方法論記事

両性における多発性硬化症のモデル化:MOG35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎

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DOI：

10.3791/65778

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2023年10月13日

 ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

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サマリー

実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症の最も広く使用されているマウスモデルの1つです。現在のプロトコルでは、雌雄のC57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドを免疫し、主に尾と四肢の上行麻痺を引き起こします。ここでは、EAEの誘導と評価のプロトコルについて説明します。

要約

多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)に影響を与える慢性自己免疫性炎症性疾患です。これは、性別で有病率が異なり、男性よりも女性に多く影響し、結果が異なり、女性よりも男性でより攻撃的な形態を示すことを特徴としています。さらに、MSは、臨床的側面、放射線学的、および病理学的特徴の点で非常に異質です。したがって、病理学のできるだけ多くの側面の調査を可能にする実験動物モデルを利用する必要があります。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、マウスで最もよく使用されるMSモデルの1つであり、免疫系の活性化から中枢神経系の損傷まで、さまざまな疾患の特徴をモデル化しています。ここでは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(MOG35-55)免疫を使用して、雌雄のC57BL / 6JマウスにEAEを誘導するためのプロトコルについて説明します。また、これらのマウスの免疫後28日間(28dpi)の毎日の臨床スコアと運動能力の評価についても報告します。最後に、中枢神経系レベルでの基本的な組織学的解析を、疾患誘発性損傷の原発部位としての脊髄に焦点をあてて説明する。

概要

多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)に影響を与える慢性自己免疫性炎症性疾患です。炎症細胞の血管周囲浸潤、脱髄、軸索喪失、およびグリオーシスの存在を示します1。その病因は不明のままであり、その臨床的側面、X線写真、および病理学的特徴は、この疾患の顕著な異質性を示唆しています2。

その病因と複雑さが不明なため、現在のところ、ヒトMS3,4に示されたすべての臨床的および放射線学的特徴を再現する動物モデルはありません。しかし、MS 3,4のさまざまな側面を研究するために、さまざまな動物モデルが採用されています。これらのモデルでは、疾患の開始は通常、非常に人工的であり、臨床徴候の発症の時間枠はヒトとマウスで異なります。例えば、ヒトでは、疾患の根底にある病態生理学的過程は、臨床症状の発症前に何年も検出されない。逆に、実験者は、MS導入後数週間または数日以内に動物モデルの症状を検出することができます4。

MSに特徴的な脱髄の特徴は、ウイルス誘発性モデル(例:Theilerマウス脳脊髄炎ウイルス)、毒性物質(例:クプリゾン、リゾレシチン)によって誘発されるモデル、および実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)のさまざまな変異体である5。各モデルは、この疾患のいくつかの特定の側面を研究するのに役立ちますが、MS6のすべての機能を再現するものはありません。したがって、特定の実験ニーズと対処すべき科学的問題を考慮して、正しいモデルを選択することが重要です。

ミエリン由来抗原に対する免疫処置により、EAEは感受性マウスのCNS成分に対する自己免疫応答を誘発することによって誘導されます。広範囲の免疫病理学的および神経病理学的メカニズムの相互作用は、免疫マウスにおけるMSの主要な病理学的形質(すなわち、炎症、脱髄、軸索喪失、およびグリオーシス)の発症を引き起こします7,8。マウスは接種後2週目頃から臨床症状を示し始め、一般的に尾から四肢、前肢にかけて上行麻痺を示します。臨床スコア(すなわち、疾患関連欠損の蓄積の定量化)は、一般に5段階評価7を用いて評価される。

タンパク質またはペプチドによる能動的免疫、または脳原性T細胞の受動的導入を使用して、異なる遺伝的背景を持つマウス(例、SJL/J、C57BL/6、および非肥満糖尿病(NOD)マウス)にEAEを誘導できます。ミエリンプロテオ脂質タンパク質(PLP)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)は、免疫原が通常産生される自己CNSタンパク質の例です。特に、PLPの免疫優性エピトープ(PLP139−151)で免疫されたSJL/Jマウスは再発寛解(RR)疾患の経過をたどり、免疫優性MOG35-55 ペプチドで免疫されたC57BL/6Jマウスは慢性的なEAEを示す1。多発性硬化症の進行、疾患におけるB細胞の役割、インサイドアウトのメカニズム、再髄鞘形成の研究の難しさなど、いくつかの制限があるにもかかわらず、EAEモデルは自己免疫および神経炎症プロセスの理解に大きく貢献し、MS分野の知識を増やし、この疾患の新しい治療法の開発を可能にしました4。6.

本研究では、活性EAEの特定の形態であるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(MOG35-55)誘導型9,10,11,12に着目しました。MOG35-55誘発EAEは、慢性型のMSをモデル化します。予防接種後、マウスは予防接種後1週間以内に無症候性期を経験し、その後、通常、予防接種後2週間目に発症し、予防接種後3週間から4週間の間に、病気は慢性化し、累積された赤字から完全に回復する可能性はありません7,8,13.興味深いことに、男性と女性の疾患を比較した研究が少ないとしても、文献14に存在するほとんどの研究で、発生率、疾患の発症、経過、または進行に男性と女性の間に差は観察されていません。

対照的に、ヒトでは、これらのパラメータは強く性的二形であることが知られています2。多発性硬化症は男性よりも女性に多く罹患します。しかし、男性は一般的により攻撃的な形態の病気を発症します2。この証拠は、生殖腺ホルモンの本質的かつ複雑な役割を示唆しています15。それにもかかわらず、病理学における性ホルモンの役割と作用機序は不明のままです。さらに、動物モデルからのデータは、エストロゲンとアンドロゲンの両方が性特異的な方法で病理学のさまざまな管にプラスの効果を及ぼすという考えを支持しています16,17。

いくつかの研究はまた、プロゲステロンの神経保護作用、前髄形成作用、および抗炎症作用を示唆しており18 、MS患者における証拠は乏しいが18、神経活性ステロイド(すなわち、プレグネノロン、テトラヒドロプロゲステロン、ジヒドロプロゲステロンなどの神経系による de novo 合成ステロイド)も病理学的経過に影響を与える可能性がある19.まとめると、これらのデータは、末梢と中枢神経系の両方で産生される性ホルモンが、疾患の発症と進行に重要かつ性特異的な役割を果たしているという考えを支持しています。したがって、本研究では、雄と雌の両方の動物から別々のデータを収集することを強く求めます。

組織病理学的観点から、脊髄の白質は、単核炎症性浸潤および脱髄の多発性、合流領域を特徴とするこのモデルにおけるCNS損傷の主要な部位として機能する8。したがって、C57BL / 6JマウスにおけるMOG35-55誘発性EAEの誘導のためのこのプロトコルを説明する際に、私たちは2つの性別の疾患転帰を考慮に入れ、脊髄に関するいくつかの組織病理学的洞察を提供します。

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プロトコル

本作業における動物の飼育と取り扱いは、2010年9 月22日の欧州連合理事会指令(2010/63/UE)に従って行われました。本研究で報告されたすべての手順は、イタリア保健省(407/2018-PR)およびトリノ大学の倫理委員会(プロジェクトn°360384)によって承認されました。2010年にKilkennyらによって最初に発表されたARRIVEガイドラインに実験計画に準拠することをお勧めします20。開始する前に、必要な材料が揃っていることを確認してください( 材料表を参照)。MOG35-55 エマルジョンの調製に使用されるすべてのガラス器具および調理器具をオートクレーブで滅菌します。実験手順の概要を 図1に示します。

1. MOG35-55 エマルジョンの調製

注:エマルジョンを調製するには、MOG35-55、不完全フロイトアジュバント(IFA)、 結核菌 株H37Ra(MT)、および生理学的溶液が必要です( 材料表を参照)。

注意:熱殺されたMTは、自然免疫反応を刺激する可能性があります。吸入、摂取、皮膚や目への接触を避け、適切な個人用保護具を使用し、ボンネットの下の覆われた精密天びんでMTを計量してください。

解決組成筆記
2 mg/mL MOG35-55 ペプチド溶液凍結乾燥したMOG35-55ペプチドを生理液中で2 mg/mLの濃度で希釈したもの希釈した溶液を-80°Cで保存します。
5 μg/mL PT 溶液凍結乾燥PTを生理液で5μg/mLの濃度で希釈した。希釈した溶液を-80°Cで保存します。
乳剤免疫する各マウスに必要なエマルジョンの総容量は、300μLを次のように分割します。変質や汚染を避けるために、予防接種の日にエマルジョンを準備してください。
MOG35-55 の 200 μg/マウス、すなわち、MOG35-55 2 mg/mL 溶液 100 μL。
50 μLの生理液
150 μL の IFA
4 mg/mL MT、すなわち1.2 mg/マウス
生理学的解決塩化ナトリウム0.9%を蒸留水で希釈した。

表1: 予防接種手順に使用される溶液の組成。

  1. ガラスビーカーで溶液を調製し、最初に液体成分を加え、最後にMTを加えます。
    注:免疫する各マウスに必要なエマルジョンの総容量は、 表1に示すように分割して300 μLです。エマルジョンは非常に粘性があり、厚いため、調製および注入手順中に、特に数匹のマウス用の溶液を調製する場合、いくらかの損失が生じる可能性があります。免疫するマウスの数を少なくとも1.5〜2倍過大評価して、必要なエマルジョンの最終量を計算することをお勧めします。
  2. ビーカーを氷に入れ、18Gの針が付いたガラスシリンジを使用して溶液の乳化を開始します。
    注:エマルジョンは、例えば、2つのエアフリーガラスシリンジを三方活栓で接続し、プランジャーを前後に押して溶液を混合することによって、他の戦略を用いて調製することもできる21,22。
  3. 溶液を少なくとも15分間乳化します。一般的には、30分の乳化で十分です。エマルジョンの品質を確認するには、水で満たされた透明な容器にエマルジョンを一滴加えます:液滴がその構造を維持し、無傷のままであれば、エマルジョンの準備が整います。
  4. エマルジョンを免疫に使用する1 mLシリンジ内に直接入れ、使用するまで+4°Cで保管して、エマルジョンの厚さを維持し、変質や汚染を防ぎます。

2. 動物の選択と予防接種

  1. 動物の選択
    1. 8-10週齢で、最適体重が~20gの雌雄の成体C57BL/6Jマウスを選択します。病気に対する感受性は年齢や性別によって異なる可能性があるため、実験グループごとに年齢と性別が一致したマウスを必ず選択してください。
      注:マウスは、現在の手順が特定の体重範囲(17〜25 g)に最適化されているため、予防接種当日の体重が同等である必要があります。
    2. 45 cm x 25 cm x 15 cmのポリプロピレン製マウスケージに、22±°Cから2°C、12:12の明暗サイクル(08:00 AMに点灯)で、標準的な条件下で社会的孤立を避けるために、同性動物をグループ(n = 4-5/ケージ)で飼育します。食べ物と水を 自由に提供してください。
      注:最終的には、免疫動物における疾患経過の潜在的な変動性をさらに制限するために、十分な数の実験グループを形成することも提案します。また、EAE転帰の変動を決定する条件として予防接種のタイミングを説明する研究8,23もある。したがって、我々は、すべての動物においてほぼ同じ時間に、好ましくは毎日の明暗サイクル23の明るい時間帯に免疫化を行うことを提案する。ストレスを制限するには、予防接種日の前に動物を操作し、耳切りやタグなど、日常的な評価のために動物を簡単に識別できるようにマークを付けることが好ましい。
  2. 予防接種の手順
    注:動物のストレスを最小限に抑え、予防接種を最適化するために、手順が経験豊富な研究者によって実行されることを確認してください。予防接種を開始する前に、施設の動物管理および倫理委員会のガイドラインに従って麻酔方法を選択してください。当研究室では、イソフルランによる短時間の麻酔を行っています。
    1. マウスに麻酔をかけます:麻酔導入には4%イソフルラン、麻酔維持には1.5〜2%イソフルラン。麻酔が効くのを待ち、後ろ足と前足のつま先をつまんで麻酔のレベルを評価します。マウスが麻酔下にある間の目の乾燥を防ぐために、獣医が承認した眼軟膏を使用してください。
    2. 側尾静脈へのPT静脈内注射:血管拡張剤として作用するエタノール溶液でマウスの尾部を静かに塞ぎ、静脈を表示します。尾部の2つの側静脈のうちの1つに焦点を合わせ、30 Gの針を装着した0.5 mLのシリンジを使用して、500 ngのPT(すなわち、100 μLのPTを生理学的溶液で5 μg/mLの濃度で希釈)を注入します。
    3. MOG35-55 エマルジョンの皮下注射:26 G針付きの1 mLシリンジを使用して、以前に調製したエマルジョンの皮下注射を3回行います:脇腹の吻側部分の下に2回、尾の付け根に1回。各部位に注入されるエマルジョンの量は100μLであり、各マウスに注入されるエマルジョンの総量は300μLである。
      注:予防接種日は、予防接種後0日目(dpi)として記録されます。48時間後(すなわち、2dpiで)、以前に行ったものと等しいPTの別の静脈内注射を行う必要がある。麻酔なしで注射を行うことは、マウス拘束具を用いて行うことができる。ここで説明する手順は、マウスと研究者の両方にとっての動物の不快感や動き、またはリスクの可能性を回避するために、予防接種手順中にマウスの麻酔を誘発および維持することを目的としています。したがって、外科的処置はありません。ただし、実験プロセスを最適化するには、これらのステップ中に適切な無菌状態を維持し、これらの手順後のマウスの状態を監視することが重要です。
    4. マウスが注射から回復したことを確認するには、処置後にマウスを清潔なケージに入れ、胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで待ちます。マウスが完全に回復したら、他の動物と一緒にホームケージに戻します。

3. EAEフォローアップ

  1. 体重と食物摂取量
    1. 体重の減少は病気の進行の指標であるため、電子精密天びんを使用して動物の体重(BW)を毎日監視します。
      注:この減少は、動物ケアに関する制度的および倫理的委員会のガイドラインに従って、一定の割合を超えてはなりません。通常、動物が初期体重の20%以上を失った場合(すなわち、0dpiで記録された体重)、人道的エンドポイントの適用として犠牲にすべきである。安楽死法では、吸入のための深い不可逆麻酔(例:.、5%イソフルラン)とそれに続く斬首が含まれます。
    2. 動物が1日に食べた餌(g∙day-1∙animal-1)の食物摂取量(FI)を監視し、少なくとも週に1回、特定の容器内の餌の量を量り、2回の連続測定とケージ内にいる動物の数の間で経過した日数の食べた餌の量を割ります。
      注:この測定により、平均食物摂取量を推定できます。手足の麻痺を伴う臨床疾患の兆候の出現と蓄積のため、動物が後ろ肢でしっかりと立って餌容器や水筒に到達できない場合は、水をやりた餌をケージの床に置くことをお勧めします。追跡期間中の餌の摂取量をできるだけ正確に評価するために、マウスを濡らす前にこの餌の乾燥重量も測定しました。
  2. EAE中の発情周期性の評価
    1. McLeanらによって説明されているように、膣細胞診塗抹標本を評価して、少なくとも2サイクルの発情周期をチェックします24。膣塗抹標本中の3種類の原発細胞(有核上皮細胞、角化扁平上皮細胞、白血球)の存在に基づいて、発情周期の段階を次のように分類します。
      1. 発情前症として分類されるのは、円形で整形した有核上皮細胞のクラスターがほぼ排他的に存在することに基づいています。
      2. 角質化扁平上皮細胞の密集したクラスターの優勢な存在に基づいて発情として分類します。
      3. 暗く染色された小さな白血球の優勢な存在と角化扁平上皮細胞のわずかな存在に基づいて、メテストルスとして分類します。
      4. 暗く染色された小さな白血球とまれな角化扁平上皮細胞の非常に優勢な存在と、有核上皮細胞の出現の可能性に基づいて、ジストラスとして分類されます。
        注:男女ともにこの病気を評価するときは、発情周期による女性の変動性を確認することが重要です。特に予防接種後1週間目から2週目の間(すなわち、EAEの急性期)の発情周期の評価に焦点を当てることを提案する。予防接種手順は、この段階25内で発情周期の最も顕著な変化を引き起こすことが以前に示されています。さらに、動物が高い臨床スコア(特に>3)に達したときに塗抹標本を行うことは、後肢麻痺と後肢の緊張の欠如のために困難であることを考慮することが重要です。
  3. 臨床スコア
    1. 盲検化された治験責任医師に、動物の臨床スコアを毎日評価してもらいます。各動物に0から5の評価されたスコアを割り当て(表2を参照)、Racke7に記載されているように疾患経過26を評価します。
      注:体重の減少と同様に、動物ケアに関する制度的および倫理的委員会のガイドラインによると、臨床スコアの増加には人道的エンドポイントも必要です。一般に、動物が自律的に餌を食べることができなくなった場合(これは通常、私たちが使用する尺度に応じて、動物が少なくとも4のスコアに達したときに発生します)、人道的エンドポイントの適用として犠牲にする必要があります。
  4. ロータロッド試験によるモータ性能評価
    注:EAEの進行の評価は通常、臨床スコアを毎日割り当てることによって行われますが、これは完全に訓練された盲検化された研究者によって行われます。しかし、病気の進行をより定量的かつ客観的に評価することは有用かもしれません。以前の研究26では、ロータロッドテストを使用して、免疫された動物の運動能力を測定しました。van den Berg et al.27 によって記述されているように、疾患経過のより定量的かつ正確な臨床評価を行うために、ロータロッドテストによる運動性能の評価は、臨床スコア評価をサポートすることができます。詳細な説明については、van den Berg et al.27 を参照してください。
    1. マウスに、犠牲になるまで1dpi(つまり、28dpi)まで、毎日ロータロッドセッションを受けさせます。各セッションは 300 秒のセッションで構成され、その間にロッド速度を 4 rpm から 40 rpm まで直線的に増加させる必要があります。
    2. 動物のスコアを登録します。マウスがそのバランスを維持できず、デバイスから落ちると、地面に落下してセンサーがトリガーされ、時間が記録されます。したがって、パフォーマンスは低下するレイテンシとしてスコアリングされます。

等級臨床徴候形容
0元気臨床徴候は観察されません。動物は通常の口調と尾の動きを示します。つまずかずに歩きます。
0.5ゲートの障害グリルの上を歩いていると動物がつまずきます。
1リンプテール動物が尻尾の付け根で拾われると、尻尾が垂れ下がります(たるんだ尾)。
1.5リンプテールとゲート障害動物はたるんだ尻尾を示し、グリルの上を歩いているときにつまずきます。
2失調この動物は、一度仰向けになると立ち上がるのが困難になります。
2.5運動失調と後肢麻痺動物のディスプレイは、仰向けになると立ち上がれなくなり、後肢の1つのトーンが失われます。
3後肢の麻痺動物は両方の後肢の緊張を失います。
3.5後肢の麻痺および/または前肢の麻痺動物は両方の後肢と前肢の一部の色調を失います。実際、前肢の握力が低下していることを示しています。
4四肢麻痺動物は手足の調子を完全に失います。
4.5四肢麻痺と体温の低下動物は手足の調子を完全に失い、体温の低下を示します(寒いです)。
5死ぬか死ぬか動物は死にかけている(刺激に反応しない)か、死んでいる。

表2: EAEの進行を評価するために使用される臨床スコアリングシステム。

4. EAE誘発性病理組織学的徴候の脊髄レベルでの評価

注:ここでは、動物を犠牲にし、脊髄を採取して病理組織学的分析を行う手順を簡単に報告します。詳細な説明については、参考文献10、26、28、29 を参照してください。

  1. 固定と組織サンプリング
    メモ: 詳細については、参考資料10、26 を参照してください。
    1. 病気の慢性期に28dpiで動物を犠牲にします。
      1. 深い不可逆麻酔(ゾラゼパムとチレタミン80 mg / kg / Xylazine 10 mg / kgの腹腔内注射)によってマウスを麻酔します。.
      2. マウスに生理食塩水とそれに続く4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で経心灌流します。
        注:PFAを使用する際は注意してください:PFAは有毒であるため、適切な個人用保護具を使用して、吸入、摂取、皮膚や目との接触を避けてください。粉末を秤量し、溶液を調製し、ボンネットの下で灌流を実行します。
    2. 脊柱30から脊髄を取り外します。
    3. 脊髄を4%PFA溶液に24時間保存します。
    4. 0.01 M生理食塩水リン酸緩衝液(PBS)で数回洗浄します。
    5. 脊髄をパラフィンブロック30に埋め込む。
  2. 組織学的処置
    注: 詳細な説明については、Montarolo et al.10 を参照してください。
    1. ミクロトームを使用して厚さ10μmの脊髄横断切片を切断し、ゼラチンでコーティングされたスライドに収集します。マウス脊髄アトラス31の横断面に対応する図面に一致するように切片面を向ける。
    2. セクション32の脱パラフィン処理を行う。
    3. 切片をヘマトキシリンとエオシン32で染色します。
    4. セクション32を脱水します。
    5. 切片を封入剤で覆い、薬品フードの下で室温で乾燥させます。
      注:ヘマトキシリン-エオシン染色により、血管周囲炎症性浸潤(PvII)26の存在を検出することができ、これは疾患の徴候として評価されます28。
  3. 脊髄切片の定量分析
    1. 20倍対物レンズ29のデジタルカメラに接続された光学顕微鏡で染色切片の画像を取得します。
    2. 取得した画像を解析して、mm2あたりの浸潤数として表されるPvIIの数を取得します。
      注:取得した画像の解析には、画像解析ソフトウェアを利用すると便利です。この研究で提示された神経病理学的所見は、脊髄レベル全体を表すマウスあたりの脊髄の10の完全な断面(n = 8 /グループ)で定量化されています。

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結果

予防接種後のEAEフォローアップ
これは、以下のように評価されました。

体重と食物摂取量
二元配置分散分析(ANOVA)(独立変数としての性別と時間)は、特に導入後2週間以内に、雌雄のEAE動物のBWの減少を示しています(F(1,57) = 4.952、 p < 0.001; 図2A)。しかし、BWの性的二型は常に維持されています(図2A)。BWのパーセンテージ(F(1,57) = 23.935、 p <0.001; 図2B)、男女ともに、最初のBWと比較して、12dpiから17dpiの間で大きな損失(p < 0.001)を示しますが、20%の総損失を超えることはありません(<...

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ディスカッション

我々が記述したMOG35-55誘導EAEプロトコルは、C57BL/6Jマウス7,8,13において慢性型MSの発症につながりました。これらの代表的な結果では、免疫処置を受けた雌雄ともに慢性疾患を発症した(発症後に完全に回復せず、欠損を蓄積し、慢性期でCS1.5以上を維持する)ことを報告した。

多くの研究が、このモデル14で男性と女性の間に違いがないと報告しているとしても、両方の性別を考慮している研究はごくわずかです。しかし、MS2 で示される実質的な性的二型を考えると、2 つの性別の疾患転帰を研究することが第一の関連性を持つはずです。両性を含むより最近の研究のおかげで、いくつかの性的二型の存在もMOG35-55誘発EAE35<...

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開示事項

著者のいずれも、この記事の研究、著者、および/または出版に関して宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 and 2023-2027 to Department of Neuroscience Rita Levi Montalciniの支援を受けています。Cavalieri-Ottolenghi財団、オルバッサーノ、イタリア。BBは、INFRA-P、ピエモンテ地域(n.378-35)(2022-2023)およびPRIN 2020-20203AMKTWのフェローでした。Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus(FORB)の支援に感謝します。掲載料は、2031年ローターアクト地区、特にトリノ北東ローターアクトクラブからの寄付によって支えられています。原稿の校正をしてくれたElaine Millerに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
18 G x 1 ½“ガラスシリンジ用1.2 x 40 mm針 テルモTER-HYP-18G-112-PIN
光学顕微鏡に接続されたデジタルカメラNIKON DS-U1 デジタルカメラ
電子精密天びんMerckMod.Kern-440-47N、分解能0.1 g
Eosin YSigma-AldrichHT110216
ガラスシリンジピペット」ウルトラアセプト」10 mlサッコシステム 
ガラス製品(すなわち、エマルジョンを調製するためのベッカー)VWR213-1170、213-1172
マトキシリン(Mayer's)Sigma-AldrichMHS32フィルターをご使用ください。 
画像解析ソフトウェアFiji
Incomplete Freund'アジュバント (IFA)Sigma-AldrichF5506+4°C 
イソフルランウェロナファーマこの薬は吸入麻酔薬として使用されます。
雌雄のC57BL/6Jマウスジャクソン研究所、Envigo生後8-10週、最適な体重は~20 gです。 
ミクロトームライカ HistoCore BIOCUT R
封入剤 メルク107961
マウス ロタロッドウーゴ バジーレ #47600
マイコバクテリウム結核(MT)、H37Ra株 株式会社ディフコラボラトリーズ 231141+4 °Cで保存します。
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド 35-55 (MOG35-55)EspikemEPK1-80 °Cで保存。Cを生理液中で希釈(2 mg / mL)します。予防接種当日に準備して、改変や汚染をできるだけ避けてください。
光学顕微鏡NIKON eclipse 90i
パラホルムアルデヒド (PFA)Sigma-Aldrich158127+4 °リン酸緩衝液中でCを1回希釈(4%)。
百日咳毒素(PT)Duotech PT.181-80°に保管。C希釈(濃度5µg/mL)を生理液中で 
生理液(塩化ナトリウム0.9%溶液)B.ユーロスピタールA 032182038+4°Cで保存します。Cが開いたら。
生理食塩水リン酸緩衝液(PBS)Thermo ScientificJ61196.画像
ソフトウェア NIS-Element AR 2.10
シリンジ U-100 0.5 mL (30 G x 5/16"(0.30 x 8 mm)固定針&nbsp;NiproSYMS-0.5U100-3008B-EC
シリンジ U-100 1 mL 26G x ½”(0.45 x 12.7 mm) 針PIC20,71,26,03,00,354
目のための獣医軟膏Lacrilube, Lacrigel Europhta
XylazineRompunこの薬の混合物は、注射可能な麻酔薬および鎮静剤として使用されます。 
ゾラゼパムとチレタミンゾレチル  100この薬は、注射可能な麻酔薬、鎮静薬、筋弛緩薬、および鎮痛薬として使用されます
L003465ヘ使用前に取得用AP

参考文献

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
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Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 2/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

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MOG 35 55C57BL 6J

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