ここでは、最大11倍の拡張に変更された拡張顕微鏡(ExM)の新しいバージョンであるMagnifyは、生体分子クラスの包括的な配列を保存し、幅広い組織タイプと互換性があります。これにより、従来の回折限界顕微鏡を使用して生体分子のナノスケール構造を調べることができます。
ここでは、最大11倍の拡張に変更された拡張顕微鏡(ExM)の新しいバージョンであるMagnifyは、生体分子クラスの包括的な配列を保存し、幅広い組織タイプと互換性があります。これにより、従来の回折限界顕微鏡を使用して生体分子のナノスケール構造を調べることができます。
生体試料のナノスケールイメージングは、疾患の病因の理解を深めることができます。近年、膨張顕微鏡(ExM)は、光学超解像顕微鏡法に代わる効果的で低コストの代替手段であることが実証されています。しかし、ゲル内で異なる生体分子クラスを保持するための特異的でしばしばカスタムのアンカー剤の必要性、および特により大きな拡張因子または保存されたタンパク質エピトープが望まれる場合、ホルマリン固定パラフィン包埋組織などの標準的な臨床サンプルフォーマットを拡張することの難しさによって制限されてきました。ここでは、幅広い組織タイプで最大11倍の堅牢な拡張を実現する新しいExMメソッドであるMagnifyについて説明します。組織とゲルの間の化学アンカーとしてメタクロレインを使用することにより、Magnifyはタンパク質、脂質、核酸などの複数の生体分子をゲル内に保持し、従来の光学顕微鏡で組織の広範なナノスケールイメージングを可能にします。このプロトコルでは、堅牢で亀裂のない組織拡張を確保するためのベストプラクティスと、高度に拡張されたゲルの取り扱いとイメージングのヒントについて説明します。
生物学的システムは、手足や臓器からナノスケールのタンパク質レベルまで、構造的な不均一性を示します。したがって、これらのシステムの動作を完全に理解するには、これらのサイズスケール全体で目視検査が必要です。しかし、光の回折限界は、従来の蛍光顕微鏡で~200-300nmより小さい構造を可視化する際に課題を引き起こす。さらに、誘導放出空乏法(STED)、光活性化局在顕微鏡(PALM)、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、構造化照明顕微鏡法(SIM)などの光学超解像法1,2,3は強力ですが、高価なハードウェアと試薬を必要とし、取得時間が遅く、大量の画像を3Dで画像化する能力が低いことが多いため、独自の課題があります。
膨張顕微鏡4(ExM)は、生体分子を水膨潤性ポリマーゲルに共有結合で固定し、物理的に引き離して従来の光学顕微鏡で分解できるようにすることで、光の回折限界を回避する代替手段を提供します。10年足らず前にExMが最初に発表されて以来、多数のExMプロトコルバリアントが開発されており、これらのプロトコルにより、タンパク質5、6、
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動物を含むすべての実験手順は、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って実施され、カーネギーメロン大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。ヒト組織サンプルを商業的に入手した。
1.ストック試薬および溶液の調製
注:使用する試薬のリストについては、 材料表 を参照してください。
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プロトコルが正常に完了すると(図1)、サンプルは熱変性後に透明で平らに見えます。折り畳みやしわは、均質化が不完全であることを示しています。正常に拡張されたサンプルは、1x PBSで拡張する前よりも3〜4.5倍大きくなり、ddH2Oで完全に拡張すると8〜11倍大きくなります。 図 3 は、このプロトコルを使用して処理され、8倍以上に拡大することに成功した厚さ5μmのFFPEヒト腎臓サンプルの膨張前および膨張後の画像の例を示しています。最初に組織をDAPIとともにACTN4の抗体で染色し、核DNAを視覚化しました。次に、標本をスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して画像化しました(図3A)。組織は、同じ標的の拡大後染色を含む上記のプロトコルに従って処理され、再イメージングの前に水中で完全に拡張されました(図3B)。熱変性後、 図4
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ここでは、単一の化学的アンカーで複数の生体分子を保持し、熱変性により困難なFFPE臨床検体を最大11倍まで拡張できるExMバリアントであるMagnifyプロトコル17を紹介します。このプロトコルを他のExMプロトコルと区別する主な変更点には、完全に拡張しても機械的に堅牢なままである再製剤化ゲルの使用、および生体分子アンカーとしてのメタクロレインの使用が含まれます。このプロトコルの最も重要なステップは次のとおりです:1)最終的なゲル溶液の組成。2)ゲル化工程のタイミング;3)ゲル化チャンバーのセットアップ。4)サンプル均質化のパラメータ。5)膨張後染色前のサンプルからのSDSの十分な洗浄。
このプロトコルの最も重要なパラメータは、最終的なゲル化溶液の組成、特に生体分子アンカーメタクロレインの濃度です。異なる組織タイプを拡張するには、異なるメタクロレイン濃度が必要であり(表3)、この値が拡張されるサンプルによく一致するように注意する必要があります。メタクロレインによるオーバーアンカーは、拡張因子の減少と拡.......
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著者らは、次の競合する金銭的利益を宣言します:Y.Z.、A.K.、Z.C.、およびB.R.G.は、MagnifyとExMに関連するいくつかの発明を発明しました。
この研究は、カーネギーメロン大学とD.S.F.慈善財団(Y.Z.およびX.R.)、国立衛生研究所(N.I.H.)の支援を受けました。ディレクターズニューイノベーターアワードDP2 OD025926-01、およびカウフマン財団。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4-ヒドロキシ-テンポ(4HT) | シグマアルドリッチ | 176141 | 阻害剤 |
| 6ウェルガラス底板(#1.5カバーガラス) | セルビス | P06-1.5H-N | |
| アクリルアミド | シグマアルドリッチ | A8887 | ゲルモノマー成分 |
| 過硫酸アンモニウム(APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI(1 mg / mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| デカエチレングリコールモノドデシルエーテル(C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | 非イオン性界面活性剤 |
| ダイヤモンドナイフ No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | ||
| エチレンジアミン四酢酸 酸 (EDTA) 0.5 M | VWR | BDH7830-1 | 均質化緩衝液 |
| 鉗子 | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | 均質化緩衝液 ヘ |
| パリン | Σ Aldrich | H3393 | |
| メタクロレイン | Σ Aldrich | 133035 | アンカーエージェントマイクロ |
| カバーガラス#1(24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| マイクロカバーガラス#1.5(24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- テトラメチルエチレンジアミン(TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | 加速器 |
| N,N′-メチレンビスアクリルアミド(ビス) | Sigma Aldrich | M7279 | ゲルモノマー成分 |
| N,N-ジメチルアクリルアミド (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | ゲルモノマー成分 |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc> 15mL 円錐 | サーモフィッシャー | 339651 | |
| Nunc&�o; 50mL 円錐 | 形サーモフィッシャー | 339653 | |
| オービタルシェーカー | |||
| ペイントブラシ | |||
| pHメーター | |||
| リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)、10倍溶液 | フィッシャーサイエンティフィック | BP399-1 | |
| ポリエチレングリコール 200 | グマアルドリッチ | P-3015 | |
| プロテイナーゼK(分子生物学グレード) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| アクリル酸ナトリウム (SA) | AK Scientific | R624 | ゲルモノマー成分 |
| アジ化ナトリウム | Sigma Aldrich | S2002 | |
| 塩化ナトリウム | Sigma Aldrich | S6191 | |
| クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物 | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 均質化緩衝液 成分 |
| トリスベース | フィッシャーサイエンティフィック | BP152-1 | 均質化緩衝液コンポーネント |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| 尿素 | Sigma Aldrich | U5378 | 均質化バッファー コンポーネント |
| キシレン | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | シグマ アルドリッチ | P8920 |
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