マウス糸球体の標識と分析のための効率的で迅速な方法

Summary

この研究は、CUBIC透明マウス腎臓からの糸球体を標識および分析するための、使いやすく完全でシンプルな一連の方法を提示します。糸球体数や体積などのデータは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)、または一般的な共焦点顕微鏡とImarisなどのソフトウェアを使用して簡単かつ確実に取得できます。

Abstract

糸球体は腎臓の基本単位です。したがって、糸球体を研究することは、腎機能と病理学を理解する上で極めて重要です。生物学的イメージングは直感的な情報を提供します。したがって、糸球体にラベルを付けて観察することは非常に重要です。しかし、現在使用されている糸球体観察法は複雑な操作を必要とし、その結果、ラベルの詳細や3次元(3D)情報が失われる可能性があります。透明で遮るもののない脳イメージングカクテルとコンピューター解析(CUBIC)組織透明化技術は、腎臓研究で広く使用されており、より正確な検出とより深い検出深さを可能にしています。マウス糸球体は、中分子量のFITC-デキストランの尾静脈注入とそれに続くCUBIC透明化法により、迅速かつ効果的に標識できることを見出しました。透明化したマウスの腎臓をライトシート顕微鏡(スライスした場合は共焦点顕微鏡)でスキャンし、腎臓全体のすべての糸球体の3次元画像スタックを得ることができた。適切なソフトウェアで処理することで、糸球体信号を簡単にデジタル化し、さらに分析して糸球体の数、体積、頻度を測定することができます。

Introduction

糸球体の数と量は、さまざまな腎臓病の診断と治療にとって非常に重要です^1,2,3,4,5。糸球体数推定のゴールデンスタンダードは、物理的なディセクタ/フラクショネーターの組み合わせです。ただし、この方法は特別な試薬と機器を必要とするため、時間がかかり^{、高価になります6,7,8,9}。生検は豊富な情報を提供しますが、明らかに、この方法は大まかな推定にのみ適しています^10,11。磁気共鳴画像法(MRI)、コンピュータ断層撮影法(CT)、X線などの医用画像技術も糸球体検出に広く使用されています^12,13,14,15が、そのような技術にはかさばる機器が必要です。マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)イメージング質量分析計¹⁶や厚切片および薄切片法¹⁷などの新しい方法も糸球体検出に使用されていますが、それらは依然として退屈で手間がかかります。

透明化技術の助けを借りて、より深い深さを観察し、厚い組織または臓器全体からさえ、より豊富で完全な情報を得ることができます18,19,20,21,22,23。そのため、腎臓の研究において透明性技術が広く用いられてきた²⁴。透明な腎臓における糸球体の観察と検出も関与しています。しかし、これらの発表された論文は、糸球体検出²⁵に簡潔に言及したに過ぎず、糸球体を標識するためにトランスジェニック動物²⁶、自己生産色素¹³、または高濃度抗体インキュベーション²⁷などの達成困難な標識方法を使用していた。さらに、透明な腎臓の糸球体を分析した研究もあったが、その分析は常に限定的であったり¹³、著者自身が確立した分析アルゴリズムに依存していたりした²⁶。

我々は以前、マウスの腎臓の糸球体を標識するより便利な方法を実証した²⁸。Imarisを用いることで、糸球体数、頻度、体積を素早く得ることができることが分かりました。したがって、ここでは、マウスの腎臓の糸球体を標識および分析するための、よりアクセスしやすく、包括的で、簡略化された一連の方法を提示します。

Protocol

この研究では、成体C57BL / 6マウス(6週齢、25〜30 g)を使用しました。すべての手順は、動物福祉と実験倫理の地域の規制に準拠して行われました。この研究は、四川大学生物医学研究倫理委員会の華西病院によって承認されました。

1.糸球体標識と組織調製

1. 糸球体ラベリング
   1. FITC-デキストラン(10 mg)を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1:1(1 mg:1 mL)の比率で溶解し、ワーキングプローブ溶液を調製します。
      注:ワーキング溶液は4°Cで1ヶ月間保存できます。
   2. C57マウスをマウス尾静脈固定具に入れます。ガーゼをお湯で濡らし、マウスの尻尾の真ん中にガーゼを巻き付け、尻尾を1分間温めます。
   3. 左右の尾静脈が見えるまで、マウスの尾を75%エタノールで拭きます。
   4. 1 mLのインスリンシリンジで100 μLの作業プローブ溶液を吸引し、マウス尾静脈にゆっくりと溶液を注入します。
   5. 注入後、プローブ溶液を30分間循環させます。マウスがケージ内で自由に動くようにします。
   6. 十分な循環が達成されたら、ペントバルビタールナトリウム(1%、60〜80 μg / kg)の腹腔内注射によりマウスを深く麻酔します。.
2. 腎臓のサンプリングと固定
   1. 麻酔をかけたマウスを仰臥位で解剖プレートに固定します。医療用テープで足を固定します。
   2. 皮膚の準備後、致死量のペントバルビタールナトリウム(1%、10 mg / kg)でマウスを安楽死させます。.
   3. 腹部を正中線で切開して、腹腔を露出させます。
   4. 腎臓を明らかにし、メスとハサミでヒュームフードで取り除きます。腎臓エンベロープを静かに取り外します。.
   5. 腎臓を採取し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで一晩固定します。
   6. 室温(RT)で振とうしながら、サンプルをPBSで1時間ずつ3回洗浄します。
   7. 顕微鏡検査のために腎臓を準備します。
      1. 共焦点顕微鏡検査のために腎臓をスライスする:脳マトリックス(1 mm鋼、40〜75 g)を使用して腎臓を1 mmの厚さのスライスにカットし、スライスの厚さを標準化します。スライスを4%PFAに移し、4°Cで一晩固定を続けます。
      2. ライトシート顕微鏡用の全腎臓:腎臓を4%PFAで4°C、48時間固定します。

2. 消込

1. 試薬調製
   1. 10%(重量/重量)のN-ブチルジエタノールアミン、10%(重量/重量)のTriton X-100、および80%ddH₂Oを混合して、CUBIC-L試薬を調製します。
   2. 45%(wt/wt)アンチピリン、30%(wt/wt)ニコチンアミド、0.5%(vol/vol)N-ブチルジエタノールアミン、および24.5%ddH₂Oを混合してCUBIC-R試薬を調製します。 溶液のpHが9.6〜9.8、屈折率(RI)が1.522であることを確認します。
      注:CUBIC-Lは脱脂化に使用され、CUBIC-Rは屈折率マッチングに使用されます。
2. 消込手続き
   1. 腎臓サンプルを50 mLの遠心チューブに集め、37°C、60 rpmで振とうしながらCUBIC-Lで透明化します。 CUBIC-Lは、満足のいく光透過性が得られるまで、4時間ごと(腎臓切片の場合)または24時間ごと(腎臓全体の場合)に交換してください。
      注:このプロセスには、腎臓スライスの場合は1日、腎臓全体の場合は5日かかります。
   2. サンプルをPBSで3回洗浄し、室温でそれぞれ1時間穏やかに振とうします。
   3. CUBIC-Rをサンプルに塗布し、サンプルを37°C、60rpmで6時間振とうします。
   4. 透明化したサンプルを直接観察するか、CUBIC-Rで満たされた黒いチューブに入れて室温で1週間保管します。

3. 画像取得

1. 共焦点イメージング
   注:共焦点顕微鏡(レンズ:Plan Apo λ 4×/0.2 N1対物レンズまたはPlan Apo VC 10×/0.45 DIC N1対物レンズ)でスライスした腎臓サンプルを画像化します。大きな画像(例:腎臓スライスの場合は6052 μm x 6052 μm)をzスタックでキャプチャします。
   1. 共焦点顕微鏡の電源を、レーザー出力、共焦点制御スイッチ、コンピューター、顕微鏡、および共焦点ハードウェアの順序でオンにします。セルフテストを実行した後、共焦点ソフトウェアをオンにします。
   2. 適切なレンズを選択します。CUBIC-R試薬からサンプルを取り出し、共焦点ディッシュに入れ、CUBIC-R試薬が乾燥しないように蓋をします。
   3. サンプルを視野の中央に移動し、焦点が合うまで焦点面を調整します。
   4. 3D再構成(ステップ3.1.4.1)と大きな画像の再構成(ステップ3.1.4.2-3.1.4.3)を適用します。
      1. 3D再構成(共焦点):蛍光が見えなくなるまでズーム面を一方向に切り替えます。この位置はトップとして定義されます。次に、蛍光が見えなくなるまでズーム面を反対方向に切り替えます。この位置は最下位として定義されます。ダイアログボックスの右下隅にある[ 実行 ]ボタンをクリックして、スキャンを開始します。
      2. 大画像再構成(共焦点):視野をサンプルの中央に移動し、現在位置を中心に設定します。2 x 2 の視野を選択します。
      3. ND多機能インターフェースで、 Zスタック を選択して大きな画像を再構成し、パネルにさまざまなオプションを設定します。次に、 を押します 実行 n スキャンを開始します。
2. ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)イメージング
   注:ライトシート蛍光顕微鏡(レンズ:EC Plan-Neofluar 5x / 0.16(Medium n = 1.529)対物レンズ)で腎臓全体を画像化します。
   1. サンプル取り付け(LSFM):
      1. 透明な腎臓をサンプル固定アダプターに接着し、腎臓がしっかりと取り付けられるまで待ちます。
      2. 腎臓をサンプルビンに浸し、サンプルビンを顕微鏡システムに押し込みます。ハッチを閉じます。
   2. 観察とスキャン(LSFM):
      1. Locateインターフェースで、サンプルを適切な観察位置に移動します。取得インターフェースに切り替えて、光路を設定し、488 nmレーザー、LBF 405/488/561/640、光分割フィルターブロックSBS LP 490を選択し、カメラ2を選択して、疑似色を緑に変更します。
      2. チャンネル(Channel)サブメニューで前に記録した左/右の Z オフセット(Left/Right Z Offset)の値を入力します。最小のズーム(0.36)を選択し、鮮明さを最大化するために微調整します。
   3. 臓器全体のX \ Y境界とZ範囲を見つけます。レーザー強度と露光時間(できれば10ミリ秒未満)を調整し、[ 実行 ]をクリックして開始します。
   4. 組織が大きすぎる場合は、画像のつなぎ合わせで2つ以上の画像を結合します。顕微鏡ソフトウェア(ここではZEISS ZEN 3.7)を使用して、キャプチャしたファイルを開きます。「 処理方法>>ステッチング>方法パラメーター」>「適用 」を選択して、画像のステッチを完了します。

4. データ処理と定量化

注:Imaris(画像解析)ソフトウェアで画像スタックを処理し、 Surface 機能を使用して糸球体にラベルを付け、解析を実行します。

1. 糸球体数
   1. 大きな画像(共焦点顕微鏡)またはステッチ画像(ライトシート顕微鏡)を画像解析ソフトウェアにインポートします。
   2. 画像解析ソフトウェアでファイルを開きます。[ サーフェス ]ボタンをクリックして、新しいサーフェスを作成します。画面左下のガイドに従ってください。
      1. 何もチェックせずに [次へ ]ボタン(右矢印ボタン)をクリックします。
      2. [スムーズ]オプションの前のボックスにチェックを入れ、適切な数値(14.5など)を入力して、サーフェスの詳細を制御します。[しきい値] で [バックグラウンド減算] を選択し、糸球体のおおよその平均直径をボックスに入力します。[次へ]ボタンをクリックします。
      3. 必要に応じて調整し、[ 次へ ]ボタンをクリックします。適切な範囲を選択し、[ 次へ ]ボタンをクリックしてサーフェスを作成します。
   3. フィルタ(Filter)をクリックし、次に追加(Add)ボタンをクリックして球形度(Sphericity)を追加し、非球形オブジェクトを除外します。[複製]ボタンをクリックして、この新しいサーフェスをコピーします。
   4. 「 統計 」ボタンをクリックし、「 全体 」ボタンをクリックします。糸球体の数が サーフェスの総数として表示されます。
2. 糸球体の体積
   1. 上記のように糸球体の表面を作成します。
   2. サーフェスが完成したら、[ 選択 ]ボタンをクリックしてターゲット オブジェクトを選択し、すべてのオブジェクトのボリュームを表示します。[ 保存 ] ボタンをクリックし、統計情報をスプレッドシートにエクスポートしてさらに分析します。
3. スライスまたは腎臓全体の体積
   1. 大きな画像(共焦点顕微鏡)またはステッチ画像(ライトシート顕微鏡)を画像解析ソフトウェアにインポートします。
   2. 画像解析ソフトウェアでファイルを開きます。[ サーフェス ]ボタンをクリックして、新しいサーフェスを作成します。画面左下のガイドに従ってください。
      1. [ 次へ ]ボタン(右矢印ボタン)をチェックせずにクリックします。
      2. [スムーズ]オプションの前のボックスにチェックを入れ、適切な数値(50など)を入力して、サーフェスの詳細を制御します。閾値処理で絶対強度(Absolute Intensity)を選択します。[次へ]ボタンをクリックします。
      3. 組織全体を覆うまでサーフェスを調整し、[ 次へ ]ボタンをクリックします。[ 次へ ]ボタンをクリックして、サーフェスを作成します。
   3. [ 選択 ]ボタンをクリックして、組織全体の[サーフェス]を選択し、組織の体積を表示します。[ 保存 ] ボタンをクリックして、統計情報をスプレッドシートにエクスポートします。

Results

この研究は、マウスの腎臓の糸球体を標識および分析するための簡単で効率的な方法を提供します。

糸球体(血管)は、血管内注射のFITC-デキストランによって十分に標識できます。透明化プロセス後、腎臓は透明になり(図1A)、糸球体はライトシート顕微鏡(図1B)または共焦点顕微鏡(図1C)を使用してはっきりと観察することができました。共焦点顕微鏡はスキャン深度が限られているため、腎臓を約1mmの厚さに切断する必要があります。ライトシート顕微鏡を使えば、腎臓全体を直接スキャンすることができます。

明確な信号で、糸球体の数を数えるのは簡単でした。実際、ラベリングは非常に効果的で、糸球体を肉眼で数えることができました。糸球体の体積を直接測定することもできます。もちろん、Imarisなどのソフトウェアは、このプロセスを大幅に加速しました。 表面 関数を使用すると、腎臓切片(図2)、腎臓全体(図3)、またはストリップ(図4)のすべての糸球体を選択し、糸球体の数と体積を直接取得できます(図2C、 図3C、 図4C)。選択した領域の体積も測定できるため(図2B、 図3B、 図4B)、特定の領域または腎臓全体の糸球体体積比と頻度を計算できます(図2D、 図3D、 図4D)。腎臓の領域を選択して、特定の領域で計算を実行できます。生検に似たストリップを提示しました。ストリップ内の糸球体の数、体積、頻度も簡単に取得できました(図4)。

図に示すように、この研究で示された結果は、(N = 数、F = 頻度、V = 体積、V(a) = 平均体積、V(t) = 総体積) です。

_{切片中のN糸球体}=1128、_{全腎臓中のN糸球体}= 14006、_{スライス中のF糸球}体= 65/^mm3、_{全腎臓中のF糸球}体= 105/^mm3、_{スライス中のV総糸球}体/ V_スライス= 2.24%、 全腎臓_{/ V腎臓}中のV_総糸球体= 5.54%、 スライス中のV(a)_糸球体= 373654 μm3、 全腎臓中のV(a)_糸球体= 521627^μm3、 _切片中のV(t)糸球体= 421481724 μm³、腎臓全体のV(t)_糸球体= 7305386256 μm³(図2D、図3D)。

_{ストリップ中のN糸球体}=63、_{ストリップ中のF糸球体}=72/^mm3、_{ストリップ中のV総糸球体/Vストリップ}=2.23%、ストリップ中のV(a)_糸球体=307698 μm3、ストリップ中のV(t)_糸球体=19384977 ^μm3(図4D)。

図1:腎臓組織の透明性とFITCデキストラン標識糸球体。 (A)透明化治療前後の腎臓。(B)LSFMでスキャンされた腎臓全体の画像。(C)共焦点顕微鏡でスキャンした腎臓の切片の画像(左:4倍、右:10倍)。スケールバー = 300 μm (4x, 共焦点);スケールバー = 100 μm (10x, 共焦点);;スケールバー = 700 μm(5倍、ズーム0.36、LSFM)。糸球体はFITCデキストランで標識されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:共焦点スキャンされた腎臓スライスに適用される関数Surface。 (A)スライスの表面とすべての糸球体が作成されます。ピンク=糸球体、青=腎臓スライスの表面、緑=血管の元のラベル(糸球体といくつかの大きな血管)。スケールバー = 300 μm。 (B)スライスの表面(左)または糸球体(右)を選択すると(選択したオブジェクトが黄色に変わります)、データを直接取得できます(点線のボックスは、データを示す場所を強調します)。(C)スライスの体積だけでなく、すべての糸球体の数、体積、および総糸球体の体積を直接取得できます。(D)エクスポートされたデータをさらに分析して、糸球体の平均体積、糸球体と選択した面積の体積比などの計算を行うことができます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:LSFMスキャンされた全腎臓に適用された関数Surface。 (A)腎臓全体とすべての糸球体の表面が作成されます。ピンク=糸球体、青=腎臓全体の表面、緑=血管(糸球体といくつかの大きな血管)の元のラベル。スケールバー = 1000 μm。 (B)腎臓の表面(左)または糸球体(右)を選択すると(選択したオブジェクトが黄色に変わります)、データを直接取得できます(点線のボックスはデータを表示している場所を強調します)。(C)腎臓の体積だけでなく、すべての糸球体の数、および糸球体の数を直接取得できます。(D)エクスポートされたデータをさらに分析して、糸球体の平均体積、糸球体と腎臓全体の体積比などの計算を行うことができます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:選択したキドニーストリップに適用された関数Surface。 (A)ストリップの表面とすべての糸球体が作成されます。ピンク=糸球体、青=腎臓ストリップの表面、緑=血管(糸球体といくつかの大きな血管)の元のラベル。スケールバー=150μm。 (B)ストリップの表面(左)または糸球体(右)を選択すると(選択したオブジェクトが黄色に変わります)、データを直接取得できます(点線のボックスはデータを表示する場所を強調表示します)。(C)すべての糸球体の数、体積、および総糸球体の体積、およびストリップの体積を直接取得できます。(D)エクスポートされたデータをさらに分析して、糸球体の平均体積、糸球体と選択した面積の体積比などの計算を行うことができます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Discussion

組織透明化技術は、3つまたは4つのグループ^29、30、31に分類できます。有機溶媒ベースの組織透明化(DISCOやPEGASOSなど)、水性組織透明化(CUBICなど)、ハイドロゲル包埋組織透明化(CLARITYなど)はすべて、腎臓の透明化に適用されています^25,26,28,32。CUBICは、これまで実証したように、糸球体(血管)がFITC-デキストランで標識されている場合に最も効果を発揮します。加えて、CUBICは、比較的簡便な操作プロセスを有し、処理された試料を有機試薬³³に浸す必要がないため、通常の顕微鏡レンズ²⁷以上のものを必要としない。ただし、さまざまなクリアリング方法と容器ラベル方法には、独自の長所と短所があります。研究者は、特定のニーズを満たすためにさまざまなアプローチを試す必要があるかもしれません。

以前の研究では、腎臓の血管が13,25,26,28とラベル付けされている場合、透明な腎臓で糸球体がラベル付けされる可能性があることに気づきました。この現象の徹底的な説明はまださらに調査する必要がありますが、血管系の優れた標識法も糸球体を効果的に標識すると推測できます。実験結果に基づき、中分子量(150 kDaなど)のFITC-デキストランの血管内注射を推奨します。ただし、標識は血液循環に依存するため、この方法では糸球体が循環を欠いている場合、糸球体に標識できない可能性があります。

LSFMは大規模な組織観察が可能で、全腎糸球体検出に適しています。ただし、ライトシート顕微鏡はすべての研究室で利用できるわけではありません。そこで、通常の共焦点顕微鏡を用いた代替プロトコルを提供しています。腎臓を複数のセクションにスライスする必要がありますが、腎臓全体の糸球体の数や体積などのデータを取得することは可能です。さらに、共焦点顕微鏡はデータ量が少ないため、データ処理が容易です。

Imarisは直接データ出力を提供します。ただし、アナログ信号をオリジナルに近づけるように注意する必要があります。さらに、ソフトウェアは大きなファイルの処理に時間がかかる場合があり、イライラする可能性があります。糸球体を明確にラベル付けし、視覚化できる限り、データ分析のための独自のソリューションが複数存在します。さまざまな研究室の研究者が、使い慣れた独自のソフトウェアとプログラミング言語を使用して作業することができました。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	バイオシャープ	7007171800	固定 reaagen
502 接着剤	Deli	7146	腎臓をサンプル固定アダプターに固定するため
アンチピリン	アラジン	A110660	クリア試薬
ブレインマトリックス	RWD ライフサイエンス	1mm 40-75	組織スライス
共焦点顕微鏡	ニコン	A1plus	画像取得
FITC-デキストラン	Sigma-Aldrich	FD150S	ラベリング試薬
ライトシート蛍光顕微鏡	ツァイス	ライトシート7	画像取得
マウス	Ensiweier		成体 C57BL/6 マウス (生後 6 週齢、25 インチ;30 g)
N-ブチルジエタノールアミン	アラジン	B299095	クリアリング試薬
ニコチンアミド	アラジンN105042		クリアリング試薬
ペントバルビタール ナトリウムサルツ	シグマ・アルドリッチ	P3761
尾静脈固定器	ジヌオタイ	JNT-FS35	ベイル注射用マウスの固定
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	T8787	クリアリング試薬