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方法論記事

超短自己組織化ペプチドマトリックス中のSW1222細胞株由来結腸直腸癌オルガノイドの作製とキャラクタリゼーション

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DOI:

10.3791/66060

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2024年5月3日

 ,  , 
1Laboratory for Nanomedicine, Biological & Environmental Science & Engineering, King Abdullah University of Science and Technology, 2Computational Bioscience Research Center, King Abdullah University of Science and Technology, 3Red Sea Research Center, King Abdullah University of Science and Technology

この記事について

サマリー

このプロトコールは、免疫染色による細胞接着、オルガノイド形態、および遺伝子発現のための生体機能的自己組織化ペプチドを評価することを目的としています。結腸直腸癌細胞株を使用して、集中的なテストのためのオルガノイドを取得する費用対効果の高い方法を提供します。

要約

超短自己組織化ペプチド(SAP)は、細胞外マトリックスに似たナノファイバーを自発的に形成することができます。これらの繊維は、生体適合性、生分解性、および非免疫原性のハイドロゲルの形成を可能にします。私たちは以前に、SAPがタンパク質由来のモチーフで生物官能基化されると、結腸直腸オルガノイド形成をサポートする細胞外マトリックス特性を模倣できることを証明しました。これらの生体機能ペプチドハイドロゲルは、元の親ペプチドの機械的特性、調整性、および印刷適性を保持しながら、細胞とマトリックスの相互作用を可能にして細胞接着を増加させる手がかりを組み込んでいます。この論文では、結腸直腸がんオルガノイドを費用対効果の高い方法で形成できる腺がんがん細胞株を使用して、細胞接着と内腔形成に対するさまざまな生体機能ペプチドハイドロゲルの効果を評価および特徴付けるために必要なプロトコルを示します。これらのプロトコルは、免疫染色および蛍光画像解析を使用して、細胞接着および管腔形成に対する生体機能ペプチドハイドロゲルの影響を評価するのに役立ちます。この研究で使用した細胞株は、以前に動物由来のマトリックス中のオルガノイドの生成に利用されています。

概要

近年、自己組織化ペプチド(SAP)は、組織工学用途の有望な生体材料として浮上しています。SAPは、ナノファイバーの自然形成、生体適合性、生分解性、非免疫原性などのユニークな特性を有しており、足場開発の有力な候補となっています1。SAPはこれまで様々な種類の細胞と併用されてきましたが、特に報告されている超短SAPは、幹細胞のカプセル化を促進しながら、30種類以上の継代を網羅し、染色体異常の発生を最小限に抑えながら、幹細胞の多能性を維持しています2,3,4。したがって、オルガノイド培養での使用にSAPを適応させることは、合理的な次のステップを構成しました。

オルガノイドは、単一の多能性細胞から生じる複雑な三次元構造です。これらの構造は、さまざまな細胞タイプを生じさせ、その後、自己組織化して、in vitroでの胚成長および組織成長の発生過程を再現します5。この革新的なフレームワークは、in vivo 臓器に特徴的な遺伝的、表現型、および行動的特性を効率的に保存しながら、in vitro 研究のための強力なツールに進化しました6。それにもかかわらず、オルガノイドベースの所見のベンチからベッドサイドへの移行における主な障害は、再現性の必要性です7。この結果のばらつきは、主にヒト多能性幹細胞を特殊な細胞系譜に完全分化させることの難しさに起因しており、さらに、真正な組織構造の欠如とオルガノイドモデルに見られる固有の複雑さが加わります。幹細胞およびオルガノイドベースの研究8の人気が高まっていることから、動的な機械的特性を持つ生体材料や、分解性が制御されたインテグリン様の接着部位や足場に対する需要が高まっています7,9。これらの特性は、生物官能基化されたSAPを戦略的に活用することで効果的に調整することができます。

SAPは、明確に定義された構造に自発的に組織化する固有の能力を持つアミノ酸の短い配列です10。これらのペプチドは、多くの場合、疎水性残基と親水性残基を交互に含み、水素結合、静電相互作用、および疎水性効果11,12などの非共有結合相互作用を通じて自己組織化を促進します。これらのペプチドの自己組織化プロセスは、主にシステムの自由エネルギーを最小限に抑える必要性によって推進されます。水性環境では、疎水性の残留物は水への曝露を最小限に抑えるために集まる傾向がありますが、親水性の残留物は周囲の水分子と相互作用します。この現象は、さまざまなナノ構造の形成につながります。この場合、超短自己組織化ペプチドは、ペプチド配列および環境条件2,12,13,14,15,16に依存する特性を有するナノファイバーを形成する。これらのペプチドは、個々のペプチド鎖が互いに平行または逆平行に整列し、水素結合によって安定化されるβターンコンフォメーションを採用しています(図1)。陽イオンの存在は、ナノファイバー形成につながる自己組織化プロセスを加速します。

ペプチドナノファイバーは、大量の水を捕捉する生来の能力を有することが確認されています。この特性により、ヒドロゲルの生成が促進され、その後、細胞の増殖と成長を助長する生体適合性および生分解性の三次元空間として現れます。これらの自己組織化ペプチドナノファイバーは、天然の細胞外マトリックス(ECM)環境1に固有の地形的特徴を複雑に模倣します。この類似性は、細胞にその生理学的生息地を模倣する環境を与え、最適な細胞活動をさらに促進する17。さらに、これらのペプチドに固有の汎用性は、かなりの程度の同調性を可能にする4。このような適応性により、剛性、ゲル化速度、多孔性などのマトリックスの特性を変更することができます。これらの適応は、ペプチド配列の修飾によって達成されます。その結果、自己組織化ペプチド(SAP)は、現代の生体材料科学において極めて重要な構成要素として浮上し、組織再生および細胞培養の足場として広く使用されている13,17。

自己組織化ペプチドの重要な利点の1つは、分子レベルで容易に合成および修飾できることです。この利点により、特定の官能基または生理活性モチーフをペプチド配列に組み込むことができ、調整された特性および機能性を有するペプチドの設計が可能になります18,19,20(図1B)。例えば、生体官能性化されたSAPは、ECMを模倣し、RGDペプチド19,21を用いて分化を促進するように設計することができる。ペプチドBen-IKVAVは、そのリガンド特異的な動機により、ニューロン特異的マーカーの発現を有意に増加させることも報告されています22。これらのペプチドは、インテグリン結合ペプチドなどの生理活性分子を表示するように操作することもでき、細胞の生存を増強する23。最後に、他の生物官能化されたSAPは、それらの構造にIKVAVおよびYIGSRモチーフを含めることにより、血管新生を促進するために開発されている24。

以前の出版物で報告された生物官能性化されたSAPは、生物官能化されたSAPが由来するナイーブペプチドを含めることによって、自己組織化をさらに修飾できることを示している25。これらのSAP混合物は、生化学的活性と物理化学的特性が異なるさまざまなSAP製剤も提供できます。例えば、両親媒性ペプチドIIFKは、IKVAVモチーフの組み込みに代表されるように、さまざまなモチーフによる生体機能化に耐えることができる超短SAPです(図1B)。両方のペプチドは、単独でも組み合わせてもナノファイバーを形成することができます。各配合は、さまざまな物理的特性を持つハイドロゲルをもたらします(図2)

しかし、SAPの生物学的機能化から得られる可能性のある順列や代替法は多岐にわたるため、オルガノイド試験のための迅速で費用対効果の高いオプションを提供する必要があります。このような集中的で費用対効果の高いオルガノイド評価の候補の1つは、ヒト結腸直腸腺癌に由来するSW1222細胞株です26,27。SW1222細胞は、オルガノイドに似た3次元構造に凝集できる特性を有しており、組織発生や再生医療への応用研究に理想的なモデルです。SW1222細胞は、LGR5遺伝子27の固有の過剰発現により、オルガノイドを生成できると同定されている。個々のLGR5+幹細胞からのオルガノイドの作製は、SW1222細胞が結腸直腸癌オルガノイドの形態学的特性を達成する傾向と同様に、以前に説得力を持って示されてきた28。

この手法論文では、SW1222細胞を使用して、さまざまな生体機能ペプチドが細胞接着と内腔形成に及ぼす影響を評価および特性評価するための詳細なプロトコルを紹介します(図3)。段階的な手順とイメージング解析方法を提供することで、オルガノイドのバイオファブリケーションとオルガノイド培養のための単純なSAPマトリックスの評価に関する貴重な洞察を提供したいと考えています。

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プロトコル

1. バッファーと溶液の調製

注:記載されているすべての濃度は最終濃度です。

  1. ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン-ストレプトマイシンをそれぞれ10%と1%の最終濃度で添加し、完全なイスコーブ改変ダルベッコ培地(IMDM)を調製します。4°Cの暗所で最大1か月間保管してください。
  2. リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)にMgCl2 (3 mM)、スクロース(300 mM)、Triton X-100(0.5%)を混合して、透過化緩衝液を調製します。この溶液は4°Cで最大2か月間保存します。
  3. ウシ血清アルブミン(BSA、1%)、グリシン(0.3 M)、およびTween-20(0.1%)をPBS中に組み合わせて、ブロッキングバッファーを調製します。この溶液は4°Cで最大2か月間保存します。
  4. 滅菌条件下で超純水でPBSを10倍から2倍に希釈します。この溶液は室温で6か月以上保存してください。
  5. 3mgのペプチド粉末を紫外線下で30分間滅菌します。500μLの超純水を加え、ボルテックスミキサーで溶解します。
    注:最終濃度は目標濃度の2倍、つまり6 mg / mLである必要があります。1x濃度は3 mg / mLになります。

2. ペプチド中のSW1222からの大腸がんオルガノイドの作製

  1. アリコートを4°Cで一晩解凍し、地下マトリックスコントロールの準備に必要なまで氷に保管します。
  2. 2xペプチド溶液の10 μL液滴を24ウェルプレートの各ウェルの中央に置きます。プレートを室温で10分間インキュベートします。あるいは、ウェルあたり8〜10個の液滴を6ウェルプレートに堆積させます。
    注:共焦点顕微鏡および電子顕微鏡で使用することを目的としたサンプルは、滅菌カバーガラスの上に播種すると、操作しやすくなります。
  3. 2x PBSを10μL加えます。先端を使用してPBS溶液を穏やかに混合します。ゲルを少なくとも20分間安定させ、液滴がほぼ無傷のままであることを確認します。
    注:PBSの添加と穏やかな混合の目標は、液滴の完全性を維持し、ヒドロゲルが層に広がるのを防ぐことです。
  4. 0.125%トリプシン-EDTA溶液(5mL)を使用してSW1222細胞を剥離します。細胞をトリプシンと37°Cで5〜10分間インキュベートし、フラスコから剥がれるまで培養します。細胞の凝集を避けるために、フラスコを叩くのを控えてください。
  5. 5 mLの完全培地を加えて、トリプシンを不活性化します。30 μmの細胞ストレーナーを使用して細胞懸濁液をろ過します。あるいは、25Gの針が付いたシリンジを使用して、凝集体を破壊します。
  6. 0.4 × 106 cells/mLの細胞懸濁液を調製し、10 μLのマイクロピペットを使用して各ペプチド液滴に2 μLの細胞懸濁液を注入します。
  7. 液滴を37°C、5%CO 2で30分間インキュベートします。 インキュベーション後、0.5 mLの補充培地を各ウェルに加えます。
  8. 待っている間に、補充した培地を使用してメインストック(ロットに応じて8〜12 mg / mL)を最終濃度3 mg / mLに希釈することにより、基底膜マトリックスコントロールを調製します。この溶液に細胞を添加します(25μLあたり800細胞)。
    注:基底膜の操作は、常に氷上で行う必要があります。ハイドロゲルに触れる前に、先端を氷冷したPBSですすぐ必要があります。そうしないと、チップ内で重合が発生します。
  9. 各ウェルに基底膜溶液の液滴20μLをプレートします。液滴をゲル化させるには、37°Cで20分間インキュベートします。 材料をゲル化した後、0.5 mLの完全培地を加えます。
  10. 3〜4日ごとに媒体を交換してください。細胞が組織化し、内腔形成のシグナルを示しているのを4日目という早い時期に観察します。
  11. 1日目、4日目、7日目に明視野で細胞を画像化し、オルガノイドの増殖を評価します。

3. 生存率と増殖

  1. 生存率アッセイ用に3枚のブラックウェルプレートを、増殖アッセイ用に3枚のブラックウェルプレートを調製します。ウェルあたり25 μLの2xペプチド溶液を添加し、同量の2x PBSを使用してゲル化します。上記のようにセルをシードします。
  2. ペプチドハイドロゲルの各製剤について、増殖プレートのブランクとして使用するウェルを3つ調製します。これらに細胞を播種しないでください。
  3. 培地を生存率ウェルプレートから取り出し、1x PBSで3 x 5分間洗浄します。
  4. 哺乳類細胞の生存率/細胞毒性キット( 材料の表を参照)から、カルセイン-AMとエチジウムホモダイマーを8 μMに希釈し、同じ光保護コニカルチューブに入れます。光保護コニカルチューブでこの溶液2 mLを2 mLのPBSに調製するには、4 μLのCalcein-AMストック溶液と8 μLのEthidium homodimer-1ストック溶液を加えます。
  5. ステップ3.4で調製したカルセイン/エチジウムホモダイマー溶液を96ウェルプレートに加えます。ウェルあたり100μLを添加します。光から保護し、室温で30分間インキュベートします。
  6. 1x PBSで3 x 5分間洗浄します。4倍対物レンズを使用する場合は最低3つのフィールド(中央、上、下)、蛍光顕微鏡で10倍および20倍の対物レンズを使用する場合は最低5つのフィールド(中央、左上、右上、左下、右下)を画像化します。
  7. 増殖ウェルプレートから培地を取り出して、最終容量が90 μLになるようにします。
  8. 10 μLのAlamar Blue溶液( 材料表を参照)を加えて、最終濃度10%にします。
  9. 光から保護し、37°C、5%CO2で2〜4時間インキュベートします
  10. ウェルプレートリーダーを使用して、蛍光(Ex/Em = 530-560/590 nm/nm)または吸光度(570 nm)を測定します。ブランクについて得られた値を平均化し、セルを含む各ウェルの値からそれらを減算します。
  11. 各条件の信号を平均し、それぞれのブランクの平均を差し引くことにより、増殖値を計算します。相対吸光度/蛍光シグナルの時間に対するインデックス付き箱ひげ図を生成することにより、グラフを作成します。

4. マトリックスへの細胞の接着アッセイ

  1. 100 μL のペプチドハイドロゲルを 2 つの独立した 96 ウェルプレートに調製します。
  2. 各ウェルに20,000個の細胞を播種し、100 μLの培地を加えます。プレートを37°C、5%CO2で90分間インキュベートします。
  3. インキュベーション後、1つのプレートのみを取り、P200マイクロピペットを使用して培地を20〜30秒間慎重に再懸濁します。先端をゲルから離してハイドロゲルを乱さないように注意してください。あるいは、ハイドロゲルの機械的特性が許す場合(G' > 8,000 Pa)、移動する渦を使用してウェルプレートの4つの側面を軽くたたきます。
    注:培地を再懸濁する(またはウェルプレートをボルテックスで叩く)と、未付着の細胞とマトリックスの表面への接着が希薄な細胞の両方が除去されます。細胞の接着は90分以内に起こりますが、この付着の強度は特定のペプチドハイドロゲルとその接着および結合特性によって異なります。結腸直腸オルガノイドの成長は、剛性値が2,000 Pa未満のマトリックスで好まれることが知られています。したがって、このプロトコルで提示されるハイドロゲルは柔らかくもろいため、穏やかな機械的ストレスを使用することを重要視しています。
  4. 両方のウェルプレートから100 μLの培地を取り出し、1x PBSで1回洗浄します。
  5. 1 μg/mL DAPI溶液を調製します。100 μLのDAPI溶液をすべてのウェルに加え、室温で5分間インキュベートします。
  6. 蛍光顕微鏡で代表的な数のフィールドを画像化します。すべての画像が同じ目的を使用して取得され、ピクセル/距離比が一定になるようにします。
    注:10倍対物レンズの場合は9つのフィールド、または20倍対物レンズの場合は15フィールドの画像をイメージします。
  7. 蛍光画像を画像解析ソフトウェア(ImageJなど)に読み込み、すべての画像上の粒子を解析します。
    1. [Image] メニューから [Type] を選択し、[8-bit] をクリックします。
    2. [画像]メニューから[調整]を選択し、[明るさ/コントラスト]をクリックします。[自動]ボタン |適用します。
    3. [画像] メニューから [調整] を選択し、[しきい値] をクリックします。[自動]ボタンをクリックして、ウィンドウを閉じます。
    4. [分析]メニューから、[粒子の分析]をクリックします。要約するオプションにチェックを入れ、[OK]をクリックします。
    5. [概要] ウィンドウで、[ファイル] メニューにカーソルを合わせ、[保存] をクリックして概要値を保存します。
  8. すべての画像の結果を標準の統計ソフトウェアにエクスポートします。
  9. ストレスの前後でセルがカバーする面積の割合を計算します。各条件に対する面積の割合のインデックス付き箱ひげ図を作成します。

5. ペプチドハイドロゲル中のオルガノイドの免疫染色

  1. ステップ2.1-2.10で説明したように、ペプチドハイドロゲルの液滴20 μLに800個の細胞を4日間播種します。
  2. 4日目に培地を取り出し、1x PBSを使用して各ウェルを2回洗浄します。
  3. 400μLの4%ホルムアルデヒド溶液を加えます。ウェルプレートを室温で30分間インキュベートします。
  4. ホルムアルデヒド溶液をP1000で取り出し、1x PBSで一度洗浄します。
  5. 1 mLの透過化バッファーを加え、室温で5分間インキュベートします。
  6. P1000で透過化バッファーを取り出し、1x PBSで1回洗浄します。
  7. ブロッキングバッファー0.5 mLを添加し、室温で30分間インキュベートします。
  8. P1000でブロッキングバッファーを取り外し、1x PBSで洗浄します。
  9. 一次抗体をブロッキングバッファーで希釈します( 材料表を参照)。200μLを2つのウェルに加えます。
  10. 4°Cで一晩インキュベートします。
  11. P200で染色液を取り出し、1x PBSで一度洗浄します。
  12. 二次抗体をブロッキングバッファーで希釈します。これは、製造元の指示に従ってください( 材料表を参照)。二次抗体溶液中にファロイジンコンジュゲートを1:40の比率で添加します。
  13. 光から保護し、室温で3時間以内でインキュベートします。P200で染色液を取り出し、1x PBSで一度洗浄します。
  14. ブロッキングバッファーに1 μg/mLのDAPI溶液を調製します。各ウェルに300μLのDAPI溶液を加えます。
  15. 光から保護し、室温で5分間インキュベートします。
  16. P200で染色液を取り出し、1x PBSで一度洗浄します。
  17. 光から保護し、4°Cで最大7日間保管してください。

6. マトリックス中のオルガノイドのイメージングと画像解析

  1. 落射蛍光顕微鏡を使用して、染色したサンプルを10倍で画像化します。ファロイディンチャネルとDAPIチャネルのみを使用してください。
  2. Celloposeソフトウェアを開き、 ctrl + L を押して画像をロードします。ソフトウェアは選択した画像の場所にあるすべてのファイルにアクセスできるため、サブフォルダを持たずにすべての蛍光画像を正確な場所に保存してください。
  3. Segmentationパネルにコロニーの平均直径を入力し、ENTERをクリックします。
  4. 結腸オルガノイドのカスタムモデルを選択し、 Run Model ボタンをクリックします。
    注:ここでは、Cellpose2.029,30で2つのゼロからモデルを使用することをお勧めします
  5. ctrl + s を押して、マスクを .npy ファイルとして保存します。
  6. キーボードの矢印キーを使用してフォルダーの画像間を移動し、フォルダー内のすべての画像で結腸オルガノイドのモデルを実行します。
  7. フォルダのコピーを作成し、結腸オルガノイド内腔のモデルを使用して手順6.2〜6.6を繰り返します。
  8. ImageJを開き、 プラグイン|マクロ |走る。。。 をクリックして、Cellpose Githubサイトから入手できるimagej_roi_converter.pyファイルを実行し、ウィンドウが表示されるのを待ちます。
  9. colon organoidフォルダから 最初のファイル を選択し、[ Open]をクリックします。
  10. 最初のファイルに対応する seg.npy ファイルを選択し、[ 開く] をクリックします。
    注:ImageJは、マスクを関心領域に変換し、対応する蛍光画像と重ね合わせます。
  11. ROI マネージャー ウィンドウで [すべて選択] をクリックし、[測定] をクリックします。
  12. [ファイル] |名前を付けて保存... をクリックし、結果を保存します。
    注:これにより、フィールド内の各コロニーのすべての形状プロパティを含む.csvファイルが作成されます。
  13. コロンオルガノイドルーメンのフォルダ内の同じ画像に対して、手順6.8〜6.12を繰り返します。
  14. OriginProをロードし、 ctrl + 3 を押して インポートウィザードを開きます。3つの ドットボタンをクリックし 、同じ画像のオルガノイドとルーメンの形状プロパティに対応する両方の.csvファイルを選択します。
  15. ルーメン形状プロパティの結果をコピーして、コロニーの結果の横にある 1 つの列に貼り付け、各ルーメン測定値がそれぞれのコロニーとペアになっていることを確認します。
  16. 新しい列で、ルーメンとコロニーの領域を分割して、それを含むコロニーの相対的なルーメン面積を求めます。
  17. 各コロニーの真円度とルーメン面積に対応するカラムを選択します。プロットをクリック |ベーシック 2D |スキャッター。
  18. プロットウィンドウを右クリックし、[ プロットの詳細]を選択します。 [重心(PRO)]タブ をクリックし、[ サブセットの重心ポイントを表示]、[データポイントに接続]、および [楕円を表示]というオプションにチェックマークを付けます。

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結果

まず、24ウェルプレートで増殖した細胞を明視野イメージングを用いて7日間評価しました。 図4に示すように、週の間にオルガノイドに集合する細胞の小さなクラスターを特定しました。制御されたスキャン法は、異なる日間の細胞とオルガノイドの移動性を追跡することができます。一般的に、私たちは全週にわたって細胞の形態の進化を調べました。SW1222由来のオルガノイドは、丸い形態と明るい外観を持つ必要があります。外観が暗いほど、望ましくない細胞密度が高いことを示しており、これはペプチドP、7日目に培養したコロニーの一部に見られる(図4)。

図5 は、細胞生存率(図5A)および増殖アッセイ(図5B)の結果を示しており、これらはそれぞれ死細胞および生細胞の量および代謝活性を指し示しています。ここでは、カルセ...

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ディスカッション

生物医学研究におけるSAPの大きな可能性は、バイオファンクチャリゼーションによる順応性と適応性によって強調されています。このように広範な順列が存在するため、特にオルガノイド研究において、特定のアプリケーションで最も有望な構成を効率的に試験し、決定するという課題が生じます。迅速で費用対効果の高いソリューションが最も重要です。SW1222細胞株は、ヒト結腸直腸腺がんに由来し、このような集中的な評価の極めて重要な候補として浮上しています。ここでは、ペプチドベースのマトリックスで成長したオルガノイドの評価と特性評価の方法を紹介しました。このプロトコールは、生存率と増殖の評価、接着アッセイ、形状解析、免疫細胞化学を用いたオルガノイドのモニタリングと解析に焦点を当てた、統合的で費用対効果の高い戦略を約束します。当社の細胞培養実験におけるさまざまなペプチド濃度の選択は、特定の実験目的に沿った慎重に検討された理論的根拠によって支えられており、ペプチドマトリックスの文脈におけるオルガノイド培養の理解を深めることに大きく貢献しています。私たちの研究の旅は時間とともに進化し、さまざまな処方を探求するための多様なアプローチが必要とされています。まず、1.5 m...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、キングアブドラ科学技術大学によって財政的に支援されました。著者らは、KAUSTのSeed Fund Grantと、KAUSTのInnovation and Economic Developmentが授与したイノベーションファンドを認めています。著者らは、KAUSTのBioscience and Imaging Core Labsが生物学的特性評価と顕微鏡分析をサポートしてくれたことに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1x PBSGibco 14190144
6 ウェルプレート、組織培養処理済みCorning07-200-83
10x PBS、カルシウム不使用、マグネシウム不使用Gibco70011044
16% ホルムアルデヒド (w/v)、メタノールフリーThermo Scientific28906
24 ウェルプレート、組織培養処理済みCorning09-761-146
96ウェルブラックプレート、組織培養処理コーニング07-200-565
alamarBlue 細胞生存率試薬InvitrogenDAL1025
抗エズリン抗体、ウサギモノクローナルAbcamab40839二次使用:抗ウサギ Dylight 633
抗パンカドヘリン抗体、ウサギポリクローナルAbcamab16505二次使用:抗ウサギ Alexa 488
抗ZO1タイトジャンクション抗体、ヤギポリクローナルAbcamab190085二次使用:抗ヤギ Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANA
AiryscanZEISSLSM 880
DAPIインビトゲンD1306
ロバ抗ヤギIgG (H+L) 二次抗体, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlycineCytivaGE17-1323-01
ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 二次抗体, Alexa Fluor, 488InvitrogenA-11008
ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 二次抗体, DyLight 633Invitrogen35562
熱不活化ウシ胎児血清 (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cellsInvitrogenL3224
塩化マグネシウム、六水和物 (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
オルガノイド培養用マトリゲル、フェノールレッドフリーのコーニング356255原稿ではマトリゲルまたは基底膜マトリックスとされています。
顕微鏡、明視野
顕微鏡、EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Gibco15140122
ペプチド P (Ac,Ile,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)ラボメイドNAペプチドによるカスタムメイドが可能Bachemなどのメーカー。
ペプチドP1(Ac、Ile、Ile、Phe、Lys、Gly、Gly、Gly、Arg、Gly、Asp、Ser、NH2)のラボメイドNAをBachemなどのペプチドメーカーにオーダーメイドできる。
ペプチドP2(Ac、Ile、Ile、Phe、Lys、Gly、Gly、Gly、Ile、Lys、Val、Ala、Val、NH2)ラボメイドNAケムなどのペプチドメーカーでオーダーメイドできます。
ローダミンファロイジンInvitrogenR415
丸型カバースリップ、直径 10 mmVWR631-0170
走査型電子顕微鏡サーモフィッシャー - FEITENEO VS
Sterile 30 μメートルストレーナシスメックス04-004-2326
ショ糖Sigma-AldrichS1888
SW1222 ECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
トリプシン-EDTA 0.25%Gibco25200056
Tween 20Sigma-AldrichP1379
UltraPure 水インビトジェン10977015
https://github.com/MouseLand/cellpose 共焦点レーザー走査顕微鏡から取得, , , , , バ

参考文献

  1. Susapto, H. H., et al. Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs. Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).
  2. Loo, Y., et al. A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells. ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).
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