方法論記事

可視光光干渉断層撮影ファイバーグラムと同一マウス網膜の共焦点像のアライメント

DOI：

10.3791/65237

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2023年6月30日

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1Department of Biology, University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Department of Ophthalmology, University of Virginia, 4Program in Fundamental Neuroscience, University of Virginia, 5Department of Psychology, University of Virginia

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、in vivo画像で観察された網膜神経節細胞軸索束形態を検証する目的で、同じマウス網膜のex vivo共焦点画像とin vivo可視光光干渉断層撮影ファイバーグラフィー(vis-OCTF)画像を位置合わせするための手順を概説する。

要約

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近年、眼疾患の神経損傷を客観的に評価するために、生体内網膜イメージングは、生体システムやプロセスに関する非侵襲的、 リアルタイム、縦 断的情報を提供することがますます適用されています。同じ網膜の Ex vivo 共焦点イメージングは、特に動物研究において 、in vivo 所見を検証するためにしばしば必要になります。本研究では、マウス網膜の ex vivo共焦点像と in vivo 像をアライメントする方法を実証した。可視光光干渉断層撮影ファイバーグラフィー(vis-OCTF)と呼ばれる臨床対応の新しいイメージング技術を適用し、マウス網膜の in vivo 画像を取得しました。次に、「ゴールドスタンダード」と同じ網膜の共焦点イメージングを行い、 in vivo vs-OCTF画像を検証しました。本研究は、分子・細胞機構の解明を可能とするだけでなく、 生体内の神経損傷を高感度かつ客観的に評価するための基盤を確立するものです。

概要

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網膜神経節細胞(RGC)は、内網状層(IPL)の樹状突起樹を介してシナプス入力を受け取り、網膜神経線維層(RNFL)の軸索を介して脳に情報を伝達する視覚情報処理において重要な役割を果たします1,2,3,4。緑内障などの病態では、早期のRGC変性により、患者とげっ歯類モデルの両方で、RNFL、神経節細胞層(GCL)、IPL、および視神経に微妙な変化が生じる可能性があります5,6,7,8,9。したがって、RGCのこれらの形態学的変化の早期検出は、RGCと視力喪失を予防するためのタイムリーな介入に不可欠です。

最近では、可視光干渉断層撮影法(vis-OCT)と呼ばれる臨床可能な新しいイメージング技術を開発し、RGC損傷の生体内モニタリングのニーズに応えています。Vis-OCTは軸方向分解能を改善し、網膜10,11で1.3μmに達し、RNFLの個々のRGC軸索束の可視化を可能にしました。その後、マウスの単軸索束レベルでのRGC損傷を追跡および定量化するために、vis-OCTファイバーグラフィー(vis-OCTF)が確立されました11,12,13。ただし、ゴールドスタンダードと同じ網膜のex vivo共焦点イメージングは、in vivo所見を検証するために必要になることがよくあります。したがって、この研究では、vis-OCTFによって取得されたin vivo画像を、同じマウス網膜のex vivo共焦点画像と位置合わせする方法を示します。プロトコルはex vivoの共焦点イメージ投射によって生体内の調査結果を検証し、病気の状態のRGCの損傷の根底にある分子および細胞変化を検査するための基盤を確立することを向ける。

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プロトコル

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すべての動物処置は、バージニア大学の動物実験委員会によって承認され、米国国立衛生研究所(NIH)の動物使用に関するガイドラインに準拠しています。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。

1. in vivo vis-OCTイメージング

  1. vis-OCTシステム
    1. 480 nm から 650 nm の可視光照明を提供するスーパーコンティニューム光源を使用する小動物の vis-OCT システムを使用して、マウスの眼を画像化します。角膜に入射する電力が1mWであることを確認し、Aラインレートを25kHz、Aラインあたり39.3μsの積分時間を使用します。
    2. 分光器のスペクトル検出範囲が508nm〜613nmであり、網膜で1.3μmの軸方向分解能が得られることを確認してください。総イメージングボリュームは約700μm(x)×700μm(y)×1,500μm(z)です。横方向の分解能は、視野の中心で4.5μm、中心から350μmで8.7μmの間である11,13。
  2. マウス麻酔
    1. C57BL/6バックグラウンドのマウスを麻酔し、ケタミン(114 mg / kg)とキシラジン(17 mg / kg)カクテルの腹腔内注射を行い、1%トロピカミド滴を使用して瞳孔を拡張します。つま先を強くつまんだ後の足の反射の喪失により、適切な麻酔を確認します。
    2. イメージング中は、赤外線ヒートランプを使用してマウスを暖かく保ちます。各画像取得後、角膜脱水を防ぐために人工涙液を塗布します。
  3. イメージング用のマウスの位置
    1. 麻酔をかけたマウスを動物ホルダーに置き、2本のベルクロストラップでマウスを所定の位置に保ちます。
      注意: アニマルホルダーは、レーザーをマウスの目に入れるために、3次元の動き(垂直調整、水平微調整、ピッチとヨーの調整)を可能にします。
  4. イメージングパラメータの調整
    1. コンピューターの電源を入れ、参照されているソフトウェアを開くと、レーザーが自動的にオンになります。
    2. レーザーが安定し、マウスの目の中央に来るまで、動物ホルダーを調整します。ソフトウェアインターフェースの En Face プレビュー、浅血管神経叢の視野(FOV)、およびFOV内の網膜の断面であるB-スキャンにより、眼球の後部を視覚化します。
    3. 512 Aライン/B-スキャンと512 B-スキャン/ボリュームで構成される光学フォーカスの微調整を行った後、ソフトウェアインターフェイスの [取得 ]ボタンをクリックして、可視OCTボリュームを取得します。
      注: このプロセスには ~10.5 秒かかります。画像取得は、所定のしきい値(QI < 45)を下回る画像が含まれないように、組み込みの品質指数(QI)推定器によってガイドされます。
      1. 各マウスについて、同じ眼から 4 つの vis-OCT ボリュームを取得します。視神経乳頭(ONH)を視野の4つの角のそれぞれに合わせ、網膜のさまざまな領域をカバーします。
        注:このような配置により、網膜の湾曲が最小限に抑えられ、FOV全体でRNFL反射率が最大化されます。各取得の合間にアイの位置を変えるのに~1分かかります(図1A、B)。
  5. Vis-OCTF分析
    注:MATLABは画像解析の実行に使用されます。
    1. vis-OCT ボリュームから vis-OCT ファイバーグラムを生成するには、強度ベースのしきい値法 (MATLAB コード行 808) を使用して網膜の表面を検出します。
      注: これらの行は、 imadjust 関数を使用して、bscan の強度値を調整します。 imadjust に渡される引数 [0.0087, 0.08] は、出力イメージのフル ダイナミック レンジにマッピングする強度の範囲を指定します。
    2. 最初の~16 μmの深さを選択してRNFLをトリミングします。Matlab コードの 782 行目を参照してください。
      注:成体野生型C57BL/6マウスの典型的な in vivo RNFLの厚さは~14 μmであり、セグメンテーション方法によって異なる場合があります13。
    3. RAW ファイル (9 行目)、再構成用ファイル (11 行目)、ファイル名 (15 行目) のパスを変更し、[ 実行] をクリックして、OCT イメージが MATLAB コードによって解析されるのを待ちます。軸 (z) 方向 (MATLAB コード行 905 から 908) に沿った平均強度投影を計算して、RGC 軸索束と周囲の血管系で構成されるファイバーグラム イメージを生成します。ファイバーグラム処理後の4枚の画像をモンタージュし、選択したグラフィックエディタで血管の位置合わせを行い、合計で~1.2 x 1.2 mmをカバーします。RAWファイルは通常、OCTイメージングの日付(例:0606 Opticent)の下のHalo Dataフォルダに保存されます。
      注: MATLAB コードは 補足ファイル 1 にあります。

2. Ex vivo 共焦点イメージング

  1. マウスの安楽死
    1. OCTのvis-データを取得した後、ペントバルビタールナトリウム(390 mg/mL)とフェニトインナトリウム(50mg/mL)の混合物でマウスを安楽死させる。フェニトインナトリウムは、げっ歯類の安楽死に広く適用されているペントバルビタールナトリウムの効果を増幅することによって機能します14,15。各マウスについて、希釈混合物0.2 mL/20 g(156 mg/mL)を使用し、20 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で灌流し、次に20 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSに溶かします16,17。
  2. 眼の解剖と向き
    1. 眼球を摘出し、側頭側にマークをつけて向きを示します。
    2. 前房を慎重に取り除いた後、眼球レンズ、硝子体、およびアイカップをPFAで30分間固定します。
    3. アイカップをPBSで30分間洗浄し、洗浄中にPBS溶液を3回交換します。その後、0.5% Triton X-100 in PBS(pH 7.5)で30分間洗浄します。
    4. アイカップをブロッキングバッファー(5%ロバ血清と2.5%ウシ血清アルブミン、0.5%Triton X-100トリス緩衝生理食塩水[pH 7.5])で室温で2時間インキュベートします。
  3. 免疫染色
    注:これで、マウス抗Tuj1の一次抗体で撲色してRGC軸索束を検出し、ラット抗ICAM-2の一次抗体で染色して血管を検出する準備が整いました。
    1. 一次抗体であるマウス抗Tuj1(ブロッキングバッファー中1:200)およびラット抗ICAM-2(ブロッキングバッファー中1:500)とともに、4°Cでアイカップを一晩インキュベートします。
    2. 0.5% Triton X-100(PBST)を含むリン酸緩衝生理食塩水で、毎回3〜5回1時間アイカップを洗浄し、バックグラウンドを最小限に抑え、結合していない抗体を除去します。
    3. 洗浄後、二次抗体、Alexa Fluor 488色素に結合したロバ抗マウス免疫グロブリンG(緑色蛍光)およびAlexa Fluor 594色素に結合したロバ抗ラットIgG(赤色蛍光)を、ブロッキングバッファー中で1:1000に希釈し、4°Cで一晩インキュベートします。
    4. 翌日、PBSTでアイカップを3〜5回1時間ずつ洗浄し、バックグラウンドを最小限に抑え、結合していない抗体を除去します。
    5. フラットマウントの前に、アイカップをPBSのペトリ皿に移します。
  4. フラットマウント網膜
    1. 免疫染色プロセスの後、顕微鏡下で網膜をアイカップから分離します。
    2. 網膜を4枚の葉に切り、RGC層を上に向けて平らに取り付けます。側頭側のマークは、方向を示すために網膜に付けたままにします。
    3. 網膜を封入剤13,18でカバースリップする。スライドをマニキュア13,18,19で密封します。
  5. 共焦点イメージング
    注:共焦点画像の画像処理は、ZEN顕微鏡ソフトウェアを使用して実行されました。
    1. 共焦点顕微鏡の電源を入れ、 Locate(位置特定)モードで、顕微鏡の接眼レンズを使用して関心領域を見つけます。
    2. 取得モードでは、網膜全体をカバーするタイルを設定し、情報のすべてのレイヤーをカバーするように z スタック スライスを設定します。1.24 μm/ピクセルのピクセルサイズで、5.99 mm (x) x 5.88 mm (y) x 30 μm (z) の総体積をカバーするために、網膜全体で少なくとも 25 枚のタイルを画像化します。
    3. Zスタックスライスを投影して、2次元の面共焦点顕微鏡画像を作成します(図1C、D)11、13、19、20、21。

3. in vivo 画像と ex vivo 画像のアライメント

  1. ファイバーグラムを処理した後、選択したグラフィックエディタですべての血管を位置合わせすることにより、各マウスから取得した4つの画像を含む合成画像を作成します。
    注: 図1Bに示すように、平均して最終的な合成画像は約1.2 mm(x)x 1.2 mm(y)です。
  2. 視神経乳頭(ONH)と血管のパターンを目印として使用して、複合ファイバーグラムをアライメントします。合成OCT画像の血管パターンとICAM-2で染色した同じ網膜の共焦点画像を重ね合わせて、 in vivoおよび ex vivo のアライメントを取得します。

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結果

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複合vis-OCTファイバーグラムを、RGC軸索のTuj-1で免疫染色したフラットマウント網膜の対応する共焦点画像と比較します(図1D、上パネル)。vis-OCTFによって画像化された軸索束は、共焦点画像上のTu-j1標識軸索束と一致することができます。血管は通常、ファイバーグラム画像では周囲の軸索束と比較して区別可能な分岐構造を示し、共焦点画像上のICAM-2標識血管と一致する可能性があります(図1D、下パネル)。

ex vivo共焦点顕微鏡とin vivo vs-OCTを並べて比較したところ、同一のRGC軸索束ネットワークと周囲の網膜血管系が明らかになりました。共焦点画像は、特に末梢領域において、in vivo画像と完全に一致しない場合があることに注意してください。これは、網膜がスライドに平らに取り付けられているためです。まとめると、これらの結果は、in vivoでサイズの異なる2つの隣接...

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ディスカッション

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このプロトコルには、注意が必要な 2 つのステップがあります。まず、OCT画像診断の前に、動物が深い麻酔下にあり、目が完全に拡張していることを確認する必要があります。マウスに十分な麻酔がかけられていないと、呼吸が速くなり、 顔 画像の動きが不安定になり、ファイバーグラムの品質に悪影響を及ぼす可能性があります。さらに、拡張が不十分な場合、虹彩が光を遮り、網膜に届かなくなる可能性があるため、画質に悪影響を与える可能性もあります。第二に、灌流後、マウスの眼窩から眼球を取り除く前に、左目または右目、および目の側頭側に印を付けることが重要です。平坦な網膜は上を向いており、表層にはRNFLがあるため、側頭側をマークすることで、平らな網膜の適切な向きが可能になります。

利点の1つは、前眼が光学イメージングのためにクリアである限り、網膜虚血や糖尿病性網膜症などの眼疾患のさまざまなマウスモデルにプロトコルを適用できることです。しかし、この方法の限界の一つは、免疫染色や共焦点イメージングのために網膜を適切に固定しても、軸索束の形態が変化する可能性があることです。これは、網膜解離中の誤...

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開示事項

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Chang、S.、なし。 徐、W.、なし; ファン、W.、なし。 マクダニエル、JA、なし。 D.A.ミラー 何一つ; M.グラノニコ、 何一つ; M. Liu, (劉 昌劉) 何一つ; X.劉、 何一つ; H.F. Zhang はOpticent Healthに金銭的利益を持っていますが、Opticent Healthはこの研究を支援していません。

謝辞

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この研究は、緑内障研究財団シェイファー助成金、4-CA Cavalier Collaborative Award、R01EY029121、R01EY035088、およびテンプル騎士団眼科財団によってサポートされています。

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材料


この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
Halo 100Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscopeCarl Zeiss
Drugs and antibodies
4% パラホルムアルデヒド (PFA)Santz Cruz Biotechnology, SC-2816921-2 drops
ウシ血清アルブミン粉末Fisher Scientific, BP9706-1001:10
ロバ 抗マウス Alexa Fluor 488 色素Thermo Fisher Scientific, Cat# A-212021:1,000
ロバ 抗ラット Alexa Fluor 594 色素Thermo Fisher Scientific, Cat# A-212091:1,000
ユータゾール (ペントバルビタールナトリウム (390 mg/mL) とフェニトインナトリウム (50 mg/mL) の混合物)Covetrus, NDC 11695-4860-115.6 mg/mL
ケタミンコベトラス、NADA043304114 mg/kg
マウス抗Tuj1バージニア大学アンソニー・J・スパノからの贈り物1:200
サーモフィッシャーサイエンティフィック、Cat#J62036。K31:10
ラット anti-ICAM-2BD Pharmingen, Cat#5533251:500
トロピカミド ドロップ Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(試薬グレード)		VWR, CAS: 9002-93-11:20
Vectashield 封入剤Vector Laboratories Inc. H2000-10
XylazineCovetrus, NDC59399-110-2017 mg/kg
正常ロバ血清(NDS)ミリポアシグマ、S30-100 mL 1:100 リン酸緩衝生理食塩水(PBS、10倍)、pH 7.4 (1370 mM NaCl、27 mM KCl、80 mM Na2HPO4、20 mM KH2PO4 を含む)

参考文献

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  1. Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
  2. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  3. Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
  4. Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
  5. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
  6. Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
  7. Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769(2019).
  8. Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
  9. Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
  10. Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
  11. Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
  12. Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756(2021).
  13. Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
  14. Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
  15. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
  16. Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
  17. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
  18. Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
  19. Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
  20. Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
  21. Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).

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