調製してください。試薬および材料サプライヤー情報については、 材料表 (TOM)を参照してください。

1. バランスの取れた滅菌リン酸緩衝生理食塩水1x(PBS)を調製します。
   注:このプロトコルでは、エンドトキシンフリーPBSは使用されませんでした。
2. ジャガイモデキストロース寒天(PDA)培地を調製し、 T. stromaticum 培養用の各ペトリ皿に20 mLを注ぎます。ドナーごとにPDAを含むプレートを6枚用意し、3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間ごとに1枚のプレートを使用します。さらに、各コントロールに3枚のプレート( トリコデルマ コントロールに3枚、R10ミディアムコントロールに3枚)を使用します。60 mm x 15 mmまたは100 mm x 15 mmのペトリ皿を使用して、分生子を最適に回収してください。
3. 100%グリセロールを滅菌します。
4. 細胞培養用のR10培地を調製します:10%ウシ胎児血清と1%抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン)を添加したRPMI培地。
5. 細胞溶解のために蒸留水を滅菌します。
6. 着色プロセスのためにpH7.0の水を準備します。
   注:必要に応じて、pH メーターと 0.1 M/L NaOH および 0.1 M/L HCl の溶液を使用して pH を調整します。
7. 丸いガラスカバーガラス(13 mm)とピンセットを滅菌します。

2. Trichoderma stromaticumの培養と加工

1. T. stromaticumの母株(M1)の調製:
   注:すべての実験が同じ新世代(F1)の培養物から行われるようにするには、マザーストック(M1)が必要です。
   1. 分生子が観察され、培養物が緑色に変わるまで、暗所で28°CのPDAを使用して7〜10日間、ペトリ皿で T.stromaticum 接種菌を増殖させます。
   2. T. stromaticumの培養液を洗浄します。ピペットを使用して培養表面に3〜5 mLのPBSを加えます。プレートからPBSを回収し、再び培養液に分注し、ピペットを使用して分生子を徐々に除去します。サスペンションが濃い緑色に変わるまで、このプロセスを必要なだけ繰り返します。
      注:あるいは、3〜5 mLのPBSをプレートに加え、懸濁液が緑色に変わるまで円を描くように動かして分生子を回収し、培養物を穏やかに洗浄することをお勧めします。ピペッティングを繰り返すことで、より多くの分生子を採取することができます。
   3. 回収した懸濁液をプレートからピペットで15 mLの滅菌チューブに移します。手順2.1.2〜2.1.3を必要な回数だけ繰り返して、より多くの分生子を取得します。
   4. 懸濁液を1,160 x g で12°Cで5分間遠心分離し、ペレットを5 mLのPBSに再懸濁します。この手順(2.1.4)を3回繰り返して、菌糸のない懸濁液を取得します。
      注:遠心分離後にペレットを適切に再懸濁するには、短時間のボルテックスをお勧めします。
   5. 最終ペレットを2〜3 mLのPBSに再懸濁し、1:100または1:1,000の希釈液を使用してノイバウアーチャンバーで分生子をカウントします。
      注:最適な条件では、2 x 10⁸ 分生子/mLの最終濃度を培養物から回収できます。 トリパンブルー除外法を使用した分生子の生存率の評価はオプションです。
   6. 各チューブに分生子懸濁液(ステップ2.1.5から)0.5 mLを加えて、懸濁液を1.5 mL滅菌チューブに分注します。次に、0.5 mL の滅菌済み 100% グリセロールを添加して M1 ストックを得ます。ボルテックスを短時間観察し、チューブを特定し、-20°Cまたは-80°Cで保存します。
2. T. stromaticumの培養と実験のための分生子の取得
   1. M1懸濁液(ステップ2.1で調製)10μLをPDAにプレートし、分生子が観察され、培養物が緑色に変わるまで、暗所で28°Cで7〜10日間、新鮮なF1生成を得る。
      注:実験用の新鮮な T.ストロマティカム 培養を確実にするために、真菌の増殖に必要な時間とマクロファージの分化に必要な時間を評価します。
   2. 手順2.1.2-2.1.4を繰り返して、分生子を収集します。
   3. 最終ペレットを2〜3 mLのPBSに再懸濁します。トリパンブルー除外法を使用して分生子の生存率を評価するか、ステップ2.1.5で説明したように分生子をカウントします。

3.末梢血単核細胞(PBMC)の分離

注:PBMC は、密度 1.077 g/mL³⁰ のポリスクロース溶液を使用した密度バリア法によって得られます。

1. 採取するドナーサンプルごとに、15 mL のポリスクロース溶液を 1 本の 50 mL チューブに分注します。
2. 3〜4本のEDTAチューブを使用して、各ドナーから20 mLの血液を採取します。実験ごとに最低 4 人のドナーを募集します。ドナーの血液をプールしないでください。代わりに、各サンプルを生物学的複製として別々に使用してください。ドナーごとに、血液を1本の50 mLチューブに移し、PBSを添加して最終容量の35 mLにします。
3. 血液懸濁液(ステップ3.2)をポリスクロース溶液を含むチューブの壁に沿ってゆっくりと移し(ステップ3.1)、二相性懸濁液を形成します。
   注意: ポリスクロース溶液と血液の混合を防ぐために、血液をゆっくりと加えてください。PBMCの分離には、各ドナーから最低7 mLの血液を使用することをお勧めします。
4. 二相性懸濁液の入ったチューブを1,600 x g で直ちに遠心分離し、24°Cで30分間加熱します。 PBMC の遠心分離をプログラムする: 遠心分離が突然停止しないように、加速度 1 と減速 0 を使用します。
5. 遠心分離後にPBMCを含む白いリングが形成されるのを観察します。赤血球と顆粒球は下層に存在し、次の層にはポリスクロース溶液が含まれ、PBMCはポリスクロース溶液と血漿の間の白いリング(上層)に存在します。赤血球、血漿、またはポリスクロース溶液をキャッチしないように、ピペットまたは滅菌パスツールピペットを使用して穏やかに吸引して白いリングを回収し、1本の15 mLチューブに移します。
6. PBMC を含む 15 mL チューブに PBS を添加し、最終容量 10 mL にします。懸濁液を均質化し、チューブを 1,600 x g で 24 °C で 30 分間遠心分離します。
7. 1,600 x g で 24 °C で 5 分間、10 mL の PBS で細胞を 3 回洗浄します。次に、最終ペレットを2 mLのR10培地に再懸濁します。
8. トリパンブルー排除法を用いて細胞生存率を評価し、ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントします。

4. 食作用態

注:ヒト末梢血単核由来マクロファージは、T . stromaticum conidiaで1:10の感染多重度(MOI)または対照としてR10培地のみで処理されます。感染の多重度(MOI)は、感染ターゲットに追加される感染性病原体の比率を表し、絶対数で表されます:MOI = agents:targets³¹。ここでは、10個のマクロファージ(標的)に対して1 T. stromaticum conidia (薬剤)を使用します。次に、細胞を37°Cおよび5%_CO2 で異なる期間(3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、および120時間)インキュベートします。次に、丸いガラスのカバーガラスを使用して、食作用プロセスに関与する付着マクロファージを顕微鏡で視覚化します。実験計画図が提供されています(図1)。

注:24ウェルプレートの使用をお勧めします。

1. T. stromaticum conidiaによるヒト由来マクロファージの処理
   1. 滅菌ピンセットを使用して、滅菌済みの丸いガラスカバーガラス(13 mm)を各ウェルに追加します。
   2. ステップ3.7〜3.8で得られた細胞懸濁液の容量を調整して、R10培地で最終容量1mLになるようにウェルあたり8 x 10⁵ 細胞を播種します。倒立顕微鏡を使用して、細胞の形態を評価します。
      注:細胞は培地に懸濁され、丸みを帯びた形態を持っている必要があります。
   3. 細胞を5%_CO2 雰囲気下で37°Cで7日間インキュベートし、単球をマクロファージに分化させるために、2日ごとに培地を新しいR10培地と交換します³²。倒立顕微鏡で細胞の形態を観察します。マクロファージは、扁平で伸びた形状の紡錘状の形態を示します。細胞質化比の増加および仮足の存在も観察することができる。付着した単核由来のマクロファージを探します。
      注:未分化な単球のごく一部が培地に懸濁したままである可能性があります。
   4. ピペットを使用して各ウェルの培地を除去し、1 mLのPBSで細胞を洗浄して、破片や非接着細胞を除去します。
   5. ステップ2.2で調製した懸濁液を使用して、R10培地中で最終濃度8 x 10⁴分生子/mLのT. stromaticum conidiaの新しい懸濁液を調製します。
   6. ステップ4.1.5で調製した分生子懸濁液1 mLを各処理ウェル(3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間)に加え、MOIが1:10になる。コントロールには、1 mLのR10培地のみをウェルに加えます。
   7. T. stromaticum conidiaを用いて、5% CO₂雰囲気下で37°Cでマクロファージに3時間挑戦します。3時間後、培地を除去し、細胞を洗浄して、貪食されていない分生子を除去します。
   8. 各ウェルに R10 培地 1 mL を加え、プレートを 5% CO₂ 雰囲気下で 37 °C で異なる時間(3 時間、24 時間、48 時間、72 時間、96 時間、120 時間)インキュベートします。
2. 着色と分析
   1. 対応するインキュベーション(ステップ4.1.8)が完了したら、各ウェルから培地を取り出し、そのウェルに1 mLのPBSを加えます。
   2. 滅菌ピンセットと染色キットで着色するための針を使用して、丸いガラスのカバーガラスをウェルから取り外します。
      注:あるいは、May Grünwald-Giemsa染色試着³³を使用して染色することもできます。
   3. 丸いガラスカバーガラスのそれぞれに、染色キットの成分である染色固定具(5秒)、染料1(5秒)、染料2(2秒)、および緩衝水pH7.0(5秒)を追加します。カバーガラスが乾くまで待ち、封入剤を使用してスライドガラスにカバーガラスを固定します。
   4. 結果を定量化する:時間条件ごとに合計100個のマクロファージ(Mø)をカウントします。光学顕微鏡を用いて、100倍の対物レンズと浸漬油を用いて、分生子を貪食したマクロファージの数を数えます(式[1])。
      (1)
   5. マクロファージごとに貪食された分生子の数を得る:100個のマクロファージに存在する分生子をマクロファージの数で割ったものを、少なくとも1つの食作用のある分生子と相関させる(式[2])³⁴。
      (2)
      注:分生子を評価およびカウントするには、ImageJソフトウェアを使用できます³⁵。
   6. 40倍と100倍の対物レンズを使用して、各サンプルと時間条件から食作用を撮影し、結果を提示します。

図1:ヒト末梢血単核由来マクロファージを用いた食作用および分生子生存率アッセイの模式図。 (1-10)食作用アッセイ:T. stromaticumはPDAで増殖させる必要があり、分生子はPBSでプレートを洗浄することによって回収されます。PBMCは、記載されたプロトコルを使用して密度バリア法で単離し、マクロファージに分化させるために滅菌済みの丸いガラスカバーガラスを備えた24ウェルプレートで7日間培養し、その後、異なる時間間隔で1:10のMOIで処理する必要があります。丸いガラスカバーガラスを除去し、染色キットで染色し、その結果を光学顕微鏡で分析します。(1-8,11-13)分生子生存率アッセイ:単離後、PBMCを丸いガラスカバーガラスのない24ウェルプレートで7日間培養してマクロファージに分化させ、その後、異なる時間間隔で1:10のMOIで処理します。細胞は蒸留水とのインキュベーションによって溶解されなければなりません。次に、懸濁液を遠心分離し、再懸濁したペレットをPDAに播種して、トリコデルマの増殖速度を分析します。この図は、画像のデータベースを使用して設計されました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

5. 食作用後の分生子生存率アッセイ

注:実験計画図が提供されています(図1)。

注:24ウェルプレートを使用してください。

1. T. stromaticum conidiaでヒト由来のマクロファージに挑戦します。
   1. 手順4.1.2〜4.1.8を繰り返して単球を分化し、マクロファージを T.stromaticum分 生子で処理します。
      注意: ウェルに丸いガラスのカバーガラスを使用しないでください。食作用速度論のアッセイに使用したのと同じ時間間隔を使用して、食作用を分生子の生存率と相関させることができます。
   2. ステップ4.1.5で調製した懸濁液(R10培地+分生子)を対照としてウェルを使用して、 T.stromaticum の成長に対するR10培地の影響を評価します。
2. 分生子生存率アッセイ
   1. 各インキュベーション期間(3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間)後に培地を除去し、細胞をPBSで2回洗浄して、貪食されていない分生子を除去します。
      注意: R10培地+分生子を含むコントロールは洗浄しないでください。
   2. 各ウェルに0.5 mLの滅菌蒸留水を加え、プレートを37°C、5%_CO2 で30分間インキュベートします。この後、倒立顕微鏡で細胞の形態を観察し、細胞が溶解していることを確認します。
   3. 懸濁液を回収し、1.5 mLチューブに移します。懸濁液を6,000 x g のミニ遠心分離機で室温で5分間遠心分離します。
   4. 上澄み液を慎重に廃棄し、ペレットを10μLの滅菌蒸留水に再懸濁し、10μLの懸濁液を暗所で28°CのPDA含有プレートに接種する。
   5. T. stromaticum 増殖のポジティブコントロールを調製する:T. stromaticum 分生子の懸濁液(ステップ 2.2)を使用して、最終濃度が 8 x 10⁶ 分生子/mL の新しい懸濁液を調製します。この懸濁液10 μLをPDAに28°Cで暗所でプレートします。
      注:この懸濁液の10 μLには、血中単核由来マクロファージに感染するために使用されたのと同じ数の分生子(8 x 10⁴)が含まれます。.このポジティブコントロールとステップ5.1.2で述べたコントロールとの違いは、ステップ5.1.2で述べたコントロールが、食作用時の トリコデルマ 増殖に対するR10培地の影響の可能性を評価するために使用されることです。PBSで採取された T. stromaticum conidiaの懸濁液を用いたステップ5.2.5のこのポジティブコントロールは、真菌が自然に増殖する方法を反映するために、R10培地の影響を受けずに トリコデルマ 増殖のコントロールを表しています。このコントロールを使用して、R10培地が トリコデルマ の増殖に影響を与えるかどうかを評価することができます。
   6. PDA中のT. stromaticumの成長動態を毎日観察し、培養を写真に収めます。
   7. 分析:1)培養が培養プレート全体を占めるのに必要な時間(日数)、および2)培養中に T.stromaticum 分生子の特徴的な緑色の色素沈着が出現するまでの時間(日数)の2つのポイントを使用して結果を評価できます。

6. 統計解析

1. Kruskal-Wallis検定を使用して、8つのグループ/処理間の統計的に有意な差を決定します。 p < 0.05 を統計的に有意なものと考えます。すべてのデータは、標準偏差 (SD) ±平均として表示されます。図中、#は p <0.05での統計的有意性を示しています。

Results

マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。貪食の回避とファゴソームの脱出は真菌の病原性のメカニズムであるため、 T. stromaticum 分生子の食作用を用いて、食作用後の分生子の生存率を評価した。研究者は、臨床的に関心のある種を調査する際に、最初のアッセイの1つとしてこれらの手法を実行する必要があります。

図2:ヒト末梢血単核由来マクロファージによるT. stromaticum conidiaの貪食。(A)40倍以下、(B)100倍対物レンズの食作用態の代表...

Discussion

Aspergillus fumigatus、Cryptococcus、Candida albicansなどのいくつかの真菌病原体にとって、分生子または酵母の食作用は、マクロファージと病原体の相互作用における細胞質および分子イベントの調査、および内在化された分生子の死亡時期の決定を可能にする重要なプロセスです14,39,40。食作用は、トリコデルマと宿主の相互作用における重要なプロセスです。トリコデルマ属は、デクチン-1およびデクチン-2、Toll様受容体2およびToll様受容体4、MHC、およびNF-κB 25,28,41,42,43を含むいくつかの食作用<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mL遠心チューブ	コーニング	CLS431470	15mL遠心チューブ、ポリプロピレン、蓋付き円錐底、個別に滅菌
24ウェル平底細胞培養プレート	Kasvi	K12-024	ポリスチレン製、英数字識別付き。Cell Culture Plateは、DNase、RNase、パイロジェンを含まず、細胞毒性物質を含んでいません。ガンマ線で滅菌されています。
細胞培養用CO2インキュベーター	三洋電	機303082	CO2インキュベーターは、人体と同様の条件を作り出し、制御する役割を果たし、異なる細胞タイプのin vitro成長と増殖を可能にします。
遠心分離機用マイクロチューブ(エッペンドルフタイプ) 1.5mL	Capp	5101500	ポリプロピレン製で、チューブにキャップが取り付けられており、片手で開閉できます。これは、タンパク質の接着に対して、サンプルの視認性のために研磨された内部を持ち、DNase、RNase、パイロジェンを含まない
円形カバースリップ 15 mm	Olen	K5-0015	円形カバースリップは、細胞培養の顕微鏡技術に使用されます。超透明の半透明ガラス製。厚さ0.13mmの
クラスIIタイプB2(総排気)バイオセーフティキャビネット	エスコライフサイエンスグループ	2010274	エアストリームクラスIIタイプB2バイオセーフティキャビネット(AB2)は、製品、オペレータ、環境保護を提供し、生物学的安全レベルI、II、またはIIIに割り当てられた微量の有毒化学物質および薬剤を扱う作業に適しています。クラスIIタイプB2キャビネットでは、HEPA/ULPAろ過後、すべての流入空気と下降空気が外部環境に排出され、作業面を再循環することはありません。
デキストロースポテト寒天培地	メルク	145	ポテトデキストロース寒天は、酵母や菌類の栽培と列挙に使用されます EDTA
真空採血チューブ	FirstLab	FL5-1109L	EDTAは、細胞形態を保存するための最高の抗凝固剤であるため、血液学ルーチンに推奨される抗凝固剤です。
エンテラン	メルク	1.07961	固定剤;Entellanは、顕微鏡用の永久埋込用の水なし埋込剤です。
ウシ胎児血清	ギブコ	A2720801	ウシ胎児血清(FBS)は a 細胞および組織培養培地のユニバーサル成長サプリメント。FBSは、細胞の接着、増殖、増殖に必要なほとんどの因子の自然なカクテルであり、ほとんどの種類のヒトおよび動物(昆虫を含む)細胞に効果的です。
フラットアイコン			画像のデータベース
グリセロール	メルク	24900988	凍結保護剤グリセロールは、細胞や胞子の凍結に使用されます
Histopaque-1077			ポリスクロース溶液
画像 J			画像解析ソフトウェア
顕微鏡スライド	Precision	7105	顕微鏡用スライド 26 x 76 mm マットラップ 厚さ 1.0 〜 1.2 mm. 特殊な光学ガラス製で、欠陥のない高品質の透明性を持つシルク紙の仕切りでパッケージ化
ミニ遠心分離	機 プリズム	C1801	プリズムミニ遠心分離機は、非常にコンパクトで、設置面積が非常に小さいように設計されています。最大6000rpmまで回転する交換可能な2つのクイックリリースローターが含まれています。電子ブレーキにより迅速な減速が可能で、自動開閉式の蓋によりサンプルに簡単にアクセスでき、取り扱い時間を短縮できます。
ノイバウアーチャンバー	Kasvi	K5-0011	ノイバウアーカウンティングチャンバーは、細胞やその他の懸濁粒子のカウントに使用されます。
パノプティックファスト	Laborclin	620529	Laborclin's  パノプティックファストcは、血液学ペ
ニシリン/ストレプトマイシン溶液 - 10,000U	LGC- バイオテクノロジー	BR3011001	抗生物質は、層流の外部操作による汚染の可能性を回避するために使用されます。
ペトリ皿 90 x 15 mm スムース	Cralplast	18248	使い捨てペトリ皿;透明度の高いポリスチレン(PS)製。平底;滑らか;サイズ:90 x 15 mm。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010001	PBSは、シンプルな配合の水性生理食塩水です。それは等張性であり、ほとんどの細胞に対して無毒です。塩化ナトリウムとリン酸緩衝液を含み、生細胞の水分バランスを維持しながら浸透圧ショックを防ぐように配合されています。
ピペットパスツール 3mL 滅菌済み	Accumax	AP-3-B-S	滅菌済み Accumax Pasteur 3 mLピペット、容量3 mL、透明低密度ポリエチレン(LDPE)製、個別滅菌
冷蔵遠心分離機	Thermo Scientific	TS-HM16R	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R 冷蔵遠心分離機は、ユーザーフレンドリーなコントロールパネルを備えた冷蔵遠心分離機で、速度、RCF値、 上映時間 温度、および実行中のプロファイル。Megafuge 16Rは、最大速度に達することができます 15,200 RPMと最大RCFは25,830 x g。
RPMI-1640 中型	メルク	MFCD00217820	HEPES修飾、L-グルタミンと25mM HEPES使用、重炭酸ナトリウムなし、粉末、細胞培養に適しています
シングルチャンネルマイクロピペット	エッペンドルフ	Z683809	シングルチャンネルマイクロピペットは、非常に少量の液体を正確に移送し、測定するために使用されます。
マイクロピペッター	Corning	4894	容量 10 & マイクロのヒント;Lと1,000 & マイクロ;L オートクレーブ可能な
三眼倒立顕微鏡	LABOMED	VU-7125500	チューブやボトル内の細胞を開けずに観察できるため、コンタミネーションの問題を回避できます。