MCF-7細胞の増殖と遊走を阻害するサリドロシドの薬理作用と分子機構の探索

サマリー

現在のプロトコルはMCF-7セル拡散および移動の禁止のサリドロシドの薬理学の行為そしてメカニズムを評価するための広範囲の作戦を記述する。

要約

サリドロシド(Sal)には、抗発がん性、抗低酸素性、および抗炎症性の薬理活性が含まれています。.しかし、その根底にある抗乳がんメカニズムは不完全にしか解明されていません。それ故に、このプロトコルは人間の乳癌MCF-7セルの悪性増殖のPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1細道の調整のSalの潜在性を解読するように意図した。まず、MCF-7に対するSalの薬理活性をCCK-8および細胞スクラッチアッセイによって評価した。さらに、MCF-7細胞の耐性は、遊走およびマトリゲル浸潤アッセイによって測定されました。細胞アポトーシスおよびサイクルアッセイでは、MCF-7細胞をそれぞれアネキシンV-FITC/PIおよびフローサイトメトリー解析用の細胞周期染色検出キットを用いて段階的に処理しました。活性酸素種(ROS)および^Ca2+のレベルをDCFH-DAおよびFluo-4 AM免疫蛍光染色によって調べました。Na+-K+-ATPaseおよび^Ca2+-ATPaseの活性は、対応する市販キットを用いて測定した。アポトーシスおよびPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路におけるタンパク質および遺伝子発現レベルは、それぞれウェスタンブロットおよびqRT-PCR解析を用いてさらに決定された。Sal処理は、用量依存的な効果でMCF-7細胞の増殖、遊走、および浸潤を有意に制限することがわかりました。一方、サル投与は、MCF-7細胞を劇的にアポトーシスと細胞周期停止に追いやった。免疫蛍光試験では、SalがMCF-7細胞におけるROSおよび^Ca2+産生を観察的に刺激することが示されました。さらなるデータにより、Salはアポトーシス促進性タンパク質であるBax、Bim、切断されたカスパーゼ-9/7/3、およびそれらに対応する遺伝子の発現レベルを促進することが確認されました。一貫して、Sal介入は、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、およびFoxO1タンパク質およびそれらに対応する遺伝子の発現を顕著に減少させた。結論として、Salは、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路を阻害することにより、MCF-7細胞の悪性増殖、遊走、および浸潤を減少させる可能性があるため、乳がんを治療するための潜在的なハーブ由来の化合物として使用できます。

概要

最も一般的に診断されるがんの1つであり、最も一般的な悪性腫瘍の1つである乳がんは、最新の統計によると、2020年までに世界中で230万例が発生し、全^{がん症例の}11.7%を占めています1。乳がんの一般的な症状には、乳房の圧痛とうずき、乳房のしこりと痛み、乳頭の分泌物、びらんまたはくぼんだ皮膚、および腋窩リンパ節の肥大が含まれます^1,2。さらに憂慮すべきことに、乳がんの新規患者数と全体的な発生率は毎年圧倒的な速度で増加し続けており、がん^関連死の6.9%を占めています1。現在、乳がんの介入は、化学療法、手術、放射線療法、および包括的な治療が中心です。治療は患者の再発率と死亡率を効果的に低下させることができますが、長期治療の適用はしばしば多剤耐性、広範囲の脱毛、吐き気と嘔吐を引き起こし、深刻な精神的および心理的負担を引き起こします^2,3。特に、乳がんによる多臓器転移の潜在的なリスクは、薬物療法の新しいハーブ源を探すことを人々に強いています^4,5。

ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)を介したシグナル伝達は、複数の遺伝子の発現に影響を与えるスプライシングを介して、乳がんの増殖、増殖、および生存に関与し^{ています6。}PI3Kの下流シグナルセンシングタンパク質として、プロテインキナーゼB(AKT)が哺乳類のラパマイシン標的(mTOR)タンパク質と結合して乳がんをさらに増加させる可能性があることを示唆する多くの証拠があります^7,8,9。さらに、PI3K / AKT / mTORシグナル伝達の不活性化は、乳がんの悪性増殖を阻害し、アポトーシスを刺激する薬物の重要な要素であるとも主張されています^10,11,12。腫瘍微小環境における極端な低酸素状態は、低酸素誘導性第1因子アルファ(HIF-1α)の大規模な急増を余儀なくされ、乳がんの進行をさらに悪化させることはよく知られています13,14,15。並行して、AKT刺激はHIF-1αの過剰蓄積にもつながり、乳がんサンプルのアポトーシスを制限します^16,17。興味深いことに、PI3K-AKT-HIF-1αシグナル伝達の活性化は、肺がん¹⁸、大腸がん¹⁹、卵巣がん²⁰、前立腺がん²¹など、さまざまながんの病理学的進行と転移に関与していることが確認されています。HIF-1αによって調整されることに加えて、分岐頭部転写因子1(FoxO1)の過剰発現は、AKTシグナル伝達刺激によっても引き起こされ、乳がん細胞の周期停止とアポトーシスの阻害を促進します^22,23。まとめると、上記の確かな証拠は、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1シグナル伝達のカスケードの阻害が、乳がんにおける薬物療法の潜在的な新規標的である可能性があることを示唆しています。

サリドロシド(Sal)は、抗癌^24,25、抗低酸素^26,27,28,29、および免疫増強薬理活性³⁰を発揮することが広く実証されています。水に溶けやすい薄茶色または褐色の粉末であり、フェニルエタノイド配糖体の一種であり、化学構造式はC₁₄H 20 O₇であり、分子量は_300.3^31,32である。現代の薬理学的研究は、SalがPI3K-AKT-mTORシグナル伝達を抑制することにより、胃癌細胞のアポトーシスを促進することができることを実証している²⁴。さらなる証拠はまた、Sal治療によるPI3K-AKT-HIF-1αシグナル伝達の抑制が、化学療法剤に対する感受性を高めることによって癌細胞のアポトーシスに寄与する可能性があることを示唆しています²⁵。証拠はまた、サルが細胞の移動と浸潤を制限し、ヒト乳がんMCF-7細胞のアポトーシスを促進することによって周期停止を引き起こすことを示唆しています^33,34。しかし、SalがPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1シグナル伝達を調節し、MCF-7細胞の悪性増殖を阻害できるかどうかは、まだ不明である。従って、このプロトコルはPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1細道によってMCF-7セル移動、浸潤、細胞周期およびapoptosisに対するSalの効果を探検することを向けた。細胞遊走や浸潤の評価、フローサイトメトリーによるアポトーシスや細胞周期の検出、活性酸素種(ROS)、^Ca2+蛍光測定など、従来型の低コストで独立した実験からなる統合研究戦略は、従来の漢方薬を用いた抗がん研究の実験の全体的なデザインの参考となります。本研究の実験過程を図1に示す。

プロトコル

本研究に用いたMCF-7細胞は、市販の供給源から入手した( 材料表参照)。

1. 細胞培養

1. MCF-7細胞を加湿した5%_CO2 雰囲気、37°C、10%FBSおよび1%ペニシリン(10,000 U/mL)/ストレプトマイシン(10,000 μg/mL)を含むDMEMで培養します( 材料表参照)。
   注:ディッシュの底の90%を覆う細胞を実験に用い、対照群、塩酸ドキソルビシン群(DXR、5μM)、Sal群(20μM、40μM、80μM)、または対照群、LY294002(10μM、PI3K阻害剤)群、Sal(80μM)群、LY294002(10μM)+Sal(80μM)群に割り付けた( 材料表参照)。

2. 細胞生存率アッセイ

注: この手順の詳細については、以前のレポート²⁷ を参照してください。

1. 密度8 x 10⁴ 細胞/ウェルのMCF-7細胞を96ウェルプレートに播種し、細胞が接着するまで、Sal(10 μM、20 μM、40 μM、80 μM、160 μM、および320 μM)で24時間またはSal(20、40、80 μM)で12時間/24時間/36時間/48時間インキュベートします。
2. 処理後、MCF-7細胞を10 μL/ウェルのCCK-8溶液( 材料表を参照)と2時間共インキュベートします。次に、自動マイクロプレートリーダーで450nm(_OD450)の光学濃度を測定します。

3. 細胞の遊走と浸潤

注:この手順の詳細については、以前のレポート³⁵を参照してください。

1. 2 mL の 5 x 10 6 細胞/mL 細胞を⁶ ウェルプレートに播種し、皿の底の 90% を覆うようにインキュベートします。
2. 滅菌ピペットチップで細胞単層の中心に沿って線状の引っ掻き傷を巻きます。0時間、24時間、48時間で光学顕微鏡を使用して画像を取得します。
3. Image Jソフトウェアを使用して、引っかき傷の幅を測定します。
4. トランズウェルアッセイでは、MCF-7細胞を血清培地なしで懸濁し、マトリゲルの有無にかかわらず、プレコートされた上部トランスウェルチャンバーにシードします( 材料表を参照)。
5. トランズウェルチャンバーの底部では、化学誘導剤としてDMEM完全培地を使用します。24時間後、上部チャンバー内の細胞を除去し、残りの侵襲性細胞および移動細胞をメタノール³⁵で固定する。
6. MCF-7細胞をクリスタルバイオレット溶液で染色します( 材料表を参照)。光学顕微鏡を使用して画像を撮影します。

4. Na+-K+-ATPaseおよび^Ca2+-Mg2⁺-ATPaseの活性評価

1. ビシンコニン酸(BCA)キットを使用して、製造元の指示に従って、溶解したMCF-7細胞のタンパク質濃度を測定します( 材料表を参照)。
   1. 溶解した細胞のサンプルを対応するグループの96ウェルプレートに加えます。その後、作業溶液を加えて、さらに37°Cで5分間インキュベートします。最後に、多機能マイクロプレートリーダーで_OD636 の値を測定します。

5. アポトーシスと細胞周期のフローサイトメトリー解析

注:この手順の詳細については、以前のレポート³¹を参照してください。

1. 細胞を消化し、回収してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、アネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウム(PI)( 材料表を参照)で20分間染色した後、フローサイトメーターを使用してアポトーシス細胞の数を決定します。
2. 再懸濁したサンプル溶液とPI溶液を混合して30分間インキュベーションした後、フローサイトメーターで検出します。

6. DCFH-DAおよびFluo-4 AM蛍光染色

注: この手順の詳細については、以前のレポート²⁹ を参照してください。

1. MCF-7細胞を10 μM DCFH-DA 蛍光プローブ( 材料表参照)を用いて37°Cで20分間インキュベートします。 PBSで3回洗浄して余剰DCFH-DAを十分に除去した後、励起波長488nm、発光波長525nmの蛍光強度を蛍光顕微鏡で検査します。
2. MCF-7細胞を5 μM Fluo-4 AM蛍光プローブ溶液( 材料表参照)と37°Cで45分間インキュベートします。 PBSで3回洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて、励起波長488nm、発光波長516nmの蛍光強度値を求めます。

7.ウェスタンブロット

1. 異なる薬物を含む5 x 10 6細胞/mL細胞懸濁液2 mLを⁶ ウェルプレートに加え、37°C、5%_CO2 インキュベーターで24時間培養します。
   注:ウェスタンブロット解析のグループは、対照群、LY294002(10μM)群、Sal(80μM)群、LY294002(10μM)+Sal(80μM)群として設定しました( 材料表参照)。
2. 細胞と上清を回収し、560 × g 、4°C、3分間遠心分離します。上澄みを捨て、予冷したPBSで2回洗浄する。各洗浄後、細胞を560 × g 、4°C、3分間遠心分離します。
3. ステップ 7.2 の細胞サンプルに 50 μL の溶解バッファーを加え、15 分間のアイスバスを行います。8550 × g 、4°C、10分間遠心分離し、上清タンパク質サンプルを回収します。
4. BCA法を用いてタンパク質濃度を検出した後、ステップ7.3のタンパク質サンプルとローディングバッファーを4:1の割合で混合し、金属浴中で100°Cで10分間変性させ、室温まで冷却します。
5. ステップ7.4のタンパク質サンプル20 μgを添加し、10% SDS-PAGE(材料表を参照)を使用して分子量³⁵の異なるタンパク質を分離し、0.22 μmのPVDFメンブレンに移します。5% BSAで閉塞した後、メンブレンを対応する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。
   注:一次抗体の希薄濃度は1:1,000です:切断カスパーゼ-9/7/3(CC-9/7/3)、Bim、Bax、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、FoxO1、およびβ-アクチン( 材料表を参照)。
6. 翌日、メンブレンをヤギ抗ウサギIgG二次抗体と37°Cで2時間インキュベートします。 ECL化学発光溶液を使用してメンブレンを現像し、非接触定量ウェスタンブロットイメージングシステムを使用して画像を撮影します( 材料表を参照)。

8. qRT-PCRの

1. 遠心分離を行い、MCF-7細胞を560 x g 、4°C、3分間回収し、500 μLのバッファーRL1を5 × 10⁶ 細胞に加えます。細胞塊が見えなくなるまでピペットで繰り返しブローして混合します。
   注:バッファー RL1 は、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。
2. ステップ8.1の細胞ホモジネートをコレクションチューブに埋め込まれたDNAクリーニングカラムに移し、8,550 × g 、4°C、2分間遠心分離します。DNAクリーニングカラムを取り外し、上清をコレクションチューブに保管します。
   注:DNA クリーニングカラムとコレクションチューブは、トータル RNA 分離キットの 2 つのコンポーネントです( 材料表を参照)。
3. ステップ8.2の上清500μLに緩衝液RL2 800 μLを加え、穏やかに混合する。
   注:バッファー RL2 は、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。使用前に、60 mLの緩衝液RL2に120 mLの無水エタノールを加えてください。
4. ステップ 8.3 の混合物 700 μL をコレクションチューブに埋め込まれた RNA 専用カラムに移し、8,550 × g で 4 °C で 1 分間遠心分離します。回収管内の廃液を廃棄します。
   注:RNA 専用カラムは、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。
5. ステップ8.4を繰り返して、ステップ8.3の残りの混合物を処理します。
6. 500 μL のバッファー RW1 を RNA 専用カラムに添加し、8,550 × g で 4 °C、1 分間遠心分離します。回収管内の廃液を廃棄します。
   注:バッファー RW1 は、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。
7. 700 μL のバッファー RW2 を RNA 専用カラムに添加し、8,550 × g で 4 ◦C で 1 分間遠心分離します。回収管内の廃液を廃棄します。手順8.7を一度繰り返します。
   注:バッファー RW2 は、トータル RNA 単離キットの成分の 1 つです( 材料表を参照)。
8. RNA のみのカラムをコレクションチューブに戻し、8550 × g で 4 °C、2 分間遠心分離して、残りのバッファー RW2 を除去します。
9. RNA 専用カラムを新しいコレクションチューブに移し、65 °C で予熱した RNase フリー ddH₂O 100 μL を RNA 専用カラムのメンブレンの中央に滴下します。25°Cで2分間置き、8,550 × g 、4°C、1分間遠心分離してRNA溶液を回収します。
   注:RNase_{フリーddH2O}は、total RNA単離キットの成分の1つです( 材料表を参照)。
10. 5x反応バッファー4 μL、オリゴ(dT)₁₈ プライマー1 μL、ランダム六量体プライマー1 μL、遺伝子特異的プライマー1 μL(表1を参照)、酵素ミックス1 μL、およびステップ8.9のRNA溶液5 μgを100 μLの8チューブストリップに加えます。反応系にRNaseフリーの水を20 μLまで添加します。
11. システムの反応条件を次のように設定します:(1):95°C、30秒、1サイクル。(2):95°C、5秒、50サイクル、60°C、34秒;(3):95°C、5秒、1サイクル、65°C、60秒、97°C、1秒;(4):42°C、30秒、1サイクル。qRT-PCR手順を実行します。
    注:標的遺伝子の相対発現レベルは、2^−ΔΔCT法^36,37によって定量的に分析された。qRT-PCR解析に用いた各遺伝子のプライマー情報を表1に示します。

9. 統計解析

1. データを 3 つの独立した実験の平均±標準偏差として表します。
2. グラフ作成および分析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキーの検定を使用して、複数のグループ間の比較を分析します。この研究では、 P < 0.05 を統計的に有意なものとして定義しました。

結果

MCF-7細胞の過剰増殖の抑制と創傷治癒の遅延に対するSalの効果
乳がんに対するSalの可能性を探るために、まずヒト乳がんMCF-7細胞株の細胞増殖毒性と引っかきアッセイを用いて、その抗がん特性をテストしました。これらの細胞をSal(5〜320μM)の濃度系列と24時間共インキュベートし、細胞増殖をCCK-8アッセイを用いて評価した。細胞増殖に対するSalの用量依存的な阻害効果が観察され、40 μMで細胞の活力が50%低下しました(図2A)。次に、20 μM、40 μM、および 80 μM の塩分濃度を、その後の時点および創傷治癒評価用に選択しました。図2Bの結果は、Salが時間の経過とともにMCF-7細胞の活力を阻害し、24時間の共インキュベーション後にMCF-7細胞の活力が50%減少する可能性があることを示しています。図2C-Rは、創傷スクラッチアッセイによって決定された、

ディスカッション

乳がんはあらゆる年齢層に罹患し、計り知れない肉体的・精神的負担と大きな^{経済的圧力を引き起こし}ます1。また、罹患率や死亡率が年々増加している乳がんは、従来の治療法を超えた効果的なハーブベースの複合療法の模索という点でも世界的に注目されています^4,5。有望なことに、多くの証拠がSal ^24,25,38の抗がん効果を明らかにしています。残念ながら、乳がんにおけるサルの役割と根底にある分子メカニズムは、まだほとんど不明のままです。この研究は、ヒト乳がんMCF-7細胞株の増殖、遊走、および浸潤に対するSalの有意な阻害効果を強調しています。その後、MCF-7細胞の刺激性アポトーシスと周期停止におけるSalの可能性を明らかにしました。一方、これらのデータは、サル投与がROSと^Ca2+

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1%ペニシリン/ストレプトマイシン	HyClone SV30010
AKT抗体	ImmunoWay Biotechnology Company	YT0185
Annexin V-FITC/PIキット	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	AP101
自動マイクロプレートリーダー	Molecular Devices	SpectraMax iD5
Bax antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#5023
BCAキット	バイオシャープライフサイエンス	BL521A
Bcl-2抗体	Cell Signaling Technology, Inc.	#15071
Bim抗体	Cell Signaling Technology, Inc.	#2933
Ca2+–ATPaseアッセイキット	南京建城バイオエンジニアリング研究所	A070-4-2
細胞計数キット-8	バイオシャープライフサイエンス	BS350B
細胞周期染色キット	マルチサイエンス・バイオテック株式会社	CCS012
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technology, Inc. (株)	#9661
cleaved caspase-7	Cell Signaling Technology, Inc. (株)	#8438
cleaved caspase-9	Cell Signaling Technology, Inc. (株)	#20750
クリスタルバイオレット溶液	ビヨタイムバイオテクノロジー	C0121
DMEM 高グルコース培養培地	サービスバイオテクノロジー株式会社	G4510
ドキソルビシン塩酸塩	MedChemExpress	HY-15142
ECL 化学発光溶液	バイオシャープ ライフサイエンス	BL520B
ウシ胎児血清	プロセル ライフサイエンス &テクノロジー株式会社	164210
フローサイトメーター	BD	FACSCanto
Fluo-4 AM	Beyotime Biotechnology	S1060
FoxO1 antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT1758
ヤギ抗ウサギIgG二次抗体	マルチサイエンス・バイオテック株式会社	70-GAR0072
GraphPad プリズムソフトウェア	ラホーヤ	バージョン6.0
HIF-1&α; 抗体	アフィニティバイオサイエンス	BF8002
ヒト乳がん細胞株 MCF-7	プロセル ライフサイエンス &テクノロジー株式会社	CL-0149
ローディングバッファー	Biosharp Life Sciences	BL502B
LY294002	MedChemExpress	HY-10108
Matrigel	Thermo
356234 mTOR抗体	サービスバイオテクノロジー(株)
Na+–K+–ATPaseアッセイキット	南京建城バイオエンジニアリング研究所	A070-2-2
光学顕微鏡	オリンパス	IX71PH
p-AKT抗体	ImmunoWay Biotechnology Company	YP0006
PI3K抗体	Servicebio Technology Co., Ltd.
p-PI3K 抗体	Affinity Biosciences	AF3241
定量的ウェスタンブロットイメージングシステム	Touch Image Pro	eBlot
逆転写ファーストストランドcDNA合成キット	株式会社サービスバイオテクノロジー	G3330-100
ROSアッセイキット	Beyotime Biotechnology	S0033S	DCFH-DA蛍光プローブはここに含まれています
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd.	H-040
SDS-PAGEキット	サービスバイオテクノロジー(株)	G2003-50T
Total RNA Isolation kit	Foregene	RE-03014
Trypsin	HyClone	SH30042.01
β-actin	Affinity Biosciences	AF7018