ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

Summary

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。

Abstract

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、あらゆる種類の細胞に分化できるため、ヒト膵臓β細胞の優れた代替供給源となっています。ヒトPS細胞は、胚盤胞由来の胚性幹細胞(hESC)と、リプログラミングプロセスを用いて体細胞から直接作製した人工多能性細胞(iPS細胞)のいずれかです。ここでは、hPS細胞の分化とその後のインスリン産生膵細胞の生成前の最適な培養および継代条件を概説するために、ビデオベースのプロトコルを紹介します。この方法論は、ヒトPS細胞が最終内胚葉(DE)、原始腸管、後部前腸運命、膵前駆細胞、膵臓内分泌前駆細胞、そして最終的に膵β細胞に分化する、β細胞指向性分化の6段階のプロセスに従います。この分化法は、ヒト膵臓β細胞を生成するのに27日かかることは注目に値します。インスリン分泌の可能性は、免疫染色とグルコース刺激インスリン分泌を含む2つの実験を通じて評価されました。

Introduction

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、さまざまな細胞型に分化する独自の能力を有しており、ヒト膵臓β細胞の代替として有力な存在となっています¹。これらのヒトPS細胞は、胚盤胞に由来する胚性幹細胞(hESC)^2と、体細胞を直接リプログラミングして作製した人工多能性細胞(iPS細胞⁾³の2種類に分類されます。ヒトPS細胞をβ細胞に分化させる技術の開発は、基礎研究と臨床の両面で重要な意味を持ちます^1,4。糖尿病は、世界中で4億>人が罹患している慢性疾患であり、膵臓^{β細胞の機能}不全または喪失により、体が血糖を調節できないことに起因します5。移植用の膵島細胞の利用可能性が限られているため、糖尿病の細胞補充療法の開発が妨げられています^2,4,6,7。ヒトPS細胞を用いてグルコース応答性インスリン分泌細胞を作製できることは、ヒト膵島の発生と機能を研究するための有用な細胞モデルとして有用です。また、制御された環境で糖尿病治療の潜在的な治療候補をテストするためにも使用できます。さらに、ヒトPS細胞は、患者と遺伝的に同一の膵島細胞を産生する可能性を秘めており、移植後の免疫拒絶反応のリスクを低減します^2,4,7。

近年、hPS細胞の培養と分化プロトコルの改良が著しく進歩し、その結果、膵臓β細胞の作製に向けた分化プロセスの効率と再現性が向上しています^8,9。

次のプロトコルは膵臓のβ細胞の指示された微分の必要な段階を概説する。これには、異なる時点での特定の細胞シグナル伝達経路の調節が含まれます。これは、Sui L. et ^al.10 (2018)によって開発された、膵臓β細胞へのhPS細胞の作製プロトコルに基づいています。最新の研究では、β細胞の分化を促進するためにアフィジコリン(APH)治療を使用することの重要性が強調されているため、プロトコルはSui L. et ^al.11 (2021)からの最近の更新に合わせて調整されました。現在のプロトコルには、プロセスの後期段階で培地にAPHを添加することが含まれています。さらに、初期のプロトコルと比較して、分化の初期段階で培地の組成に修正が加えられています。注目すべき変化は、6日目にケラチノサイト成長因子(KGF)が追加され、8日目まで続くことです。ケラチノサイト増殖因子(KGF)は6日目から8日目に導入されますが、これはKGFがステージ4培地に含まれていなかった最初のプロトコル¹⁰とはわずかに異なります。

β細胞様細胞を作製するための最初の重要なステップは、膵臓を含むさまざまな臓器の上皮内膜を生じさせる原始的な胚葉である最終内胚葉(DE)へのヒトPS細胞の分化です。DEの形成後、細胞は原始的な腸管に分化し、その後、後部前腸の運命が特定されます。その後、後部前腸は膵臓前駆細胞に発達し、内分泌細胞や外分泌細胞を含む膵臓のすべての細胞タイプに分化する可能性があります。プロセスの次の段階では、膵臓の内分泌前駆細胞が関与し、ランゲルハンス島に見られるホルモン分泌細胞が生じます。最終的に、分化プロセスは、完全に機能する膵臓β細胞^様細胞を産生することにより、最終段階に達します^9,10。このプロセスは複雑であり、分化の効率と特異性を改善するために、特異的な成長因子や細胞外マトリックス成分などの培養条件の最適化が必要になることが多いことに注意することが重要です^9,10。さらに、in vitroでhPS細胞から機能的なβ細胞様細胞を作製することは依然として大きな課題です。現在進行中の研究は、分化プロトコルの改善と、得られた^β細胞の成熟と機能の強化に焦点を当てています9。

このプロトコルでは、細胞の生存率と多能性を維持するために、hPS細胞の培養および継代中の穏やかな細胞解離の使用が不可欠であり、膵β細胞への分化効率が大幅に向上します。さらに、各病期特異的培地は、Sui L.らによって開発されたプロトコルに従って細心の注意を払って最適化されており¹⁰ 、ヒト膵島によく似たクラスターでインスリン分泌細胞の高収率を促進します。

Protocol

分化を開始する前に、実験目的で必要な膵島様オルガノイドの数を決定することが推奨されます。6ウェルプレートでは、コンフルエントが80%を超える1つのウェルは、通常、200万〜230万個のhPS細胞で構成されています。hPSC株のばらつきや分化効率などにより、正確な予測は困難ですが、大まかな推定では初期ウェル数の1.5倍です。効果的に方向づけられた分化では、通常、インスリン産生細胞のみではなく、クラスター内のすべての細胞を含む6ウェルプレートでウェルあたり1.6〜200万個の細胞が得られます。50 μmのクラスターの場合、約10,000個の細胞を含むように近似できます。 表1 に、グルコース刺激インスリン分泌バッファーとともに、幹細胞マトリックスおよび培地上での指向性分化の各日/段階に使用した培地組成の概要を示します。

1. ヒト多能性幹細胞の分化前を6ウェルプレートで継代

注:β細胞様細胞に分化する前にヒト幹細胞を適切に継代することは、実験プロセスを確立する上で重要なステップです。継代希釈や接着細胞数が正しくないと、分化効率と忠実度が損なわれる可能性があります。

1. 幹細胞培養培地、コーティング液、および解離溶液を調製します( 表1に規定)。
2. 継代の1〜2時間前に、6ウェルプレートにコールドコーティング溶液(ウェルあたり1 mL)をコーティングし、37°C、5%CO₂でインキュベートします。
3. 幹細胞培養培地のアリコートを室温(15〜25°C)で20分間温めます。
4. 幹細胞培地を吸引し、カルシウム/マグネシウムを含まないD-PBSを1 mL添加します。
5. 手順 1.4 を繰り返します。二度。
   注:D-PBSは、細胞を洗浄し、以前の培地と化合物を除去するために添加されます。D-PBSへの曝露はhPS細胞に害を及ぼさず、浸透による細胞の破裂や収縮を防ぐため、洗浄ステップに特定の時間枠は必要ないことに注意することが重要です。
6. D-PBSを吸引し、各ウェルに500μLの解離溶液を加え、室温(15〜25°C)で2〜5分間放置します。
7. 細胞が解離している間に、新しい6ウェルプレートのコーティング溶液を吸引し、各ウェルに1〜2 mLのカルシウム/マグネシウムフリーのD-PBSを加えます。
8. 倒立顕微鏡で解離プロセスを定期的にチェックしてください。
9. 細胞の80〜90%が丸くなったが、まだ接着しているときに解離溶液を吸引します。
10. 10 μM ROCK阻害剤を含む幹細胞培地1 mLを添加します。
11. 1,000 μLの滅菌フィルター付きピペットチップとP1000ピペットを使用して、解離した細胞を15 mLのコニカルチューブに集めます。
12. コロニーを破壊するために、1,000 μLの滅菌ピペットフィルターチップを使用して、ピペット内で細胞懸濁液をゆっくりと上下にトリチュレーションしますが、10回を超えないようにします。
13. ROCK阻害剤を含む幹細胞培地1 mLを添加して残りのhPS細胞を剥離し、細胞懸濁液を同じ15 mLのコニカルチューブ(1.10)に移します。
14. 新しくコーティングしたプレートからD-PBSを吸引し、すぐに15 mLのコニカルチューブから細胞懸濁液を添加します。最適な細胞増殖を確実にするために、6ウェルプレート(10分の1から50分割分の1)を使用する場合、ウェルあたり2 x 10⁵- 1 x 10⁶ の生細胞の範囲を播種します。
    注:容量計算では、6ウェルプレートの各ウェルに、ROCK阻害剤を含む幹細胞培地2 mLが含まれている必要があります。
15. プレートをすばやく前後に動かし、左右に5〜10回動かします。
16. プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターに24時間置きます。
17. 翌日、ROCK阻害剤を含まない新鮮な幹細胞培地と交換し、その後はhPS細胞の濃度が80〜95%に達するまで2日ごとに交換します。

2. ヒト幹細胞由来β細胞指向性分化

注:hPS細胞は、80〜95%のコンフルエンスが達成された場合、膵臓β細胞への直接分化プロセスに使用できます。

1. -1日目:細胞の継代 分化の-1日目:
   1. 継代の1〜2時間前に、6ウェルプレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターで1時間コールドコーティング溶液でコーティングします。
   2. 手順1.1から1.10に従って、セルのカウントに進みます。
   3. 10 μLの細胞混合物をロードし、等量のトリパンブルーを加え、穏やかに混合します。
   4. 細胞濃度を計算します。10 μM ROCK阻害剤を含む0.8 × 10 6細胞/mL - 1.0 x 10⁶細胞/mLの幹細胞培地を使用して、コーティングされた6ウェルプレートを1ウェルあたり2 mLの培地で播種します。
   5. プレートを前後にすばやく左右に3回動かします。
   6. プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターに入れます。プレートをすばやく前後に動かし、再び左右に10回動かします。その後、プレートを4時間インキュベートします。
      注:インキュベーターに入れたらプレートを動かして、細胞の最大の付着と均一な分布が細胞を乱さないことを確認してください。インキュベーターの開閉は慎重に行ってください。
   7. 0〜4日目の基礎培地のボトルを4°Cに置き、一晩解凍します。
2. 0日目
   注:hPS細胞は80〜95%のコンフルエントでなければならず、そのコンフルエントの下で最終的な内胚葉への分化プロセスを開始しないでください。
   1. 氷上で、0日目から4日目の基礎培地とサプリメントの両方を解凍します( 材料表を参照)。
   2. 2本のコニカルチューブで、1日目に使用するのに必要な容量(6ウェルプレートのウェルあたり2 mL)のみを調製し、別のチューブで、2.5日目から4日目の容量を2倍にします(6ウェルプレートのウェルあたり2 x 2 mL)。2.5日目から4日目の培地を4°Cで保存します。
   3. 1日目の培地と洗浄用培地1の必要量を37°Cのウォーターバスで5分間温めます。
   4. 幹細胞培地を吸引し、2 mLの洗浄培地1を加えます。
      注:プロトコルで使用される洗浄培地は、各日/ステージに固有の基礎培地に1%の抗生物質を添加したものです。直接微分プロトコルの洗浄ステップは、指定された洗浄媒体(「洗浄媒体1または2」、 材料表と呼ばれる)の添加と、その後の吸引のみを含む、記載された手順2.2.4に従う。これらの洗浄ステップには特定の時間枠が示されていないことに言及することが重要です。
   5. 洗浄用培地1を吸引し、直ちに1日目用培地2mLをウェルの側面に加える。
   6. 細胞を37°C、5%_CO2 で24時間インキュベートします。
3. 1日目
   1. 2.5〜4日目の培地の必要量のアリコートを37°Cのウォーターバスで5分間予熱します。
   2. 1日目の培地を吸引し、すぐに2.5〜4日目の培地2 mLをウェルの側面に加えます。細胞を洗わないでください。
   3. プレートを37°C、5%_CO2 で36時間戻します。
4. 2.5日目から4日目
   1. 2.5〜4日目の残りの容量のアリコートを37°Cのウォーターバスで5分間予熱します。
   2. 培地を吸引し、すぐに2 mLの新しく調製した2.5〜4日目の培地をウェルの側面に加えます。
   3. プレートを37°C、5%_CO2 で36時間戻します。
5. 4日目
   注:この段階では、決定的な内胚葉マーカーの発現は最大であり、細胞は原始的な腸管分化を開始することができます。
   1. 4日目の原始腸ステージ培地(6ウェルプレートのウェルあたり2 mL)の必要量のアリコートを調製し、室温(15°C-25°C)で20分間温めます。
   2. 2.5〜4日目の培地を吸引し、2mLの洗浄培地1を加えます。
   3. 洗浄培地1を吸引し、直ちに4日目原始腸期2mLをウェルの側面に加える。
   4. プレートを37°C、5%_CO2 で48時間戻します。
6. 6〜8日目
   注:この段階で、細胞は後部前腸運命へのさらなる分化を開始します。
   1. 6〜8日目の後部前腸培地(6ウェルプレートのウェルあたり2 mL)の必要量を準備し、培地を室温(15°C〜25°C)で20分間温めます。
   2. 4日目の培地を吸引し、すぐに6〜8日目の後部前腸培地2 mLをウェルの側面に加えます。
   3. プレートを 5% CO₂ を含む 37 °C のインキュベーターに 48 時間置きます。
7. 8日目から12日目
   注:細胞は膵臓前駆細胞の分化を受ける準備ができています。
   1. 8〜12日目の膵臓前駆細胞ステージ培地(6ウェルプレートのウェルあたり2 mL)を調製し、培地を室温(15°C〜25°C)で20分間温めます。
   2. 6〜8日目の培地を吸引し、すぐに6〜8日目の後部前腸培地2 mLをウェルの側面に加えます。
   3. プレートを5%_CO2 を含む37°Cのインキュベーターに48時間入れます。
8. 12日目:クラスタリングステップの実行
   注:この段階では、細胞は高密度の単層を形成し、3D細胞培養に移行してクラスターを形成します。このステップは、β様細胞とヒト膵島との構造的類似性を高めるだけでなく、細胞レベルとクラスターレベルの両方で機能的類似性を向上させるための分化に不可欠です¹¹(図1)。
   1. 400 μmのマイクロウェルを含む6ウェルプレート( 材料表:ヒト幹細胞由来のβ細胞指向性分化、12日目に指定)を、室温(15°C〜25°C)で2 mLの付着防止リンス溶液で処理します。
      注:マイクロウェルは、細胞がウェルの底に付着するのを防ぎ、3Dクラスターの機械的形成を促進します。
   2. プレートを1,300 x g で5分間遠心分離します。
   3. 倒立顕微鏡で気泡の存在を確認します。気泡が見られない場合は、付着防止リンス液を吸引し、直ちに洗浄液2(材料表)2mLを添加する。
   4. 手順 1.8.3 を繰り返します。二度。
   5. 必要量のクラスター培地を準備し、室温(15〜25°C)で20分間温めます。6ウェルプレートの2つのウェルが、4 mLのクラスター培地を含む400 μmマイクロウェル6ウェルプレートの1つのウェルに入るようにします。
   6. 膵臓前駆細胞培地を吸引し、解離緩衝液(ウェルあたり0.5 mL)を添加します。
   7. 室温(15°C〜25°C)で2〜5分間インキュベートします。倒立顕微鏡で解離プロセスを定期的にチェックし、ほとんどの細胞が丸みを帯びているが、まだ接着しているときに解離バッファーを吸引します。
   8. 解離バッファーを吸引し、直ちに各ウェルに1 mLのクラスター培地を添加します。
   9. P1000ピペットと1,000 μLのフィルターチップを使用して6回静かにピペッティングし、細胞を解離します。
   10. 細胞とクラスター培地の混合物を50 mLのコニカルチューブに移します。
   11. 1 mLのクラスター培地を加えて、残りのすべての細胞を回収します。
   12. マイクロウェルプレートの各ウェルに4 mLの混合クラスター培地/細胞が含まれるように、クラスター培地を必要な総容量に加えます。
   13. マイクロウェル6ウェルプレートから洗浄培地2を吸引し、細胞懸濁液を移す。プレートを37°Cで24時間インキュベートします。
9. 13日目:クラスタリング後の細胞の処理と、13日目以降の培地の交換。
   注: クラスターは非常に機密性が高く、数日後に完全性と実行可能性を確保するために慎重な取り扱いが必要です。したがって、12日目以降のクラスタリング後の期間にクラスタを注意深く監視することが重要です。実験プロセスで成功する結果を促進するには、定期的な評価と調整が不可欠です。
   1. 13日目の培地(6ウェルプレートのウェルあたり2 mL)を、15〜20日目の膵臓内分泌前駆細胞培地用に50 mLの別のコニカルチューブに調製します。
   2. p1000ピペットと1,000 μLのフィルターチップを使用して、マイクロウェル6ウェルプレートから50 mLのコニカルチューブにクラスターをゆっくりと集めます。
   3. 13日目の培地1 mLを加えて残りのクラスターを回収し、クラスターをチューブに移します。
   4. 細胞を重力下で円錐形チューブの底に5分間自然に固めます。
   5. 細胞クラスターを乱すことなく、チューブからできるだけ多くの上清を吸引します。ピペットチップはクラスターに触れたり吸引したりせず、上清のみに触れてください。
   6. 13日目の培地の必要量を、以下に従って添加します:マイクロウェル6ウェルプレートの1ウェルを、低付着性6ウェルプレート(ウェルあたり2mLの培地)の3ウェルに入れます。
   7. クラスターを吸引しないように、静かに上下にピペットで移動します。
   8. 懸濁液を非常に低接着性の6ウェルプレートに移します。
   9. プレートを左右に6回すばやく前後に動かします。
   10. プレートを37°Cで48時間インキュベートします。
   11. このセクション2.9で説明するように、分化が終了するまで、次のすべてのステップで培地交換を実行します。
10. 15〜20日目
    1. 細胞懸濁液を50mLのコニカルチューブに集め、13日目にステップ2.9.4から2.9.10に従うことにより、分化の21日目まで48時間ごとに膵臓内分泌前駆細胞ステージ培地に交換します。
11. 21日目から27日目
    注:この段階で、クラスターは膵臓のβ細胞に分化します。
    1. 膵臓β細胞期培地を調製します。
    2. 15日目から21日目の説明に従って、1日おきに培地を交換します。
       注:25日目以降、膵島様オルガノイドは分析を受けて、完全に機能していることを確認できます。

3. 膵β細胞クラスターの染色

注:分化後のクラスターの機能評価を調査するには、このステップを実行します

1. 分化終了時に1.5 mLの微量遠心チューブに5〜10個のクラスターを回収します。
2. 200 μL の 4% PFA で室温で 15 分間、細胞クラスターを固定します。
3. クラスターに 1 mL の PBS を添加し、クラスターを乱さずに 1,000 μL のピペットチップで PBS を除去します。
4. 200 μL の 30% スクロースをクラスターに加え、4 °C で一晩インキュベートします。
5. クラスターをクライオモールドに移し、余分なスクロースを除去し、O.C.T.培地を一滴加え、クラスターをO.C.T.培地と混合します。
6. クライオモールドをドライアイスで凍結し、-80°Cで保存します。
7. ミクロトーム/またはクライオスタットを使用して、顕微鏡スライド上の凍結ブロックから5 μm切片を切断します。
8. スライドは染色されるまで-80°Cの冷凍庫で保管してください。
9. 染色当日は、スライドを-80°Cの冷凍庫から取り出します。
10. クライオモールドのセクションの周りの氷を慎重に取り除きます。
11. 疎水性ペンでスライド上の細胞クラスターを丸くします。
12. PBSを含むスライド染色ジャーでスライドを15分間再水和します。
13. スライド染色ジャーに冷たいメタノールを加え、ジャーをスライドとともに-20°Cで10分間置きます。
14. スライドをPBSジャーに浸します。
15. 手順 3.14 を 3 回繰り返します。
    注意: この方法は、次のすべての洗浄手順に使用します。
16. スライドからPBSを除去し、PBS-Tに2〜5%BSAを含む100 μLのブロッキング溶液を直ちに含みます。
17. 各スライドにブロッキング溶液を加え、パラフィンフィルムで覆います。
18. 室温(15〜25°C)で1時間インキュベートします。
19. ブロッキング溶液中の一次抗体を、「試薬および溶液」セクションに記載されている比率で希釈します。
20. スライドからブロッキング溶液を取り除きます。
21. すぐに希釈した抗体を添加し、スライドが乾燥しないようにパラフィルムでスライドを覆います。
22. 4°Cで一晩インキュベートします。
23. 翌日、PBS-Tでスライドを3〜5回洗浄します。
24. 希釈した二次抗体とDNA染色剤を調製します。
25. スライドから余分なPBS-Tを取り除きます。
26. 希釈した二次抗体とDNA染色剤を添加します。室温(15〜25°C)で45分間インキュベートします。
27. スライドをPBS-Tで3〜5回洗浄します。
28. スライドから液体を取り除きます。
29. 各切片に組織学用封入剤を一滴加えます。
30. スライドをガラスカバーで覆います。
31. 蛍光顕微鏡で染色したスライドを撮影します。

4. GSIS(グルコース刺激インスリン分泌アッセイ)

1. 低グルコースKREBS溶液、高グルコースKREBS溶液、KClを含む低グルコースKREBS溶液の3つの異なる溶液を準備します。
2. すべての溶液を37°Cのウォーターバスで温めます。
3. 1000 μLのピペットチップを使用して、同様のサイズのクラスターを約10〜15個慎重に選択し、クラスターが乾燥しないように、少量の分化培地とともに1.5 mLチューブに移します。
   注:クラスターは肉眼で見えるはずですが、そうでない場合は、分化したクラスターを含むプレートを倒立顕微鏡下に置き、クラスターを選択して 1.5 mL チューブに移します。
4. クラスターと培地の入ったチューブをチューブラックに置き、クラスターがチューブの底に沈むのを待ちます。
5. 200μLのピペットで上清をゆっくりと吸引し、200μLの低グルコースKREBS溶液を加えます。
6. 膵島を低グルコース溶液中で37°Cで1時間インキュベートします。
   注:クラスター数と実験の一貫性を正確に評価するには、チューブに付着する傾向があるため、移送中に溶液中のすべてのクラスターの存在を確認することをお勧めします。
7. インキュベーターからチューブを取り出し、クラスターを吸引せずに200 μLのKREBS溶液をゆっくりと吸引します。
8. 200 μLの低グルコースKREBS溶液を加え、37°Cで30分間インキュベートします。
9. 200 μLの低グルコースKREBS溶液を500 μLのチューブに吸引し、すぐに-80°Cで保存してインスリン測定を行います。別々の治療について繰り返します。
10. クラスターを洗浄するには、クラスターを含むチューブにグルコースを含まないKREBS溶液200 μLを加えます。クラスターがチューブの底に落ち着くのを待ち、クラスターを乱さずに上清を慎重に取り除きます。
11. 200 μLの高グルコースKREBS溶液を加え、37°Cで30分間インキュベートします。
12. 200μLの高グルコースKREBSを500μLのチューブに吸引し、すぐに-80°Cで保存してインスリン測定を行います。別々の治療について繰り返します。
13. クラスターを洗浄するには、クラスターを含むチューブにグルコースを含まないKREBS溶液200 μLを加えます。クラスターがチューブの底に落ち着くのを待ち、クラスターを乱さずに上清を慎重に取り除きます。
14. 200 μL の KCl KREBS 溶液を加え、別々の処理を繰り返します。
15. 37°Cで30分間インキュベートします。
16. 200 μL の KCl KREBS 溶液を 500 μL のチューブに吸引し、すぐに -80 °C で保存してインスリン測定を行います。他の治療についても繰り返します。
17. 50μLの超純水を加え、総インスリン含有量の測定に進みます。
18. 150μLの酸性エタノール溶液を膵島と超純水を入れたチューブに加えます。
19. サンプルは4°Cで一晩(12〜15時間)保存します。
20. 翌日、各サンプルをボルテックスします。
21. 膵島組織の完全な溶解を確実にするために、20%の電力に設定された電気超音波処理装置で超音波処理を1秒間実行します。
    注: 残りのクラスタが表示されなくなるまで、手順 4.21 を繰り返します。
22. すべてのサンプルを10,000 × g で10分間遠心分離し、上清を保管します。
23. ナノドロップ分光光度計を使用してDNA濃度を測定し、インスリン測定値を正規化するために使用できます。

Results

この論文で説明するプロトコールは、hPS細胞からβ様細胞を分化するための非常に効率的なアプローチを提供します¹⁰。このプロセスでは、拡張が容易な2D培養システムを利用しており、学習分化、小規模なプロジェクトや実験室、iPS細胞株の分化の可能性を評価するためのパイロットテストなど、さまざまな実験環境での使用が可能です。

グルコースの恒常性に関する洞察を得るためには、膵島で分化したβ細胞の機能特性を特徴付けることが不可欠です。これは通常、β細胞マーカーやインスリン発現の免疫染色、および低グルコース濃度と高グルコース濃度に応答して膵島機能をテストするグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)アッセイなどのさまざまな実験によって達成されます^12,13。β細胞は、Nkx2-2、Pdx1、Nkx6-1、Neurod1などの特徴的な遺伝子を持っており、これらはβ細胞の同一性の確立と維持に重要である⁹。免疫染色技術は、組織切片内のタンパク質の発現と局在を調べるために有用です。β細胞マーカーの免疫染色は、主要な膵臓系譜マーカーの発現レベルを評価することができ、分化プロセスの忠実度と特定のアプリケーションへの最適化に関する洞察を提供します^9,12。

本研究では、Mel1 InsGFP/w(Mel1 INS-GFP)¹⁴ hES細胞レポーター株を用いて、ヒトの天然膵島に見られる細胞に類似したβ細胞を含む、異なる細胞型からなるクラスターを分化しました。このホワイトペーパーの 図2 は、微分プロセスの効率と精度に関する重要な発見を示しています。結果は、膵臓系統内のインスリン発現細胞の高濃縮を示しており、これらの細胞はグルコース刺激インスリン分泌を示します。これは、分化過程を通じて機能的なβ様細胞の作製に成功したことを示しています。

分化した細胞を低グルコース濃度と高グルコース濃度で刺激したところ、GSISの結果、Mel1細胞由来のクラスターは、グルコースに対するインスリン分泌応答において膵島と同様に機能することが示されました。Mel1由来のクラスターは、低グルコース濃度と比較して、高グルコース濃度に反応して100倍多くのインスリンを分泌することがわかりました。具体的には、インスリン含量は、3.3mMの低グルコースで0.003±0.002%、16.7mMの高グルコースで0.236±0.197%であった。

Mel1 INS-GFP ヒトESCに由来するクラスターは、GSISアッセイに加えて、その組成と機能を決定するためにさらに分析されました。具体的には、β細胞シグネチャー遺伝子の発現と、クラスター内の異なる細胞型の存在を調べました。その結果、このプロセスから得られた膵臓系統はインスリン陽性細胞に富んでおり、ヒトES細胞のβ細胞様細胞への分化プロセスにおいて高いレベルの成功率を示していることが示されました。さらに、β細胞のアイデンティティの確立と維持に重要なNkx6.1やPdx1などのシグネチャー遺伝子の発現を調べました。解析の結果、細胞の約25%と40%がそれぞれNkx6.1とPdx1を発現していることが明らかになり、クラスターに分化したβ様細胞が含まれているという追加の証拠が得られました(クラスターあたりの平均Nkx6.1+細胞は24.9%±6.2%、n=9クラスター、Pdx1+細胞は40.2%±6.2%、n=9、SEM、 図2)。さらに、クラスターには、全細胞集団の約15%を占めるグルカゴン陽性細胞など、他の細胞タイプが含まれていました。これらの細胞は典型的には、ランゲルハンス島原産のアルファ細胞に見られ、細胞組成の点でヒトの膵島によく似ていることが示唆されている。

図1:ヒトPS細胞の膵β細胞への分化 。 (A)最終内胚葉誘導、原始腸管形成、後部前腸運命決定、膵前駆細胞生成、膵内分泌前駆細胞形成、そして膵β細胞分化の6つの連続した段階を含む、hPS細胞の膵β細胞への in vitro 指向分化の模式図。膵臓のβ細胞分化は、ヒト膵島発生の重要な段階を利用し、特定の時期に特定の細胞シグナル伝達経路を調節します。B27:B-27サプリメント;Ri:rho関連プロテインキナーゼ阻害剤またはROCK阻害剤;T3:甲状腺ホルモン;KGF:ヒトKGF/FGF-7タンパク質;RepSox:アクチビン/リンパ節/TGF-β経路阻害剤;ALK5を阻害します。RA:レチノイン酸;ZS:硫酸亜鉛;UFH:未分画ヘパリン;XX:γ-セクレターゼ阻害剤XX;APH:アフィジコリン;EGF:上皮成長因子;LDN:BMP阻害剤III、LDN-212854;シクロ:シクロパミン-KAAD。(B)多能性幹細胞から膵β細胞への分化のさまざまな段階で撮影された細胞形態の画像。1枚目の画像は、分化初日のヒト多能性幹細胞(HPSCの単層)です。(C)11日目、細胞は膵臓前駆細胞期にあります。100μmのスケールバー。 (D)12日目に、膵臓前駆細胞段階で細胞が解離した後、6ウェルプレートのマイクロウェルにクラスターが形成されます。(E)13日目に、クラスターは低付着の6ウェルプレートにあります。100μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:分化したMel1 InsGFP/w hES細胞レポーターライン¹⁴から得られたクラスターを、β細胞成熟マーカーを発現するインスリン産生細胞の存在を評価しました。 (A)クラスターの免疫蛍光画像は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してクライオモールド切片(5 μm)からキャプチャされ、グルカゴン産生細胞(約15%)(n=9クラスター、 約18,000細胞、SEM)。(B)クラスターの免疫蛍光画像は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してクライオモールド切片(5 μm)から取得され、膵臓β細胞マーカーNkx6.1(n = 9クラスター、約18,000細胞)と共発現するインスリン産生細胞が優勢であることが示されました。(C)マーカーの免疫染色用に特別に設計されたImageJセルカウンターマクロを使用して、インスリン陽性、グルカゴン陽性、およびβ細胞マーカーNkx6.1陽性細胞、およびβ細胞マーカーPdx1陽性細胞の割合を測定しました。(D)Mel1 InsGFP/w hESC由来クラスターのグルコース刺激インスリン分泌を評価したところ、分化したクラスター(n=9、SEM)の高グルコース刺激(16.7mMグルコース)に応答して100倍の増加を示しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:指向性分化のための培地組成の要約。 この表は、グルコース刺激インスリン分泌バッファーとともに、幹細胞マトリックスおよび培地上での指向性分化の各日/段階に使用される培地組成の概要を示しています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

ヒトPS細胞の膵β細胞への分化が成功するかどうかは、選択したヒトPS細胞の日常的な培養と継代のあらゆる側面を最適化することにかかっています。これには、細胞株が正常な核型を持ち、マイコプラズマ感染が陰性であり、プラスミドまたはウイルスベクターゲノムがないことが含まれます。また、iPS細胞を用いる場合、まだリプログラミング中の最も早い継代をパイロット実験に用いることは避けることが重要です。これらの実験は、最高の分化ポテンシャルと最適な継代数を持つhPS細胞株を特定するために、小規模に実施する必要があります。

分化効率に影響を及ぼし得る他のパラメータには、使用される幹細胞培地の品質、コーティング密度、および継代数が含まれる^10、12。このプロトコルは、関連するすべてのパラメータが最適化されるようにすることで、差別化の効率を最大化するように最適化されています¹⁰。

hPS細胞のβ細胞への分化をサポートするために、各段階で特定の製剤を用いた分化培地が使用されます。アクチビンAおよびWntアゴニストを分化培地中で使用し、決定的な内胚葉細胞への移行を開始します。原始的な腸管の段階では、KGFを培地に添加してβ細胞へのさらなる分化を促進し¹⁵、このKGFの包含は6日目から8日目まで維持され、Sui、Egliらによる元のプロトコルとは異なります¹⁰。膵臓前駆細胞の段階では、Pdx1転写因子の発現を増強するために、特定の培地組成が最適化されます。これは、骨形成タンパク質(BMP)経路を阻害する高濃度のレチノイン酸(RA)、KGF、およびLDN193189を使用することによって達成^{されます8。}分化が内分泌段階に進行するにつれて、培養培地はノッチシグナル伝達をダウンレギュレートするように修飾されます。これは、γセクレターゼ阻害剤であるXXIを、T3(甲状腺ホルモン)、RA、およびアクチビン/BMP/TGF-β^経路の阻害剤であるRepSoxとともに組み込むことによって達成されます8。この化合物の特定の組み合わせは、膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化を促進するために使用されます。最後に、直接分化プロセスを最適化するために、膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化中にアフィジコリン(APH)が導入されます。このAPHの追加は、β細胞分化をさらに促進することを目的としており、Sui、Egliらによって提案された最初のプロトコルとは明確な変更を表しています^10,11。

分化の過程では、細胞密度をモニタリングし、適切な分化を妨げる可能性があるため、過剰なコンフルエントを防ぐことが重要です。高密度培養は、高いOct4発現を維持し、決定的な内胚葉への分化を阻害します。最初の洗浄ステップでROCK阻害剤を除去することは、分化を開始し、hPS細胞の多能性状態を変化させるために不可欠です。インスリン遺伝子座にGFPを組み込んだMel1 INS-GFPなどの蛍光マーカーを使用すると、膵臓前駆細胞およびβ細胞段階での分化の進行の評価が容易になり、下流の実験に役立ちます¹⁴。

ヒト多能性幹細胞を膵β様細胞に分化させる現在のプロトコルは、異なるhPS細胞株間で効率にばらつきがあることを実証している¹⁰。さらに、得られたβ様細胞は、ヒトの膵島と比較して機能的未熟さを示し、細胞あたりのインスリン分泌が少ないことを示しています。この限界にさらに対処するために、分化の最終段階で膵島オルガノイドを動物モデルに移植することにより、β様細胞のin vivo成熟を達成することができます^6,7。

これらの制限にもかかわらず、hPS細胞の膵β細胞への分化は、既存の方法と比較して大きな可能性を秘めています^8,9,10。この技術により、グルコースに反応し、β細胞マーカー(Pdx1およびNkx6.1、図2を参照)を発現するβ細胞様細胞を大量に作製することができます。これは、ヒトの膵島の使用に関連する倫理的、技術的、およびソースの制限なしに行われます。さらに、この技術は、薬物検査や疾患モデリングのために患者固有のβ細胞を生成できるため、個別化医療に適用できる可能性があります^4,6,7。この技術は、膵臓のβ細胞の喪失または機能不全を伴う糖尿病の治療にも将来的に応用される可能性があります^4,6,7。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne 微量遠心チューブ	Starlabs	S1615-5500
6ウェル細胞培養プレート	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6ウェルプレート	STEMCELL Technologies	34425
アンチグルカゴン	Sigma-aldrich	G2654-100UL
抗インスリン	ダコ	A0564
アンチNKX6.1	バスバイオロジカルズ	NBP1-49672SS
アンチPDX1	アブカム	ab84987
アブミコリン	シグマ - アルドリッチ	A4487
B-27 サプリメント (50X)、無血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504044
ウシ血清アルブミン、脂肪酸フリー	Sigma-Aldrich	A3803-100G
塩化カルシウム二水和物	Sigma-Aldrich	C3306
カルシウム/マグネシウムフリー D-PBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190144
シクロパミン-KAAD	カルバイオケム	239804
D-(+)-グルコース、BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
リン酸水素二ナトリウム、無水	Sigma-Aldrich	94046-100ML-DMEM
と GlutaMAX 洗浄	モフィッシャー科学	10566016	培地 2: DMEM と GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物 F-12)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10565-018
エプレディ スーパーフロスト プラス 接着スライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10149870
エタノール	VWR	20821.33
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10270098
ガンマセクレターゼ阻害剤 XX	サーモフィッシャーサイエンティフィック	J64904
ゲルトレックス LDEV-フリー 還元成長因子 ベースメント	サーモフィッシャーサイエンティフィ	A1413302	ゲルトレックスを 1:1 を冷たい DMEM/F-12 培地に 1:1 で希釈し、最終希釈率 1:100 にします。
ヤギ抗モルモット, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
ヤギ抗モルモット, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
ヤギ抗マウス二次抗体, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
ヤギ抗ウサギIgG二次抗体, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
ヘパリン	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES バッファー	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, 三塩酸塩	サーモフィッシャーサイエンティフィック	H1399
ヒト FGF-7 (KGF) 組換えタンパク質	サーモフィッシャーサイエンティフィ	PHG0094
塩化水素	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge疎水性バリアPAPペン	寒天AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
塩化マグネシウム六水和物	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT化合物 118 mL	寒天AGR1180
PBS錠剤、リン酸緩衝生理食塩水、フィッシャーバイオ試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	7647-14-5
ペニシリン-ストレプトマイシン (PS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック、	15070-063
塩化カリウム	Sigma-Aldrich	7447-40-7
組換えヒトEGFタンパク質	R&D Systems	236-EG-200
長方形カバーガラス、22回;50 mm	VWR	631-0137
RepSox (塩酸塩)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	サーモフィッシャーサイエンティフィック	61870036	洗浄用メディウム 1: RPMI 1640 と GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S6014-500G
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S3014
リン酸二水素ナトリウム 無水	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff 内胚葉	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	StemFlex Supplement を 4°C で一晩解凍します。C、サプリメントボトルの残留液体をStemFlex基礎培地に移します。
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
甲状腺トルモン 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
トリパンブルー溶液、0.4%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250061
TrypL 発現酵素 (1X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
懸濁培養用超低接着プレート	モフィッシャーサイエンティフィック	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (二塩酸塩)	STEMCELL Technologies	72302
硫酸亜鉛	Sigma-Aldrich	Z4750