液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF MS/MS)に基づく分析ワークフローにより、主要パラメーター(保持時間[RT]、衝突断面積[CCS]、正確な質量電荷比[m/z])に基づくヒストン修飾および同定の高信頼性で再現性の高い「ボトムアップ」分析を実現します。
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方法論記事
液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光分析、飛行時間型質量分析を用いたヒストン修飾スクリーニング(英語)
この記事について
サマリー
要約
ヒストンタンパク質は真核生物に豊富に存在し、保存されており、翻訳後修飾(PTM)として知られる構造の結果として、遺伝子制御に大きな役割を果たしています。外的要因または遺伝的要因を参照して、各PTMの位置と性質またはPTMのパターンを特定することで、この情報をDNA転写、複製、修復などの生物学的応答と統計的に相関させることができます。本研究では、生体試料からヒストンPTMを検出するためのハイスループット分析プロトコルについて説明します。相補的な液体クロマトグラフィー、トラップドイオンモビリティースペクトロメトリー、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF MS/MS)を使用することで、1 回の分析で最も生物学的に関連性の高い修飾を分離し、PTM に割り当てることができます。説明されているアプローチは、モビリティトラップでの並列蓄積とそれに続く連続的なフラグメンテーションと衝突による解離を使用した依存データ収集(DDA)の最近の開発を利用しています。Histone PTMは、保持時間、移動度、フラグメンテーションパターンに基づいて確実に割り当てられます。
概要
真核細胞では、DNAはクロマチンとしてヌクレオソームと呼ばれる機能単位にパッケージ化されています。これらのユニットは、4つのコアヒストン(H2A、H2B、H3、H4の各2つ)の八量体で構成されています1,2,3,4。ヒストンは、真核生物の中で最も豊富で保存性の高いタンパク質の一つであり、遺伝子調節に大きく関与しています5。ヒストンの翻訳後修飾(PTM)は、クロマチン動態の調節に大きな役割を果たし、DNAの転写、複製、修復などのさまざまな生物学的プロセスに関与しています6。PTMは、主にDNAと接触しているヒストンのN末端領域のアクセス可能な表面に発生します3,7。しかし、尾部とコアの修飾はクロマチン構造に影響を与え、ヌクレオソーム間の相互作用を変化させ、特定のタンパク質を動員します3,8。
液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)ベースのプロテオミクスにおける現在の課題は、目的の分析種の共溶出の可能性です。データ依存性分析(DDA)の場合、これはMS/MS取り込みプロセス中にいくつかのプリカーサーイオンが失われる可能性があることを意味します9。飛行時間型(ToF)機器は、非常に高い周波数9,10(最大数十kHz)でスペクトルを取得します11。これにより、複合体サンプル(MS1)内の全プリカーサーイオンを迅速にスキャンできるため、最適な感度とMS/MSシーケンシングレート(最大100 Hz)が約束され9、生物学的サンプル分析に理想的です10。それにもかかわらず、これらの高いスキャンレートで利用可能な感度は、MS/MSレート9によって制限されます。これらの制限を軽減するために、直交四重極飛行時間型(qToF)質量分析計と組み合わせたトラップドイオンモビリティースペクトロメトリー(TIMS)の追加が使用されました。TIMSでは、すべての前駆体イオンは、四重極9で単一の前駆体質量を選択するのではなく、それらの移動度の関数としてタンデムで蓄積され、溶出されます。PASEF(Parallel Accumulation-Serial Fragmentation)により、感度を損なうことなく、毎秒数百のMS/MSイベントを処理できます9。
この研究の主な目的は、移動トラップでの並列蓄積とそれに続く連続的な断片化と衝突誘起解離(CID)を使用して、DDAの最近の発展を示すことでした。Histone PTM は、保持時間(RT)、移動度、およびフラグメンテーションパターンに基づいて、自信を持って割り当てました。
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プロトコル
注:ヒストンサンプルは、Bhanu et al.(2020)12から採用された方法を使用して抽出されました。
1. サンプル調製
- 培養細胞の回収
- 細胞が80%コンフルエントになったら、トリパンブルー排除法を用いて細胞が生存可能であることを確認します。
注:これらの実験にはHeLa S3細胞株を使用しましたが、この方法はあらゆる培養細胞に適用できます。 - 培地を吸引し、5 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を各プレートに塗布します。
- プレートを回転させて残留培地をすべて洗浄し、PBSを吸引し、5 mLの1x PBSを塗布します。
- 使い捨てのセルリフターで細胞をこすり落として、プレートから細胞を静かに分離します。
- 各細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移します。
- 800 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化します。
- 細胞ペレットからPBSを吸引します。
- ヒストン抽出に進みます。
注:セルペレットがすぐに処理できない場合は、液体窒素で急速凍結してください。準備が整うまで、ペレットを-80°Cで保存します。
- 細胞が80%コンフルエントになったら、トリパンブルー排除法を用いて細胞が生存可能であることを確認します。
- ヒストン抽出
- 各細胞ペレットの体積を推定し、半月板に油性マーカーで印を付けます。
- すべてのサンプルについて十分な核分離バッファー(NIB、15 mM Tris-HCl(pH 7.5)、15 mM NaCl、60 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM CaCl2、 250 mM スクロース)を調製します。また、多くのサンプルを時間をかけて処理する必要がある場合は、バッファーをバルクにして2〜8°Cで最大6か月間保存するか、各抽出に必要な量のみを解凍して、-15°C〜-25°Cで無期限に分注して凍結します。
メモ: 保管中は、バッファをクリアにしておく必要があります。緩衝液が曇ったり、異常な外観になったりした場合は、廃棄して新しい緩衝液を準備してください。 - 細胞ペレットの50倍の容量の洗浄バッファーを調製し、以下のように阻害剤を添加します(洗浄バッファー2検体あたり約10mL)。
- 10 mLの洗浄バッファーを調製するには、10 mLのNIB、30 μLの200 mM 4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフッ化塩酸塩[AEBSF]、10 μLの1 Mジチオスレイトール[DTT]、20 μLの5 μMミクロシスチン、20 μLの5 M酪酸ナトリウムを混合します。
- 洗浄バッファーの1/5を除去して、溶解バッファーを調製します(洗浄バッファーの1/5容量、0.3%NP-40またはNP-40の代替品)。
注:Triton-X 100は、特定の細胞タイプには研磨性が高すぎる可能性があるため、NP-40またはNP-40の代替品の代わりに使用しないでください。 - 細胞ペレットを5カラムの洗浄バッファーに懸濁し、800 x g で4°Cで5分間遠心分離することにより、完全に洗浄します。 このステップを2回実行し、洗浄の合間に上清を吸引して廃棄します。
- 細胞ペレットの体積が油性マーカーでマークされていることを確認してください。10容量の溶解緩衝液に再懸濁します。
- 各ペレットをピペットで混合して再懸濁し、氷上で15分間インキュベートします。
- 15分後、800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上澄み液を吸引して廃棄する。
注意: ペレットは、元のペレットサイズの≤ 1/2 に縮小する必要があります(マーカー線で示されます)。ペレットが十分に還元されない場合は、溶解手順を繰り返し、乳棒を使用して細胞をこじ開ける穏やかな均質化ステップを含めます。 - 溶解が完了したら、ペレットを500 μLの洗浄バッファーに再懸濁し、800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引して廃棄し、もう一度洗浄ステップを繰り返してNP-40の痕跡をすべて除去します。
注:この時点で、ペレットはヒストンを含むクロマチンで構成されています。 - ペレットを0.4 N H2SO4の5容量(元の細胞ペレットサイズ)に再懸濁します。
- 攪拌機を使用して冷蔵室または冷蔵庫で2時間インキュベートします。
- 2時間後、サンプルを3400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄み液を捨てないでください。
- 上清を新しいチューブに移し、100%トリクロロ酢酸(TCA)を内容物の1/3の体積にスパイクします(最終的なTCA濃度は約20%になります)。
- チューブを静かに裏返し、無色透明の溶液が白色および/または濁り、タンパク質の沈殿を示すのを観察します。
注:ヒストン濃度が低い溶液の場合、タンパク質の沈殿はすぐには目立たないかもしれませんが、一晩のインキュベーション後に沈殿物が見えるはずです。 - 4°Cで一晩(12〜18時間)撹乱することなくインキュベートし、ヒストンタンパク質を完全に沈殿させます。
- 翌日、3400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- ピペットチップでチューブの側面に触れないように注意しながら、上清を吸引します。この段階では、ヒストンは主にチューブの側面に膜として堆積します。
- 500 μLの氷冷アセトン+0.1% HCl(酸性アセトン)をガラス製のパスツールピペットを使用して各チューブに加え、チューブを数回静かに反転させます。この間、サンプルを順番に(1、2、3など)配置します、アセトンが間違っているとチューブのマーキングが取れる可能性があるためです。3400 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離し、上清を静かにデカントします。
- 500 μLの氷冷100%アセトンとガラス製のパスツールピペットで、このすすぎステップを繰り返します。3400 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離し、上清を静かにデカントします。
- 残りのアセトンが蒸発するまで、チューブを開いたまま室温で乾燥させます。
- 乾燥したら、各チューブに質量分析(MS)グレードの水100 μLを加えます。この液滴を使用して、容器のすべての側面を綿棒で拭き取り、ヒストン膜全体を再懸濁します。これを行うには、液滴をチューブの側面にピペッティングし、ピペッティングしながら回転させるか、100 μLの半分を分注し、チップを使用して全体を攪拌します。両方の方法を組み合わせるのが最適です。ヒストンは水に容易に溶け、溶液中にあります。
- すべてのサンプルを再懸濁した後、白色固体が残っている場合は、室温の浴中で5分間超音波処理します。
- 4°Cで5分間、800 x g で遠心分離します。 透明な溶液を新しいチューブに移します。残っている不溶性ペレットは廃棄してください。
- 還元条件下でSDS-PAGEを実行し、抽出がクリーンであることを確認します。
注:ゲルは、10〜20 kDaの範囲のタンパク質を区別できる限り、適切な濃度のポリアクリルアミドを使用して実行できます。このプロトコルで使用されるゲルについては、 材料表を参照してください。 - タンパク質濃度アッセイ(すなわち、ブラッドフォードまたはBCA)を実行して、総タンパク質濃度を決定します。
- リジン残基の化学的誘導体化(プロピオニル化)
- 20 μgのヒストン(タンパク質アッセイで測定)を清潔なチューブに移します。真空濃縮装置を使用してこのサンプルを <5 μL まで乾燥させ、20 μL の 100 mM 重炭酸アンモニウム (NH4CO3) (~1 μg/μL 溶液) を使用して再懸濁します。必要に応じて、水酸化アンモニウムを使用して pH を ~8 に調整します。
注意:水酸化アンモニウム(NH4OH)を使用して再懸濁せず、必要に応じてpHを調整するためにのみ使用してください。そうしないと、タンパク質が変性して沈殿します。
注:サンプルの損失を最小限に抑えてpHをチェックするには、ピペットチップを使用してサンプルに浸し、pHストリップに軽くたたきます。この試験手順は、残りのサンプル前処理ステップで役立ちます。 - アセトニトリル(ACN)に無水プロピオン酸を1:3(v/v)の比率で添加して、プロピオニル化試薬を調製します(すなわち、40 μLの試薬を作るには、10 μLの無水プロピオン酸と30 μLのACNを混合します)。
注:従来、メタノールまたはイソプロパノールはプロピオニル化試薬の調製に使用されてきました。プロピオニル化はアミド生成反応であるため、メタノールの使用から生じるメチルプロピオニルエステルなどの不要な副生成物や反応を防ぐために、アセトニトリルなどの非プロトン性溶媒が必要です。一度に最大4つのサンプルに十分な量のプロピオニル化試薬を調製するだけで、試薬の鮮度が保たれます。調製後1〜2分以内に試薬を使用してください。試薬が置かれると、無水プロピオン酸が周囲の水分と反応し、酢酸が形成され始め、試薬の有効性が変化し、試薬が添加されるとヒストン溶液のpHが変化します。 - 各サンプルにプロピオニル化試薬を1:4(v/v)で添加します(すなわち、ヒストン20 μLの場合、プロピオニル化試薬5 μLを添加します)。
- 1:5(v/v)NH4OHを速やかに添加し(すなわち、ヒストン溶液20 μLに対して4 μLを添加)、溶液のpHを~8に再確立します。それでもpHが低すぎる場合は、pH1が8になるまで一度に1〜2μLのNH4OHを追加します。通常、1:5(v/v)の比率で十分です。
- サンプルを室温で15分間インキュベートします。
- プロピオニル化試薬のバッチあたり3〜4サンプル以下でプロピオニル化反応を繰り返して、酸の形成を最小限に抑えます。
- プロピオニル化手順のステップ1.3.2-1.3.5を繰り返します。2回目のプロピオニル化により、利用可能なリジンの>95%が誘導体化されます。
- 真空濃縮器を使用してサンプルを<5μLまで乾燥させます。これにより、NH4OHから放出された未反応のプロピオニル化試薬、酸生成物、およびアンモニアガスが蒸発します。サンプルが完全に乾燥しても、大きなサンプル損失は発生しないため、問題ありません。
注意: ボトル内に残っている周囲の水分との接触による酢酸の形成を防ぐために、保管する前に無水プロピオン酸ボトル内の空気をアルゴンガスで置換してください。
- 20 μgのヒストン(タンパク質アッセイで測定)を清潔なチューブに移します。真空濃縮装置を使用してこのサンプルを <5 μL まで乾燥させ、20 μL の 100 mM 重炭酸アンモニウム (NH4CO3) (~1 μg/μL 溶液) を使用して再懸濁します。必要に応じて、水酸化アンモニウムを使用して pH を ~8 に調整します。
- トリプシンによるタンパク質分解消化
- ヒストンを 100 mM NH4HCO3 に再懸濁して容量を 20 μL にし、最適濃度 1 μg/μL にします。
注:濃度が 1 μg/μL 未満のサンプル溶液では、トリプシン効率が低下します。 - トリプシンをヒストンサンプルに1:10の比率(wt/wt)で添加します(すなわち、20 μgのヒストンに対して1 μg/μLのトリプシン溶液2 μLを添加します)。
- 反応液を37°Cで6〜8時間インキュベートします。または、室温で一晩(12〜18時間)インキュベートします。
- -80°Cで少なくとも1時間凍結して消化を停止します。
注:消化反応を急冷するために酸を使用すると、手順のこの時点でpHが望ましくない低下を引き起こすため、使用しないでください。サンプルは、続行する準備が整うまで-80°Cで保存できます(暫定停止点)。
- ヒストンを 100 mM NH4HCO3 に再懸濁して容量を 20 μL にし、最適濃度 1 μg/μL にします。
- ペプチドN末端の化学誘導体化(プロピオニル化)
- 真空濃縮器を使用してサンプルを<5μLまで乾燥させます。
- 100 mM NH4HCO3 を使用して、サンプルを 20 μL(1 μg/μL)まで再懸濁します。
- 前と同様にプロピオニル化を繰り返します(ステップ1.3)。
注:水相比:有機相比が高いため、このステップではサンプルの乾燥に時間がかかるのが普通です。
- ステージチップによるサンプル脱塩
- サンプルを 50 μL の MS グレード水 + 0.1% TFA で再懸濁または希釈します。
- 11-G サンプルコアラーを使用して、固相抽出ディスクから C18 材料のディスク 5 枚をパンチします (ピペットチップに移す前に 5 枚のディスクすべてをパンチします)。ディスクを200 μLのピペットチップの底に挿入し、しっかりと均等にくさびで留めます(図1)。
注:1つのステージチップから25 μgを超えるサンプルを脱塩する場合は、15-Gコアラーを使用してください。 - 遠心分離アダプターを使用して、ステージチップを1.5 mLまたは2 mLの微量遠心チューブに固定します。
注:以下の遠心分離ステップでは、4°Cで一度に1〜2分間、400〜2回転の低速(400〜2 x g)を使用します。溶媒は通常、C18 材料がチップにどれだけ密集しているかにもよりますが、1分以内に樹脂を通過します。 - 50 μLの100%アセトニトリルで遠心分離してレジンをすすぎ、C18 材料を活性化し、潜在的な汚染物質を取り除きます。
注:ゲルローディングピペットチップを使用して、溶液をステージチップにロードする方が簡単な場合があります。C18 材料が活性化されたら、脱塩手順の間、樹脂を乾燥させないことが重要です。 - 遠心分離により、ディスク材料を 80 μL の MS グレード水 + 0.1% TFA で平衡化します。
- 氷酢酸を使用してサンプルをpH 4以下に酸性化します。サンプルの損失を最小限に抑えるために、以前と同様にpHストリップでpHをチェックします。
- ゆっくりと遠心分離して、サンプル全体をレジンディスクにロードします。
- 遠心分離により、サンプルを 80 μL の MS グレード水 + 0.1% TFA で洗浄します。
- 70 μL の 75% アセトニトリルと 0.5% 酢酸をゆっくりと遠心分離して洗い流し、サンプルを清浄な 1.5 mL チューブに溶出します。さらに遠心分離時間を設けて、全量のサンプルをステージチップから溶出させることができます。遠心分離時間が長くなれば、サンプルの溶出後に樹脂は不要になるため、乾燥しても問題ありません。
- 各サンプルを真空濃縮器で完全に乾燥させます。
注:サンプルは、続行する準備ができるまで-80°Cで保存できます(暫定停止点)。 - LC-MS/MS 分析では、最終濃度が 0.4 μg/μL になる液体クロマトグラフィー(LC)プロトコルの溶媒 A(0.1% ギ酸)でサンプルを再溶解します(つまり、20 μg のヒストンを 50 μL の溶媒 A に溶解します)。
2. TIMSソフトウェアインターフェース
- [ Instrument](装置 )タブを選択し、[Operate]( 操作 )に切り替えます(装置名が緑色でハイライトされていることを確認します)(図2)。
- TIMSパラメータを確認します(図2)。
- MS設定(スキャン開始、スキャン終了、イオン極性、スキャンモード)を確認します(図2)。
- TIMS設定(モード、モビリティ開始、モビリティ終了、ランプ時間、蓄積時間、デューティサイクル、ランプレート、MSレート、MS平均化、自動キャリブレーション)を確認します(図2)。
- [ Source ]タブに移動し、シリンジオプション(Hamilton 500 μL)を TuneMix キャリブレーションステップでのみアクティブにします(図3)13。
- [ キャリブレーション ]タブに移動し、[ m / z]をクリックして、[ キャリブレーションモード]を選択し、モード(通常はエンハンスドQ)、ズーム(+ 0.01%)STD偏差(0.24)を選択し、[ キャリブレーション]をクリックします。100%のスコアが達成されたら、受け入れます(図4)。
- [モビリティ]タブに移動し、キャリブレーションプロセス(通常はリニアモード)、検出範囲(+ 5%)、幅(0.1 Da)、標準偏差(0.1855)を繰り返してから、[キャリブレーション]をクリックします。98.5%≥スコアが出たら、受け入れます(図5)。
- メソッドに移動し、使用するメソッドを選択します。この例では、 Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControlが選択されています (図5)。
3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS
- 4,500 V キャピラリー電圧、800 V エンドプレートオフセット、3.0 bar ネブライザー圧力、10.0 L/minドライガス、200 °C ドライヒーター、50 μL/minの注入流量という一般的な nESI 動作条件を使用します。
- 6 eVのコリジョンエネルギー、1200 VppのコリジョンRF、75 μsの転送時間、5 μsのプリパルスストレージという標準的なMS設定を使用します。
- 入口漏斗P1と出口漏斗P2の圧力差を用いてドリフトガス流量を求める。TIMS細胞ではPASEF(Parallel Accumulation-Serial Fragmentation)が発生し、すべての前駆体イオンが個別にではなく同時に蓄積されます。その後、プリカーサーイオンは、通常ははるかに広いピーク(約 50 倍短い)に対して狭いイオンピークで放出され、S/N 比を高めながら、モビリティー14 を介して共溶出ペプチドを分離します。
- タンパク質分解ヒストンペプチドを分析するための LC-TIMS-ToF MS/MS 分析法を開発します。C18 (300 Å、5 μm、4.6 mm × 250 mm)カラムを取り付けた高速液体クロマトグラフ(HPLC)と、独自のPASEFテクノロジーを採用した市販のTIMS-TOF MS装置を組み合わせます。
注:このカラムサイズは、以前に発表された研究15、16、17 に基づいて、ペプチド混合物の高 pH と低 pH の両方で良好な分離が得られるように決定されました。- 注入量を 20 μL(8 μg)のサンプルと 0.4 mL/分の流速に設定します。
- 0.1% ギ酸を含む水(溶媒 A)とアセトニトリルと 0.1% ギ酸(溶媒 B)を使用して、60 分間の非線形 LC グラジエントを実行します。グラジエントを設定します:10%Bに2.7分、次に5.3分で20%B、4分で28%B、さらに18分で35%B、13分で40%B、さらに2分で100%B。100%Bを5分間保持した後、5分間で濃度を10%Bに下げ、最後の5分間保持します。
- ポジティブイオン化モードでナノエレクトロスプレーイオン化(nESI)により、HPLCからTIMS-TOFへのサンプル溶出を検証します。
4. データ分析
- ペプチド配列と修飾部位を同定します。
- MS-digest ツールで ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] を使用して、ペプチドの理論リストを作成します。
- 消化物の条件(使用する酵素)、検索するPTMの種類(モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化など)、検索するペプチドのサイズ範囲、質量検出範囲、および切断の見逃しの潜在的な数を考慮しながら、理論的な消化を行います。
- MS-digest ツールで ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] を使用して、ペプチドの理論リストを作成します。
- 理論ペプチドに基づいて取得したデータを手動で解析します(図6)12。
- 各理論ペプチドについて、いくつかのチャージ状態(+1〜+4)での質量を検索します。
- 各 m/z を最初に同定した後、ピークを選択し、PTM を含むペプチド配列に基づくフラグメンテーションイオンの理論リストを使用して MS/MS を確認します。
注:同定されたペプチドの移動度が以前に知られていた場合、これも確認されます。
- さまざまなPTMの相対存在量を計算し、各修飾を指定されたペプチド配列のパーセンテージとして報告します。
- 検出された各PTMの相対存在量は、次の式を使用して計算されます。
相対存在量 = PTM の面積/特定のペプチドの未修飾および PTM の総面積
- 検出された各PTMの相対存在量は、次の式を使用して計算されます。
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結果
ボトムアッププロテオミクスワークフロー(図7)では、通常、粗サンプルから標的タンパク質を抽出し、タンパク質の濃度を定量し、通常はゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーで分画します。分画後、タンパク質はタンパク質分解酵素(しばしばトリプシン)を用いて消化され、最後に、得られたペプチドの質量分析および確立されたデータベースを用いたタンパク質同定が行われる18。配列情報は、示された質量電荷比(m/z)範囲内の前駆体イオンに由来し、衝突誘起解離(CID)を受け、データベース19 (図8)を用いて同定および配列決定されるフラグメンテーションパターンを生成します。
この研究の主な目標は、プロトコルのセクションで前述した手順に従って、LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA メソッドを開発して適用することでした。異性体および同重体ペプチドの翻訳後修飾...
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ディスカッション
ヒストンは、4つのコアヒストン(H2A、H2B、H3、H4の各2つ)からなる八量体の形でDNAと相互作用することにより、クロマチン構造を調節する基本的なタンパク質です20。ヒストンには多数のリジン残基とアルギニン残基が含まれており、これらは容易に修飾され、ヒストン機能に影響を与えたり、他の細胞タンパク質に結合したりしてクロマチンの化学的性質を変化させる広範なPTMにつながります21。PTMは連携して働くことで生物学的反応を誘発することができ、PTMの特定のグループはいくつかの疾患、特にいくつかの種類の癌で報告されています22。
DNA損傷が細胞レベルで認識されると、病変がマークされた複雑なシグナル伝達カスケードの作用が即座に続き、細胞周期の進行と必要な修復経路の活性化が調整されます。さらに、DNA損傷は、アセチルやメチル付加物などのさまざまな修飾を誘導し、タンパク質の動員を促進します23。DN...
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開示事項
Melvin A. ParkとMatthew Willettsは、timsTOF装置の製造元であるBruker Daltonics Inc.の従業員です。
謝辞
この資料は、助成金番号の下で全米科学財団が支援する研究に基づいています。HRD-1547798およびグラント番号HRD-2111661 です。これらのNSF助成金は、科学技術研究センター(CREST)プログラムの一環としてフロリダ国際大学に授与されました。これは、フロリダ国際大学の卓越したプログラムである環境研究所からの寄稿番号1672です。米国国立衛生研究所(NIH)は、助成金No.フランシスコ・フェルナンデス・リマとグラントNo.にR21AI135469。ベンジャミン・A・ガルシア(Benjamin A. Garcia)にR01HD106051され、全米科学財団(National Science Foundation)から助成金番号で授与された。CHE-2127882 から Benjamin A. Garcia 宛て。著者らは、分析法開発の初期における Mario Gomez Hernandez 博士の初期サポートに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| -80度;C フリーザー | |||
| 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10010023 | 動物由来フリー |
| 1 mL ピペットチップ | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL、非滅菌、非ろ過、ラック付きチップ |
| 1.5 mL マイクロ遠心チューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14-282-300 | これらのチューブを使用して、最大1.5 mL 10 & マイクロまでのサンプル量を簡単かつ安全に処理できます |
| 。L ピペットチップ | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL、非滅菌、非ろ過、ラック付き |
| 10% NP-40 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 28324 | NP-40 サーファクタアンプ 洗剤溶液 |
| 10x ダルベッコ'Ca2+/Mg2+なしのPBS | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mLコニカルチューブ | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL ゲルローディングピペットチップ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 02-707-138 | フィッシャーブランド ゲルローディングのヒント、1–200 μL |
| 200 & マイクロ;L ピペットチップ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 94060310 | Finntip Flex 200μL型、非滅菌、ろ過なし、ラック付きチップ |
| 2x Laemmli サンプルバッファー | Bio-Rad | 1610737 | SDS-PAGE用プレミックスタンパク質サンプルバッファー |
| 50 mL コニカルチューブ | Corning | 352070 | ファルコンコニカル遠心チューブ |
| 96ウェル平底プレート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12565501 | |
| 96ウェルプレート、V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| アセトン | シグマ アルドリッチ | 179124 | ACS 試薬、 ≥99.5% |
| アセトニトリル(ACN) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A998 | HPLC、フィッシャーケミカル |
| アセトニトリル0.1%ギ酸(v / v)、LC / MSグレード | モフィッシャーサイエンティフィック | LS120 | オプティマLC / MSグレード、サーモサイエンティフィ |
| AEBSF | サイエンティフィック | 328110500 | AEBSF塩酸塩、98% |
| 重炭酸アンモニウム、NH<サブ>4HCO<サブ>3シ | グマアルドリッチ | 09830 | バイオウルトラ、≥99.5% (T) |
| 水酸化アンモニウム溶液、NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | ACS 仕様を満たし、USP/NF モノグラフの試験用試薬仕様に適合 GR ACS |
| アルゴン (Ar) | エアガス | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC カラム | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 カラム、300 Å、 5 &マイクロ;メートル、4.6 mm X 250 mm、1K–15K |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | 熱ショック画分、pH 7、≥98% |
| 塩化カルシウム、CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | 無水、粉末、≥97% |
| 細胞解離バッファー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 13151014 | |
| セラミックスコアリングウェーハ | Restek | 20116 | |
| コンパス DataAnalysis 6.0 | ブルカー ダトニクス | ||
| コンパス HyStar 6.2 | ブルカー ダルトニクス | ||
| コンパス 同位体パターン | ブルカー ダルトニクス | ||
| コンパス timsControl4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well、96ウェルマイクロプレート、2.0 mL | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 89237526 | |
| ディスポーザブルセルリフター | モフィッシャーサイエンティフィ | 08100240 | Fisherbrandセルリフター;使い捨てリフターは細胞層をすばやく除去 |
| 使い捨てペレット乳棒 | モフィッシャーサイエンティフィック | 12-141-363 | ッシャーブランド ペレット乳棒;タンパク質とDNAペレットを再懸濁するか、微量遠心チューブで軟組織を粉砕 |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| ギ酸 (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS 試薬、≥96% |
| 溶融シリカキャピラリー75 μm ID x 363 μm OD( | Molex(Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | 島津 | 島津製作所 プロミネンス 20 HPLC UFLC システム | |
| 塩酸、HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS 試薬、37% |
| ハイパーカーボ 30-40 μm カーボン 150–300 Å | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 60106-402 | |
| ハイパーセップカートリッジ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 60109-404 | |
| LC / MSキャリブレーションスタンダード、ESI-ToF | アジレント | G1969-85000 | ミックス |
| マグネシウム、MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | 無水、≥98% |
| メタノール、HPLC用 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A454 | Optima for HPLC、フィッシャーケミカル |
| 微量遠心チューブアダプター | GL Sciences 501021514 | ||
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS サンプルバイアル、LaPhaPack、スナップ、12 mm x 32 mm | LEAP PAL パーツ | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | サーモフィッシャー サイエンティフィック | モデル:ND3300 | |
| 窒素 (N2) | エアガス | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH インジケーターストリップ、Instachek | Micro Essentialラボ | JR-113 | モデル:塩化水水素 |
| カリウム、KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS試薬、99.0%–100.5% |
| 圧力注入セル | Next Advance | モデル:PC77 | |
| 無水プロピオン酸 | シグマAldrich | 8.00608 | 合成冷蔵 |
| 遠心分離機用(700–18,000 x g) | NuAire、モデル:Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD プレキャストポリアクリルアミドゲル、8.6 cm × 6.7 cm (W ×L)、ミニプロティアン電気泳動細胞 |
| 酪酸ナトリウム | モフィッシャーサイエンティフィック | A11079.06 | 98 +% |
| 塩化ナトリウム、NaCl | グマアルドリッチ | S9888 | ACS試薬、≥99.0% |
| SPEディスク、C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPEディスク、C18、CDS Analytical、90 mm x 0.5 mm、12 & マイクロ;m |
| SpeedVac+ 真空ポンプとプレートローター | サヴァント | モデル: SC210A | |
| ショ糖 | ミリポア | 1.07651 | 微生物学に最適 |
| 硫酸、H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF 質量分析計 | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| トリフルオロ酢酸(TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | HPLCに適しています。99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | モデル:TR263 | |
| プシンプロテアーゼ、MSグレード | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 90057 | |
| チューブローテーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 88881001 | |
| ボルテックスミキサー | モフィッシャーサイエンティフィック | 88880017 | |
| 0.1%ギ酸(v / v)を含む水、LC / MSグレード | サーモフィッシャーサイエンティフィック | LS118 | Optima LC/MSグレード、Thermo Scientific |
参考文献
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