マーモセット児の手飼育方法

サマリー

ここでは、動物の孵卵器でマーモセットの子育て方法を紹介します。この方法は、マーモセットの乳児の生存率を大幅に向上させ、異なる出生後の環境で育った同様の遺伝的背景を持つマーモセットの乳児の発達を研究する機会を提供します。

要約

コモンマーモセット(Callithrix jacchus)は、小型で社会性の高い新世界ザルで、繁殖率が高く、生物医学および神経科学研究のための有力な非ヒト霊長類モデルであることが証明されています。一部の女性は三つ子を出産します。しかし、親が全員を育てることはできません。この子育てを救うために、私たちは生まれたばかりのマーモセットを手で育てる方法を開発しました。このプロトコルでは、食品の処方、給餌時間、温度と湿度の構成、および手で育てられた乳児のコロニー環境への適応について説明します。この手飼育法は、マーモセット児の生存率を大幅に向上させ(手飼育なし:45%、手飼育あり:86%)、異なる出生後環境で育った同様の遺伝的背景を持つマーモセット児の発達を研究する機会を提供します。この手法は実用的で使いやすいため、一般的なマーモセットを扱う他の研究室にも適用できると期待しています。

概要

一般的なマーモセット(Callithrix jacchus)は、中南米を原産地とする小型の樹上性新世界ザルです。生物医学研究におけるマーモセットの使用は、他の非ヒト霊長類(NHP)と比較して、体のサイズが小さい、飼育下での取り扱いと繁殖が容易、妊娠期間が短い、性成熟が早い、人獣共通感染症のリスクが低いなど、いくつかの重要な利点があるため、過去数十年で急速に成長しました1,2,3,4,5,6 .コモンマーモセットは、ヒトと脳の構造や脳機能が似ており、豊かなレパートリーで発声し、豊かな感情を持った社会性の高い行動を示します。これは、感覚処理に関する研究7,8,9,10,11,12,13,14、音声コミュニケーション^{15,16,17,18,19}、脊髄損傷のモデル²⁰など、さまざまなタイプの神経科学研究のための説得力のあるNHPモデルです,21,22,23、パーキンソン病24,25,26,27,28、加齢性疾患²⁹。他のNHPと比較して、コモンマーモセットは比較的高い繁殖率を有しており、これはトランスジェニック修飾に有用である可能性がある30,31,32。この霊長類は、薬理学、血管造影、病原体および免疫研究でも広く使用されています33,34,35,36,37,38,39。しかし、マーモセットの供給は、特に中国では非常に限られており、急速に高まる科学研究のニーズを満たすことができません。

マーモセットのコロニーでは、成体動物には1日に1回か2回給餌され、いくつかの施設では幼体マーモセットの餌を変えている⁴⁰。一般的に、乳児マーモセットは通常、父親や年長の兄弟の体をしっかりとつかんで毎日の世話をし、ミルクのために1日に数回母親に手渡されます。一部のメスのマーモセットは三つ子を出産しますが、この場合、1人または2人の乳児はミルクが不足しているため生き残ることができません。また、保育経験が足りないなどの理由で乳児の世話をしない親もいます。これは多くの研究室にとって大きな損失です。いくつかの研究では、飼育下での成体マーモセットの栄養管理方法が報告されています40,41,42 さまざまな主要栄養素組成、ビタミン、ミネラルを含む食品や調製粉乳、および濃縮のためのさまざまな給餌プロトコル(マッシュ、ゲル化、精製、または缶^詰)2,41。以前の研究では、マーモセットの三つ子⁴³の共同飼育方法が報告されており、養育者は1日に1頭の乳児を連れて行き、一日中手で与え、翌日に別の三つ子と交換します。この方法では、乳児を親の世話にすることができますが、毎日親の体から乳児をつかむには経験豊富な養育者が必要であり、労働集約的です。これまでのところ、新生マーモセットの詳細な段階的な手育て方法を報告した研究はありません。

本研究の目標は、マーモセットの開発に関心のあるが、リソースが限られている人に手作業による飼育方法を提供することです。以前の共同養育方法⁴³とは対照的に、現在の方法は、乳児の家族への迷惑が少なく、習得しやすい代替方法である。本稿では、母乳育児の基本ルールと5年間の実践に基づいて、餌の準備、給餌の時間表、孵卵器の温度と湿度の構成、および子牛のコロニー環境への適応を含む、マーモセット児の飼育方法について説明します。

プロトコル

すべての実験手順は、浙江大学の動物使用およびケア委員会によって承認され、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従っています。

1. 住宅と畜産⁴⁴

1. コロニールームを12時間:12時間の昼/夜サイクル、温度26〜28°C、相対湿度45%〜55%に設定します。
2. 2〜6歳でオスとメスのマーモセットをペアにし、十分なスペースと24時間換気システムを備えた新鮮な空気を備えたケージ(850 mm x 800 mm x 800 mm)で保持します。
3. ケージ内に休憩板、ブランコ、止まり木、ハンモックを用意します。
4. マーモセットのペアに、シリアル、卵、サツマイモ、蜂蜜、果物、野菜、ミールワームなど、真水と30〜40gの餌を1日2回与えます。
   注:獣医師と実験者は、病気の人がすぐに診断され、治療されるように、少なくとも1日に1回は動物施設を検査する必要があります。

2.マーモセットの赤ちゃんの誕生前の準備

1. 妊娠中のマーモセットの世話
   注:受胎時期は触診によって診断され(通常、胚期の開始から10〜20日後)、動物被験者の生殖歴も参照しました。
   1. 繁殖ペアに広いスペースを提供し、人間の邪魔を最小限に抑えます。
   2. 繁殖ペアにミールワーム、卵、ヨーグルト、ドライフルーツなどの追加の餌を与えて、雌の栄養を確保します。
   3. 妊娠中のマーモセットの世話をし、頻繁にチェックして、分娩の準備をしてください。
      注:マーモセットの妊娠期間は4.3日±148日と推定され^{ています45}。
2. 動物用保育器(855 mm [W] x 470 mm [L] x 440 mm [H])、紙おむつパッド(M / Lサイズ)、おしりふき、ぬいぐるみ(図1A)、おもちゃローラー(図1B)、クライミングフレーム(図1B)、毛布(10 cm х 10 cm、図1C)、および電子体重計(精度0.2 g、図1F)を準備します。
   注意: 動物の吊り下げを避けるために、ぬいぐるみにはループ構造がないようにしてください。
3. 食品および給餌器具の準備
   1. 乳児用調製粉乳(生後0〜12か月に適しています)、ベビーライスペースト(生後0〜6か月に適しています)、電気湯沸かし器、ビーカー(100 mL)、加熱パッド、プラスチック製の計量皿(80 mm x 80 mm x 22 mm、図 1D)、滅菌遠心チューブ(50 mL)、使い捨て滅菌シリンジ(1〜5 mL)、静脈内注射器(カスタムメイドの栄養乳首用)(図1E)、 綿棒(80〜100 cm)。
      注:給餌用のニップルを作るには、シリンジに取り付けられた静脈内注射器の端から1cmのところに切り込みを入れます(図1E)。
4. 記録帳票作成
   1. 各乳児マーモセットについて、名前、生年月日、出生時体重、両親などの基本情報、頭囲や尾の長さなどのその他の関心のある基本情報、繁殖日時などの繁殖情報、餌の摂取量(mL)、排便状態(はい/いいえ、 硬い/緩い)、およびインキュベーターの温度と湿度。
      注:通常、体重は1日2回、最初の食事の前と最後の食事の前に1回測定および記録されます。

図1:インキュベーター内のアイテムと給餌ツールと付属品の写真 。 (A)ぬいぐるみ。(B)玩具ローラーとクライミングフレーム。(c)毛布;(d)プラスチック製の計量皿。(e)静脈内注射器およびカスタムメイドの栄養ニップルを備えた注射器。(f)電子スケール。(G)個人用保護具を着用した介護者。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

3.手による育ての手順

1. 期日前に部屋を掃除して滅菌してください。
   1. 次亜塩素酸または75%エチルアルコールを床とテーブルにスプレーし、30秒間放置してからテーブルを拭き、床をモップで拭きます。
2. インキュベーターの温度を35°C、湿度を40%に設定します。通常、 表1 に示すように、乳児マーモセットの基本温度要件をシミュレートするために、出生後14日目(P14)の前に、インキュベーターの温度を35°Cに保ち、P15以降は3日ごとに0.5°Cずつ温度を下げます。コロニーの湿度に近く、乳児の毛皮を乾いた状態に保つ保育器内の湿度を40%〜45%に保ちます。
3. 使い捨ておむつパッドをタイル状にして、インキュベーターのシャーシを覆います。
4. 乳児のストレスを最小限に抑えるために、大人のマーモセットを模倣する傾向がある乳児マーモセットを導入する前に、保育器に毛布とぬいぐるみを数枚入れます。
   注:毛布とぬいぐるみは、使用前に1日間繁殖ペアのホームケージに入れられます。
5. マーモセットの赤ちゃんを保育器に入れ、ホームケージで親から引き離されたら、ぬいぐるみの上に置きます。
   注:社会的孤立を避け、動物福祉に則り、一般的には2頭の乳児を一緒に選んで育てます。
   1. 給餌前に滅菌された個人用保護具(PPE、 図1G)を着用してください。
   2. 毛布を2枚35°Cに温めます。
   3. マーモセットの赤ちゃんを温かい毛布でそっと抱きしめ、動物の体重を出生時体重として求めます。
   4. 乳児マーモセットを温かい毛布で保育器に移します。
   5. 手順2.4で説明したように、記録を取ります。
6. 食材をブレンドし、マーモセットに餌を与えます。
   1. 50 mLの滅菌遠心チューブに50°Cの沸騰水30 mLに5gの粉ミルク5gを溶かします。
      注:出生後の年齢が異なれば、必要なフードレシピも異なります。 表2 には、P1からP60までの出生後の年齢における乳児用調製粉乳、米ペースト、および水のさまざまな投与量が含まれています。.投与量は通常1日で十分です。最初の食事の前に材料をブレンドし、残りの食品は4°Cの冷蔵庫で保管してください。食事ごとに食品を30〜35°Cに加熱します。
   2. 1 mLのシリンジで1 mLの食品を取り、カスタムメイドの栄養ニップルでシリンジに蓋をします。
      注: 表2を参照して、適切なサイズのシリンジを選択してください。
   3. 加熱パッドで食品の温度を30〜35°Cに保ちます。
   4. 授乳前に手を温め、保育器の中で片手に暖かい毛布を持った乳児マーモセットをそっと抱きしめます。
   5. 乳児マーモセットの頭を介護者の握る手の親指と人差し指でそっと保持しながら、乳児マーモセットの口に哺乳乳首を入れ、一定速度でゆっくりと餌を注射器から押し出します。
      注意: マーモセットの赤ちゃんが飲み込むよりも速く食べ物を押さないでください。速く押すと、鼻から喉に食べ物が出てくる窒息を引き起こす可能性があります。これは肺炎などの病気を引き起こし、死に至ることさえあります。餌があふれてしまうと、マーモセットの赤ちゃんは苦労します。これが発生した場合は、給餌をやめ、動物の顔から食べ物を注意深く拭き取ってください。マーモセットが正常に動作し始めた後も給餌を続けます。
7. マーモセットの赤ちゃんが適量の餌を摂取した後、ぬるま湯で綿棒で肛門を拭くと、肛門がきれいになり、排便が促進されます。
8. 動物を数分間観察し、動物の移動と排便を確認します。
9. 給餌時間、食物摂取量(mL)、排便状態(はい/いいえ、硬い/ゆるい)、およびインキュベーターの温度と湿度を記録します。
   注意: 乳児が冷えたり怪我をしたりしないように、計量中は乳児マーモセットを暖かい毛布で包んでください。
10. 固形の糞便を拾うか、新しい使い捨ておむつパッドに交換して、インキュベーターのシャーシを清潔に保ちます。
11. P50の前に、ステップ3.3〜3.7に従って乳児マーモセットを給餌し、表 2に示す食品成分の投与量および給餌時間と頻度を使用する。
12. P50以降、マーモセットの仔児は通常、自発的に食べる準備ができています。
    1. 注射器の代わりにプラスチック製の計量皿を使用してください。食品材料を皿に直接混ぜて食品を準備します。金額については表 2 を参照してください。
    2. 餌皿をインキュベーターに入れ、ひっくり返った場合に備えて底を固定します。数分間観察して、マーモセットの赤ちゃんが餌を食べていることを確認します。最初の数回は、動物を餌皿に誘い込み、口が餌に数回触れるように誘導することで、動物が自発的に食べるように導きます。
       注意: 動物の鼻が食べ物に触れないようにしてください。通常、動物は1日で自発的に食べることを学びます。

4.マーモセットの幼魚がコロニーに戻る前の順応

注:通常、マーモセットの赤ちゃんが自分で食べられるようになったら、手づくりは終わります。マーモセットコロニーのホームケージに戻す前に、いくつかの適応手順を実行する必要があります。

1. マーモセットの赤ちゃんを動物の保育器から鳥かごに似た小さなケージ(45 cm x 45 cm x 40 cm)に移動します。各小さなケージに水筒(50 mL)を掛けます。
2. マーモセットの子魚が入った小さなケージをコロニーに移し、家族のケージの近くに配置します。
3. プラスチック製の計量皿で乳児マーモセットに1週間別々に給餌し、コロニー全体用に準備された毎日のレシピに従って餌を混ぜます。
4. 1日1回、体重と排便状況を記録します。

5. 家族のケージに戻るマーモセットの赤ちゃん

注:小さなケージで7〜10日間生活した後、幼魚マーモセットは通常、コロニー環境によく適応し、それ以上の不安を示さなくなります。

1. 朝、マーモセットの赤ちゃんを家族のケージに戻します。
2. 少なくとも15分間動物を観察して、家族と新規参入者の間で噛みついたり、喧嘩したり、追いかけたりしていないことを確認してください。
   注意: 噛んだり、喧嘩したり、追いかけたりした場合は、できるだけ早く乳児を他の乳児から離してください。そして、別の日にもう一度乳児を家族に戻すようにしてください。障害が再び発生した場合は、別の家族を選択して里親にします。子育ての経験が豊富な家族グループは、里親の第一選択です。ぬいぐるみを新しいケージに入れて、家族が受け入れない場合は、子ザルに同行させます。
3. マーモセットの稚魚に別々に餌を与えるのをやめ、コロニーの餌を使って餌を与え始めます。
4. マーモセットの子が家族のケージに戻った後、1週間はマーモセットの活動に細心の注意を払ってください。
5. 2日ごとにマーモセットの赤ちゃんの体重を測定し、記録します。体重が減ったら、家族のケージで注射器で余分な栄養食品を与えます。
6. コロニーのマーモセットと同様に、幼いマーモセットに毎日の世話をします。

結果

体重は動物の体の成長の重要な指標であり、このプロトコルではマーモセットの健康状態の指標として使用されます。この研究では、手で飼育された動物の体重は年齢とともに徐々に増加し(図2A、n = 16)、以前の研究⁴⁶の新生児の体重に類似していた。コロニー内の繁殖家族への攪乱を最小限に抑えるために、コロニー内のマーモセットの子象の体重を毎日測定しませんでした。生後1ヶ月以降に親で育てられた動物の体重を求め、同じ年齢の手で育てられた乳児の体重と比較した。親で育てられた乳児と手で育てられた乳児の間で体重に有意差はなかった(P30、手育て群、52.25 g ± 2.10 g、n = 18;コロニー群、57.34 g ± 2.77 g、n = 7;t = −1.3417、P = 0.1928;P60、手飼育群、91.76 g ± 3.44 g、コロニー群、93.06 g ± 4.68 g;t = −0.2019、P = 0.8424;スチューデントのt検定)...

ディスカッション

コモンマーモセットは、生物医学および神経科学の研究に非常に有用なNHPモデルです。しかし、マーモセットの資源は限られており、急速に増大するニーズを満たすことができません。本研究では、マーモセット児の生存率を高めるだけでなく、出生後の発達を研究する機会を提供する手飼育方法を開発しました。この手飼育法は実用的で習得しやすいため、一般的なマーモセットを扱う他の研究室にも簡単に適用できます。

いくつかの先天性欠損症は、通常、生後2週間で発症します。これまでに、まぶた、肺、腸、脳に先天性欠損のある新生児マーモセットの症例がいくつか確認されており、P14まで生存することはめったにありません。したがって、P1-14は、手飼育法で飼育できる健康な新生マーモセットを選別するための重要な時期です。また、マーモセットの乳児が過失や母乳不足で親の体から落とされた場合、マーモセットは生き延びることができません。このように、手による飼育は彼らの命を救うのに役立ちます。本研究では、手による飼育を行わない場合の生存率は45%(n=13/29)であったが、手による飼育法を適用した後は86%(n=25/29)に上昇し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
動物用インキュベータ	ーRCOM、韓国		MX - BL600N、855 mm(W)x 470 mm(L)x 440 mm(H)
粉乳	ドジョンソン、アメリカ		後0〜12ヶ月に適しています、エグゼクティブスタンダード-GB25596
ベビーライスペースト	HEINZ、中国		生後0〜6ヶ月に適しています、エグゼクティブスタンダード-GB10769
ベビーワイプベビー	ケア、中国		ソフト
ビー	カーShuNiu、中国		100 mL
毛布	、中国		10 cm>10 cm、ソフト
クライミングフレーム	WowWee、中国		しっかりし、小さな円形構造はありません
おむつパッドこんにちは	健康ペット、中国		MまたはLサイズの
使い捨て滅菌注射器	Cofoe、中国		1 mL、2.5 mL、3 mL、5 mL、10 mL
電子スケール	YouSheng、中国		の精度で0 〜 6,000 gの測定範囲
	中国		0.55 mm x 20 mm針
ケトル	FGA、中国		保温ケトル1,500 mL
ラクツロー	ベルコール、便
プラスチック計量皿	SKSLAB、中国		を解決するために80 mm x 80 mm x 22 mm、ボウル
ぬいぐるみ	Lebiyou、中国		軟質
プロバイオティクス粉末	G-Pet、中国		腸環境を調節する
無菌遠心分離管	NEST、中国		50mL
スワブ	OYEAH、中国		80 - 100 mm
おもちゃ	ローラーWowWee、中国		しっかりし、小さな円形構造なし