マウスからの血管壁常在型CD34+ 幹細胞の免疫磁気的単離

Summary

この研究は、血管壁に常在するCD34⁺ 幹細胞(CD34⁺ VW-SC)の単離、培養、および機能決定のための安定した効率的な方法を確立しました。このわかりやすく、時間効率の良い分離法は、他の研究者が心血管疾患に関与する潜在的なメカニズムを研究するために利用できます。

Abstract

常在型CD34⁺ 血管壁常在幹細胞および前駆細胞(VW-SC)は、血管の損傷と修復の調節における重要な役割についてますます認識されています。機能性マウスCD34⁺ VW-SCを安定的かつ効率的に培養する方法を確立することは、さまざまな生理学的および病理学的条件下でこれらの細胞の増殖、遊走、および分化に関与するメカニズムをさらに研究するために不可欠です。記載された方法は、磁気ビーズスクリーニングとフローサイトメトリーを組み合わせて、初代培養常在CD34⁺ VW-SCを精製します。その後、精製された細胞は、免疫蛍光染色とCa²⁺ イメージングによって機能的に同定されます。簡単に説明すると、マウス大動脈および腸間膜動脈の外膜からの血管細胞は、組織ブロックの付着を通じて得られ、続いて細胞数が少なくとも1×10⁷に達するまで継代培養される。続いて、CD34⁺ VW-SCを磁気ビーズソーティングおよびフローサイトメトリーを用いて精製します。CD34⁺ VW-SCの同定には細胞免疫蛍光染色が含まれますが、機能的多能性は、細胞を特定の培地に曝露して配向分化させることによって決定されます。さらに、機能的な内部Ca²⁺ 放出および外部Ca²⁺ エントリーは、ATP、カフェイン、またはタプシガルギン(TG)に曝露されたFura-2/AM負荷細胞において、市販のイメージングワークステーションを使用して評価されます。この方法は、血管壁に常在するCD34⁺ 幹細胞の単離、培養、および同定のための安定した効率的な技術を提供し、VW-SCの調節メカニズムに関する in vitro 研究と標的薬物のスクリーニングの機会を提供します。

Introduction

血管壁は、血管の発達、恒常性調節、および血管疾患の進行において極めて重要な役割を果たします。近年、多くの研究により、動脈にさまざまな幹細胞系統が存在することが明らかになっています。2004年、Qingbo Xu教授のグループは、成体血管壁の周辺にCD34、Sca-1、c-kit、およびFlk-1¹を発現する血管幹細胞/前駆細胞の存在を初めて報告しました。これらの血管幹細胞は、多方向の分化および増殖能を示します。通常の条件下では、彼らは比較的静止したままです。しかし、特定の因子によって活性化されると、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞に分化することができます。あるいは、パラクリン効果を通じて血管周囲マトリックスと微小血管形成を調節し、損傷した血管の修復またはリモデリングを促進する^{こともできます}2,3,4,5,6。最近、血管壁に常在するCD34⁺幹細胞が、大腿動脈ガイドワイヤー損傷後の内皮細胞の再生に関与することが明らかになった²。したがって、CD34⁺ VW-SCの単離と定量、およびCD34⁺幹細胞の基本的な生物学的特性の検討は、CD34⁺ VW-SCの調節に関与するシグナル経路をさらに研究するために重要です。

現在、細胞分離にはさまざまな方法があり、密度勾配遠心分離などの細胞培養特性や細胞の物理的特性に基づく技術など、さまざまな方法が利用可能であり、その結果、多くの非標的細胞を含み、比較的低純度の細胞が選別されます7,8,9,10,11,12 .また、蛍光/磁気支援セルソーティングもよく用いられます。蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、高い技術的要件を有する複雑なシステムであり、比較的高価で時間がかかり、ソーティングされた細胞の活性に潜在的に影響を及ぼす^13,14。しかし、磁気活性化セルソーティング(MACS)は、回収率と細胞活性が高く、ダウンストリームアプリケーションへの影響が少ないため、より効率的で便利です⁸。そこで、本プロトコールでは、MACSを適用してCD34⁺ VW-SCを精製し、さらにフローサイトメトリーにより細胞を同定しました。血管壁幹細胞を研究するためのMACSベースの単離法の確立は非常に貴重です。まず、実験的な遺伝的および細胞生物学的研究を可能にします。第二に、血管壁に常在する幹細胞の効率的な単離と培養により、幹細胞機能を調節するシグナル伝達因子の体系的な評価とスクリーニングが可能になります。第三に、幹細胞における重要な表現型の同定は、細胞の状態を評価する上で重要な「品質管理」を提供します。したがって、精製方法の同定は、血管由来の類似幹細胞への同様のアプリケーションに役立つ可能性があります。

このレポートでは、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色、Ca²⁺シグナル伝達測定による細胞同定と機能評価など、CD34⁺ VW-SCの培養のための安定した信頼性の高い方法の詳細なデモンストレーションを提供します。この研究は、CD34⁺ VW-SCの機能と生理学的および病理学的状態におけるそれらの調節メカニズムに関するさらなる詳細な研究の基礎を提供します。

Protocol

この研究は承認され、動物は中国における実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って取り扱われました。この研究は、動物倫理委員会の承認を得て、動物実験の倫理要件を厳格に遵守しました(承認番号:SWMU2020664)。本研究では、体重18〜20 gの男女の8週齢の健康なC57BL / 6マウスを利用しました。動物は、南西医科大学(SWMU)の実験動物センターに収容されました。

1. 大動脈および腸間膜動脈からの外膜の組織ブロック培養

1. 常駐CD34⁺ VW-SCのアイソレーション
   1. 2 匹のマウスに 3% イソフルラン吸入で麻酔をかけます (施設で承認されたプロトコルに従います)。つま先をつまんで十分な麻酔を確認します。マウスを仰臥位に医療用テープで置き、70%エタノール消毒剤をスプレーしてマウスの毛皮を消毒します。滅菌眼科用ハサミと鉗子を使用して胸腔と腹腔を開き、心臓と腸を露出させます。孤立した大動脈と腸間膜動脈を解剖した後、大動脈と腸間膜床をシリコンエラストマーを含み、生理的塩溶液で満たされたペトリ皿に固定します。滅菌されたハサミと鉗子の別のセットを使用して、大動脈と腸間膜動脈の周りの脂肪を迅速に解剖します。
   2. 解剖した組織を、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB溶液を含む6cmのシャーレに移します( 材料の表を参照)。2回すすいだ後、実体顕微鏡下で動脈を組織培養フードに移します。
   3. 動脈を縦方向に切断し、細い鉗子を使用して大動脈の外層と腸間膜動脈の最初の枝を剥がします。外層を0.1〜0.2 mLの培地が入った3.5 cmのシャーレに移します( 材料の表を参照)。外層を細かく切ります(約1 mm³)。
   4. ティッシュピースをゼラチンでコーティングされたT25フラスコに移し、フラスコの底に均一に分布するようにします。組織片間の適度な距離を保ち、細胞の這い回りと成長を促進します。フラスコをインキュベーター(37°C、5%CO₂)に垂直に3時間置き、組織ブロックがフラスコの底に付着するまで待ちます。
   5. 3時間後、5 mLのDMEM高グルコース増殖培地を加えて、組織ブロックを沈めます。T25フラスコを水平に向けます。組織ブロックの周りの細胞移動を顕微鏡で3日間隔でモニターします。
      注:培地には、20%のウシ胎児血清、0.2%白血病抑制因子(LIF)、0.2 mMのβ-メルカプトエタノール、および1%のペニシリン/ストレプトマイシンが含まれている必要があります(材料の表を参照)。ウシ胎児血清は細胞増殖をサポートし、LIFとβ-メルカプトエタノールは細胞分化を阻害します^7,8。
   6. T25フラスコ内の細胞が約80%のコンフルエントに達したら、それらを1つまたは2つのT75フラスコに継代して培養します。適切な成長と健康を確保するために、5つの継代にわたって細胞を継代培養します。
2. 常在型CD34⁺ 幹細胞の磁気分離
   1. 1つまたは2つのT75フラスコ内の細胞が80%のコンフルエンスに達したら、細胞をトリプシンで解離し、1 mLのソーティングバッファー(2 mM EDTAおよび0.5% FBS)に再懸濁します。細胞番号(10⁷/T75フラスコ)を決定し、細胞懸濁液を300 x g で5分間(室温)遠心分離します。
   2. 上清を完全に廃棄し、細胞ペレットを全細胞10⁷ 個あたり98 μLのソーティングバッファーに再懸濁します。2 μL の CD34 抗体を添加します ( 材料の表を参照)。よく混ぜ合わせ、暗所で4°Cで30分間インキュベートし、時々振とうします。
   3. 2 mLのソーティングバッファーを加えて細胞を洗浄し、300 x g で室温で10分間遠心分離します。
   4. 上清を慎重かつ完全に除去し、細胞を80 μLのソーティングバッファーに再懸濁します。
   5. 20 μL の Anti-FITC MicroBeads (合計⁷ 個の細胞あたり、 材料表を参照) をバッファーに加えます。繰り返しピペッティングでよく混合し、暗所で4°Cで15分間インキュベートし、断続的に振とうします。
   6. 2 mLのバッファーを加えて細胞を2回洗浄し、300 x g で5分間遠心分離して細胞を再ペレットします。上清を完全に捨て、細胞を1 mLのバッファーに再懸濁します。
   7. 1つのMSカラムを適切なセパレーターの磁場内に置き、MSカラムの下に収集チューブ(15 mL遠心チューブなど)を配置して、分離した成分を収集します。( 資料の表を参照)。カラムを500 μLバッファーですすぎ、完全に通過するまで待ちます。
   8. 細胞懸濁液をカラムにロードし、標識されていない細胞を含むフロースルーを15 mLチューブに回収します。
   9. カラムをセパレーターから取り外し、新しい 15 mL 遠心チューブの上に置きます。500 μLのバッファーをカラムに導入し、プランジャーをカラムに押し込んで、磁気的に標識された細胞を速やかに洗い流します。
   10. CD34⁺ 細胞の純度を高めるために、溶出した画分を2つ目のMSカラムを使用して濃縮することができます。上記のように分離プロセスを繰り返します。フローサイトメトリー により 、選別した細胞の純度を評価します。
       注:通常、10%〜20%のCD34⁺ 細胞が得られ、約70%〜80%の陰性細胞が得られ、染色および遠心分離手順により約10%が失われます。
   11. 血管壁CD34⁺ 幹細胞の純度をさらに確認するには、フローサイトメトリーによって選別された細胞を同定します。本研究では、90%以上の純度が示されました。

2. 免疫蛍光法による細胞同定

1. 0.04%ゼラチンでプレコートされたカバースリップ(直径8 mm)上のシードセル。
2. 細胞が約60%〜70%のコンフルエントに達したら、PBSで2回すすぎ、細胞を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定します。
3. 細胞をPBSで3分間(3回)洗浄し、0.2% Triton X-100(PBS中)で室温で5分間細胞を透過処理します。
4. 細胞をPBSで3分間(3回)洗浄し、抗体の非特異的結合を5%ロバ血清(PBS中)で1時間ブロックします。
5. ブロッキングバッファーを取り外すには、各カバースリップを鉗子で端に固定し、糸くずの出ないワイプのシートに排出します。
6. 100倍に希釈した一次抗体(CD34、Flk-1、c-kit、Sca-1、Ki67、 材料表を参照)で細胞を1% BSA(PBS中)で4°Cで一晩インキュベートします。
7. 溶液をデカントし、細胞をPBSで3分間(3回)洗浄します。Alexa Fluor 488標識二次抗体(1% BSA中1:200)( 材料表を参照)と室温の暗所で1時間インキュベートします。
8. DAPIストック溶液をPBSで0.5 μg/mLに希釈し、細胞を5分間インキュベートすることにより、DAPI対比染色を行います。
9. PBSですすぎ、カバーガラスを色あせ防止剤で密封します。レーザー走査型共焦点顕微鏡で画像をキャプチャします。

3. CD34⁺ VW-SCの誘起分化と特性評価

1. CD34⁺ 幹細胞を適切な密度(40%〜50%のコンフルエンス)でカバースリップおよび6ウェルプレートにそれぞれ播種します。
2. 内皮細胞培養培地EBM-2(材料表参照)で細胞を1週間培養することにより、CD34⁺細胞から内皮細胞指向分化を誘導します。
3. 線維芽細胞培養液FM-2(材料表参照)で細胞を3日間培養することにより、CD34⁺細胞から線維芽細胞の細胞指向分化を誘導します。
4. 未分化細胞と分化細胞を、488 nmのレーザー励起と40倍の対物レンズで免疫蛍光染色(ステップ2で述べた)にさらします。内皮細胞マーカー(CD31、VWF)および線維芽細胞マーカー(PDGFRα、ビメンチン)の発現を検出します( 材料の表を参照)。
5. 細胞をトリプシンで解離し、遠心分離(300 x g、5分間、室温)により細胞ペレットを得る。100 μLのソーティングバッファーで細胞を再懸濁します。精製した抗マウス CD16/CD32 mAb (1 μg) ( 材料表を参照) で細胞懸濁液を 4 °C で 5 分間プレインキュベートします。
6. 2 μL の PE Rat 抗マウス CD34 (1:50)、CD31 (PECAM-1) モノクローナル抗体 APC (2 μL、1:50)、および CD140a (PDGFRa) モノクローナル抗体 FITC (2 μL、1:50) をマウス Fc Block 存在下でインキュベートした細胞に直接加え、さらに 4 °C で 15 分間インキュベートします。
7. 2 mLのバッファーを加えて細胞を2回洗浄し、300 x g で5分間(室温)遠心分離して細胞を再ペレットします。上清を完全に捨て、細胞を300 μLのバッファーに再懸濁します。染色した細胞を入れたフローチューブを、フローサイトメトリーの準備ができているアイスボックスに入れます。

4. 血管CD34⁺幹細胞における細胞内Ca²⁺シグナル伝達の検出

1. 実験の10時間前にカバースリップ上のシードセルを最大70%のコンフルエンス密度で。
2. カバースリップを取り出し、ワセリンと一緒にカスタムチャンバーの底に貼り付けます。
3. カバースリップをPBSで一度洗浄し、Tyrode溶液(NaCl 137 mM、KCl 5.4 mM、MgCl₂ 1.2 mM、グルコース 10 mM、HEPES 10 mM、CaCl₂ 2.4 mM)中のFura-2/AM(5 μM)と交換し( 材料表を参照)、暗所で30分間細胞をインキュベートします。
4. Tyrode溶液で10分間処理して染料を除去し、fura-2 / AMの脱エステル化を可能にします。
5. モノクロメーターとCCDカメラを搭載した広視野イメージングシステムを搭載した倒立型蛍光顕微鏡のステージにチャンバーを取り付けます( 材料表参照)。
6. メインウィンドウを開き、[グラブ設定]ダイアログとカメラページに移動し、ライブ画像表示のライブボタンを押します。
7. 蛍光画像タイプを選択し、340 nm/380 nmループの繰り返し時間、画像サイズ、およびカメラの露光時間を380 nmと340 nmに設定して、最適な画像輝度を実現します。
8. 1 つのスナップショットを撮り、複数のフリーハンドの線を描画してセルを異なる色で囲み、背景を ROI 0 として示す関心領域 (ROI) を事前に定義します。
9. ワークスペースビューにすでに埋め込まれているプロトコルを再編集し、新しいワークスペースを作成します。
10. プロトコールを実行すると、「Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)」にオンラインキネティックグラフが表示されます。
11. 数値ビューでは、スプレッドシートが表示され、グレースケール値の列と対応する時間情報が表示されます。クリップボードを使用してスプレッドシートのデータをエクスポートします。
12. バックグラウンド蛍光を差し引いた後の細胞内Ca²⁺ の変化を示すF340 nm/F380 nmを計算します(ROI 0)。

Results

CD34⁺ VW-SCの単離と精製
CD34⁺ VW-SCsの高純度は、マウス大動脈および腸間膜動脈の外来から、組織付着および磁気マイクロビーズ選別によって得られます。血管壁中のCD34⁺ 細胞の割合は、一般に10%〜30%である。フローサイトメトリーでは、磁気ビーズソーティングによって得られたCD34⁺ 細胞の純度が90%以上であることが確認されています(図1A)。細胞免疫蛍光染色により、CD34⁺ VW-SCは主にCD34、c-kit、Flk-1、およびKi-67を発現し、Sca-1の発現は比較的低いことが示されています(図1B)。

CD34⁺ VW-SCの差別化
CD34⁺ VW-SCは、 in vitroで内...

Discussion

この研究は、マウスの大動脈および腸間膜動脈から機能的なCD34⁺ VW-SCを取得するための迅速かつ便利な方法を提供します。この方法で得られたCD34⁺ VW-SCは、増殖活性と多方向分化特性を持っています。三リン酸イノシトール1,4,5-三リン酸受容体(IP₃Rs)、リアノジン受容体(RyRs)、および店舗で作動するカルシウムチャネルは、CD34⁺ VW-SCへの^Ca2+の放出と侵入を媒介します。この技術の確立は、心血管疾患の構造的および機能的リモデリングに関与するCD34⁺ VW-SCに関与するメカニズムのさらなる研究の基礎を築くでしょう。

初代細胞単離の最も一般的な方法には、組織ブロックの接着と酵素解離^{が含まれます15,16}。本報告では、組織ブロックの付着と磁気ビーズ選別を組み合わせて、CD34⁺ VW-SC...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% ゼラチン溶液	Sigma	G1393
抗 CD31 抗体	R&D	AF3628
抗CD34抗体	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
抗FITCマイクロビーズ MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
抗FLK-1抗体	アブカム	ab24313
抗Ki67抗体	CST	34330
抗PDGFR&α; 抗体	アブカム	ab131591
抗SCA-1抗体	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) モノクローナル抗体 (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) モノクローナル抗体 (390), APC	eBioscience Invitrogen	17-0311-82
CD34 抗体、抗マウス、FITC、REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
細胞培養フード	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
遠心分離機	CENCE	L530
CO<サブ>2 インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4111
共焦点レーザー走査型顕微鏡	ツァイス	ツァイス980
DMEM 高グルコース培地	ATCC	30-2002
EBM-2 培地	ロンザ	CC-3162
FACSMelody	BDバイオサイエンス
™システム
ウシ胎児血清	ミリポア	ES-009-C
FM-2培地	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor Plus 488	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A32731
白血病抑制因子	ミリポア	LIF2010
顕微鏡	オリンパス	IX71
MiniMACS  スターティングキット	Miltenyi Biotec	130-090-312
ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシン B 溶液	Beyotime	C0224
精製ラット 抗マウス CD16/CD32 (マウス BD FC ブロック)	BD Pharmingen	553141
実体顕微鏡	オリンパス	SZX10
TILLvisION 4.0プログラム	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF モノクローナル抗体 (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-メルカプトエタノール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21985023