ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

サマリー

本プロトコルは、高い再現性と効率で網膜オルガノイドの接着と融合を減少させる最適化された3D神経網膜誘導システムについて説明しています。

要約

網膜症は、世界中で失明の主な原因の1つです。網膜症の早期診断とタイムリーな治療には、その病因を調査することが不可欠です。残念ながら、倫理的な障壁が人間からの証拠の収集を妨げています。最近、多くの研究により、ヒト多能性幹細胞(PSC)は、異なる誘導プロトコルを使用して網膜オルガノイド(RO)に分化できることが示されており、網膜症において、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および幹細胞ベースの治療に大きな可能性を秘めています。この研究は、小胞化と融合の可能性を大幅に減らし、60日目までの産生の成功率を高める神経網膜(NR)を生成するための最適化された誘導プロトコルについて説明します。解離後にPSCが自己再編成する能力と、特定の相補的要因を組み合わせることで、この新しい方法はNRの分化を特異的に促進することができます。さらに、このアプローチは複雑で費用対効果が高く、顕著な再現性と効率を示し、網膜疾患の個別化モデルに有望な見通しを示し、細胞治療、薬物スクリーニング、遺伝子治療検査などのアプリケーションに豊富な細胞リザーバーを提供します。

概要

哺乳類^の眼では、網膜が主要な視覚感覚組織であり、ヒトの感覚器官の中では眼が主要な情報源となっている1。網膜症は、眼疾患の主要な原因の1つであり、失明につながります²。世界では約285万人が網膜症によるさまざまな程度の視力障害に苦しんでいます³。したがって、その病因を調査することは、早期診断とタイムリーな治療のために重要です。ヒト網膜症に関するほとんどの研究は、主に動物モデルに焦点を当てています^4,5,6。しかし、ヒトの網膜は、さまざまな種類の細胞からなる複雑で多層的な組織です。従来の2次元(2D)細胞培養および動物モデルシステムは、通常、天然のヒト網膜の正常な時空間発生と薬物代謝を忠実に再現することができません^7,8。

最近では、多能性幹細胞(PSC)から組織様臓器を作製する3D培養技術が進化しています^9,10。3D浮遊培養系でヒトPSCから作製された網膜オルガノイド(RO)は、7種類の網膜細胞を含むだけでなく、in vivoでヒト網膜に類似した明確な層状構造を示します11,12,13。ヒトPSC由来ROは人気を博し、広く入手可能であり、現在、ヒト網膜の発症と疾患を研究するための最良のin vitroモデルです^14,15。過去数十年にわたり、多くの研究者が、胚性幹細胞(ESC)や人工多能性幹細胞(iPS細胞)などのヒトPSCが、さまざまな誘導プロトコルを使用してROに分化できることを実証してきました。これらの進歩は、網膜症において、疾患モデリング、薬物スクリーニング、幹細胞ベースの治療に大きな可能性を秘めています16,17,18。

しかし、ヒト多能性幹細胞(PSC)から神経網膜(NR)を作製することは、複雑で煩雑で時間のかかるプロセスです。さらに、組織オルガノイドのバッチ間のばらつきは、結果の再現性の低下につながる可能性があります^19,20。網膜オルガノイド(RO)の収量には、出発細胞の数や種、転写因子や低分子化合物の使用など、多くの内因性および外因性因子が影響を与える可能性があります21,22,23。最初のヒトROが笹井研究室¹¹によって生成されて以来、誘導プロセスの容易さと有効性を高めるために、長年にわたって複数の修正が提案されてきました^13,21,24,25。残念ながら、今日まで、すべてのラボでROを生成するためのゴールドスタンダードプロトコルは確立されていません。実際、異なる誘導方法に起因するROにはある程度の不一致があり、網膜マーカーの発現とその構造の堅牢性には大きなばらつきがあります^22,26。これらの問題は、サンプル収集と研究結果の解釈を著しく複雑にする可能性があります。したがって、RO生成の不均一性を最小限に抑えて効率を最大化するには、より統合された堅牢な微分プロトコルが必要です。

この研究では、Kuwahara et ^al.12 と Döpper et ^al.27 の組み合わせに基づいて最適化された誘導プロトコルと詳細な手順について説明します。この新しい方法は、オルガノイドの小胞化と融合の可能性を大幅に減らし、NRの生成の成功率を高めます。この開発は、網膜疾患の疾患モデリング、薬物スクリーニング、細胞治療への応用に大きな期待が寄せられています。

プロトコル

この研究は、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施され、中国人民解放軍総合病院の施設倫理委員会によって承認されました。WA09(H9)ESCラインは、WiCell研究所から入手しました。

1. 培地および試薬の調製

1. ヒトESC培地および継代溶液
   1. 維持培地(MM):500 mLの完全なMM(基礎培地+ 5xサプリメント; 材料表を参照)を無菌的に調製します。室温(RT)または2〜8°Cで一晩解凍します。 RTに予熱します。 サプリメントが曇らなくなるまで、使用前によくかき混ぜます。
   2. 1% 細胞外マトリックス(ECM):冷やしたピペットチップと滅菌チューブを使用して、チューブあたり 200 μL の ECM( 材料表を参照)を氷上に分注します。チューブは-20°Cの冷凍庫で保管してください。ECMを氷上で溶融し、予冷したDMEM/F12で1:100に希釈します。
   3. 0.5 mM pH = 8.0 EDTA:500 mL の 0.5 mM EDTA を調製するには、500 μL の 0.5 M EDTA と 0.9 g の NaCl を 500 mL の 1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に加えます( 資料表を参照)。よく混ぜて2〜8°Cで保存します。
2. 網膜分化培地
   1. 成長因子フリー化学定義培地(gfCDM):45%のIscove修飾ダルベッコ培地-GlutaMAX(IMDM-GlutaMAX)、45%ハムのF12-GlutaMAX(F12-Glutamax)、10%ノックアウト血清置換(KSR)、1%コレステロール脂質濃縮物、および450μMチオグリセロールを組み合わせてgfCDMを調製します( 材料表を参照)。
3. 低分子化合物
   1. Y-27632 2HCl:50 mgのY-27632粉末を3.122 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に加えます。Y-27632( 材料表参照)を50 mMの濃度で-80°Cで2年間分注し、光を避けて保管します。原液を2,500倍(20 μM)に希釈して使用し、gfCDM1 mLあたりY-27632 0.4 μLに相当します。
   2. IWR1-endo:2.4424 mL の DMSO を加えて 10 mg の IWR1-endo を溶解し( 材料表を参照)、10 mM のストック溶液を得ます。分注し、-80°Cで最長2年間保管してください。gfCDM 1 mL あたり 0.3 μL の 10 mM IWR1-endo を添加し、濃度 3 μM で誘導します。
   3. SB431542:50 mM SB431542調製するには、0.5203 mL の DMSO に 10 mg のSB431542( 材料表を参照)を加え、十分に混合します。溶媒中で-80°Cで最大2年間保存してください。使用濃度 10 μM のSB431542を調製するには、50 mM ストック溶液 2 μL を gfCDM 10 mL に加えます。
   4. LDN-193189 2HCl:5 mgのLDN-193189 2HCl( 材料表を参照)を10.4297 mLのDMSOに溶解し、1 mMの原液を得ます。-20°Cまたは-80°Cで保管してください(メーカー推奨)。gfCDM 10 mL ごとに 0.1 μL のストックを添加すると、100 nM の LDN-193189 が誘導されます。
   5. 組換えヒト骨形成タンパク質4(BMP4):4 mM HCl中で50-200 μg/mLで再構成します( 材料表を参照)。再構成後、2°C〜8°Cで1ヶ月間、または-20°Cで1年間保存してください。1.5 nM BMP4 を使用して NR の誘導を行います。
4. 長期NR培地
   1. レチノイン酸(RA):6 mgのRA粉末( 材料表を参照)を測定し、3.9941 mLのDMSOを加えます。5 mMのアリコートで−80°Cで保存し、3ヶ月以内に使用してください。使用濃度を 0.5 μM にするには、100 mL の神経網膜分化培地(NRDM)に 10 μL のマスターミックスを添加します。使用直前に追加してください。
      注意: 準備中および保管中は光を避けてください。
   2. タウリン:200 mg の 7.9904 mL の DMSO の計量を量るタウリン粉末( 材料表を参照)を添加して、200 mM のストック溶液を得ます。分注し、2〜8°Cで保管します。 0.1 mMのタウリンの使用濃度は、NRDM100 mLあたり50 μLのストック溶液を添加することによって達成されます。
   3. NRDM:DMEM/F12-GlutaMAX培地、1%N2サプリメント、10%ウシ胎児血清、0.5 mM RAおよび0.1 mMタウリンでNRDMを組成します( 材料表を参照)。2〜8°Cで最大2週間または-20°Cで6か月間保管して、コンポーネントの活性を確保します。
5. ブロッキングバッファー:DPBS で 1:9 に希釈し、使用する 10% の作業溶液を得ます( 材料表を参照)。-20°Cで最長5年間保管してください。
   注意: クラスIIバイオセーフティキャビネットで他のすべての手順を実行して、計量を除き、無菌性を確保してください。調製プロセス中に秤量した試薬を追加する必要がある場合は、0.22 μmフィルターを使用してろ過してください。

2. H9-ESCの培養

1. H9-ESCの融解
   1. 1 mL の 1% ECM を 6 ウェルプレートの各ウェルに加えます。インキュベーター内で37°C、5%_CO2 雰囲気で1時間インキュベートします。
      注意: ECMは表面に付着する可能性があるため、ウェル壁に沿ってECMを追加することは避けてください。
   2. 液体窒素タンクからH9-ESCクライオバイアルストックを取り出し、37°Cの水で30秒間すばやく振とうします。
      注意: バイアルを完全に解凍させないでください。
   3. バイアルを取り出し、75%消毒用アルコールスプレーを使用して慎重に滅菌します。凍結したH9-ESCを、10 μM Y-27632を含む9 mL MMを含む15 mLチューブに加えます。
   4. チューブを190 × g で5分間遠心分離し、1 mLのピペットで上清の大部分を慎重に除去し、細胞の損失を防ぐために約50 μLの上清を残します。
   5. 10 μMのY27632を含む1 mLのMMを細胞沈殿物に加え、1 mLのピペットで5〜10回ピペッティングして細胞沈渣を静かに再懸濁します。
   6. 1時間のインキュベーション後にECMコーティングを除去します。10 μM Y-27632 を含む予熱した MM 2 mL を各ウェルに加えます。
   7. ウェルあたり 0.5 mL の細胞懸濁液を分注します。プレートを横方向に静かに振って、細胞が均一に分布するようにします。
   8. プレートに触れずに、5%_CO2 下で37°Cで少なくとも24時間インキュベートします。
   9. 培地は毎日交換してください。クローン密度が70%以上に達すると、継代が必要になります。
2. H9-ESCの継代
   1. 上記のようにECMコーティングプレートを調製し(ステップ2.1.1)、ウェルあたり2 mLのMMを添加します。
   2. 使用済みの培地を6ウェルプレートから取り出します。各ウェルを1 mLのDPBSで2回洗浄します。
   3. 1 mLのEDTAをゆっくりと加え、1 mLのEDTAと室温で4〜7分間インキュベートすることにより、各ウェルを2回洗浄します。
      注:インキュベーション中は、6ウェルプレートを顕微鏡で3分間検査します。ほとんどのセルがディッシュから剥がれそうになったら、すぐに次のステップに進みます。細胞への悪影響を軽減するために、長時間のインキュベーションは避けてください。
   4. EDTAを廃棄し、1 mLのMMを加えて消化を中止します。
   5. 細胞の大部分が剥がれるまで、ウェルプレートを軽くたたきます。
   6. 細胞懸濁液を5 mLピペットで15 mLの遠心チューブに慎重に移します。H9-ESCコロニーを3〜5回上下に静かに再懸濁し、パスツールピテットと混合します。20〜100 μLの細胞懸濁液を新しいECMコーティングされた6ウェル培養皿に移し、前後に振とうします。
   7. 顕微鏡で細胞密度が十分であると観察されたら、プレートに触れずに少なくとも24時間、5%_CO2 下で37°Cでインキュベートします。
   8. メディアは毎日交換してください。クローン密度が70%以上では、継代が必要です。

3. ヒトNRの生成

注:コロニーが約70%のコンフルエンスを達成したら、 図1に概説されている手順を使用して、網膜オルガノイド(RO)への分化に向けることができます。

1. 0日目-胚様体(EB)の形成
   1. 2 mLのDPBSで細胞を洗浄した後、20 μMのY27632を含む0.5 mLのCDS( 材料表を参照)をウェルに加えます。加湿した5%_CO2 インキュベーターで37°Cで3分間インキュベートします。
      注意: 顕微鏡で確認してください。細胞への有害な影響を避けるために、インキュベーションの時間をできるだけ短くしてください。
   2. 20 μM Y27632を含むMMを3 mL添加して消化を中止する。190 × g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
   3. 20 μM Y27632を含む1 mLのgfCDMに細胞ペレットを再懸濁し、細胞をカウントします。20 μM Y-27632、3 μM IWR1-endo、10 μM SB431542、および100 nM LDN-193189(材料表を参照)をあらかじめ組み込んだ10 mLのgfCDMに、1.2×10^6細胞(ウェルあたり1.2×10^4細胞)の対応する容量を加えます。
   4. 100 μL の細胞懸濁液を 96 個の V 底付きコニカルウェルの各ウェルに加えます。プレートを加湿した5%_CO2 インキュベーターに6日目まで入れます。
      注意: EBの付着性を高めるために、皿を少なくとも24時間動かさないでください。
2. 6日目-網膜誘導
   1. 6日目に、55 ng/mLのBMP4を含むgfCDMを10 mL添加して、EB上の培地を完全に交換できるようにします。プレートをインキュベーターに戻します。
      注:気泡を避けるために、96 V底の円錐形ウェルの壁に向かってピペットで移動します。培地を交換するときは、オルガノイドの摂取を避けてください。
   2. 9日目、12日目、15日目に半中程度の変更を行います。培地の半分を新鮮なgfCDMと交換し、BMP4を徐々に希釈します。
3. 18日目-長期的なNR培養
   1. 18日目に、5 mLのパスツールピペットを使用して、形成したEBを15 mLの遠心チューブに慎重に移し、NRDMで再度穏やかにすすぎます。EB を低吸着の 6 ウェルまたは 24 ウェルプレートに移します( 材料表を参照)。プレートをインキュベーターに戻します。
   2. 培地を3日ごとに新しいNRDMと交換します。
      注意: RAは光に敏感であるため、媒体交換中はライトをオフにしてください。悪分化型オルガノイドを除去し、付着オルガノイドを顕微鏡で分離します。

4. ヒトNRの解析

1. ROの取り付け
   1. 異なる世代のH9-ESCを選択して、ROの3つのバッチを誘導します。
      注:誘導成功率を評価するために、3つの評価方法(Kuwahara et ^al.12、Döpper et ^al.27、および本研究の修正法)のそれぞれについて、3枚のプレートでNRの形成数を計算します。30日目に光学顕微鏡で神経上皮様構造の形成が明らかになった場合、誘導は成功したと見なされます。
2. ROの免疫蛍光染色
   1. 3〜5個のROを1.5mLのチューブに移します。余分な培地をピペットで取り出し、室温で 1 mL の DPBS で RO を 1 回洗浄します。 RO が沈むのを待ち、DPBS を慎重に除去します。1.5 mLチューブあたり1 mLの4%パラホルムアルデヒド( 材料表を参照)を添加し、4°Cで固定します。
      注:6日目と18日目のRO、2時間を修正します。30 日目に 12 時間、60 日目に 14 時間固定します。
   2. 固定後、グラジエントアルコールを使用して脱水します。ROを50%、60%、70%のアルコールでそれぞれ15分間放置し、続いて80%、90%、95%、100%、および100%のアルコールでそれぞれ10分間放置します。次に、100%アルコールとキシレンを1:1で混ぜ合わせて10分間、続いてキシレンをそれぞれ10分間2回加えます。
   3. 溶融したパラプラスト( 材料表を参照)を充填した金型にROを40分間置き、次に金型を氷上で急冷してROを固定します。包埋箱を型に入れ、-20°Cで一晩凍結します。その後、埋め込みボックスを慎重に取り外します。最後に、RTに保存します。
   4. パラフィンスライサーで連続切片(厚さ5μm)を作成します。接着顕微鏡スライドにスライスを固定し、乾燥させ、室温で保存します。
   5. 抗原修復の前に脱ろうと再水和を行う^12,27.
   6. 10 mLの20x pH 6.0クエン酸抗原賦活化溶液( 材料表参照)を190 mLのddH₂O(二重蒸留H₂O)に加えます。電子レンジでハイモードで沸騰するまで4分間加熱します。パラフィン切片を追加した後、切片を低モードで20分間加熱し、抗原修復を完了します。
   7. パラフィン切片を換気された場所で自然に冷却してから、湿気の多いチャンバーに入れます。
   8. パップペン( 材料表を参照)を使用して、セクションの輪郭を描きます。0.2% Triton X-100 を室温で 30 分間インキュベートしてメンブレンを破砕した後、スライドを TPBS で 5 分間ずつ 3 回洗浄します。
   9. 10%ロバ血清をDPBSで希釈し、RTで1時間、湿潤チャンバーで1時間、染色面積あたり10 μLのブロックします。
   10. 10%ロバ血清で希釈した一次抗体を添加します。加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。サンプルをTPBSで10分間ずつ3回洗浄し、結合していない抗体を除去します。
       注:一次抗体は、抗PAX6(1:250)、抗SOX2(1:200)、抗KI67(1:200)、抗CHX10(1:200)、抗βチューブリンIII(1:250)、抗NESTIN(1:200)です( 資料表参照)。
   11. DPBSで希釈した二次抗体を加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。TPBSで洗浄ステップを3回、それぞれ10分間繰り返します。
       注:蛍光二次抗体の消光を防ぐため、暗所に保管してください。二次抗体は、ロバ抗マウスIgGと結合したAlexa Fluor 488と、ロバ抗ウサギIgGと結合したAlexa Fluor 568を希釈率1:400で結合したものです( 材料表を参照)。
   12. DAPI(1:500; 材料表参照)を含むDPBSと室温で暗所で10分間インキュベートします。TPBSで10分間ずつ3回洗浄します。
   13. 適量の蛍光防止シーラー( 材料表を参照)をスライドに落とし、カバースリップで覆います。
   14. フローライクな組織細胞定量分析装置( 材料表を参照)などを使用して可視化します。
   15. 顕微鏡分析後、スライドは暗所で-20°Cで保管してください。

結果

変更されたプロトコルの概要を 図1に示します。H9-ESCは、細胞を70%〜80%の密度に増殖させたときにROを生成するために使用されました。96個のV底円錐ウェルにおけるH9-ESCの単一細胞懸濁液は、1日目に凝集し、6日目までに十分に外接した円形EBを形成した。培養時間が長くなるにつれて、EBの量は徐々に増加しました。30日目には、神経上皮様構造が明確に形成され、長期NR分化中に肥厚しました。

さらに、改変した方法を他の2つの方法(Kuwahara et ^al.12およびDöpper et ^al.27)と比較し、その再現性と効率を評価しました(補足図1)。また、この研究では、修正法後の1日目のEBの形態が、他の2つの方法よりもわずかに悪いことが観察されました。しかし、改変法を用いて形成された神経上皮構造は、18日目にはより連続的であった(図2

ディスカッション

ヒトROは、胎児網膜の発達を空間的および時間的に再現することができ、初期のROは、同等の発達段階において胎児の網膜と高度の類似性を示す¹⁵。組織の形態と分子発現の点で、ヒトROは網膜組織の実際の成長状態を厳密に反映しており、疾患モデリング、薬物スクリーニング、再生医療の分野で途方もなく前例のない機会を提供します。現在、 in vitroでヒトPSCからROを生成するためのいくつかの異なる方法が確立されており、さらなる効率向上のために継続的な改変と最適化が進行中である⁹。笹井研究室は、ヒトESCからのPSC由来ROの産生を初めて報告した¹¹。ヒトESCを最初に単一細胞懸濁液に調製し、次に同数の細胞を96個のV底の円錐ウェルに播種し、急速に凝集して円形のようなEBを形成しました。重要な細胞シグナル伝達経路を外部から追加すると、EBの視小胞の形成が促進され、その後、浮遊培養で積層ROに成熟しました。NRには、1種類のグリア細胞と6種類の異なる神経細胞が含まれており、細胞の形態形成、ニ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	洗浄スライス
4% パラホルムアルデヒド	Servicebio	G1101-500ML	網膜オルガノイドの固定
5 mL パスツールピペット	NEST バイオテクノロジー	318516	ピペット 網膜オルガノイド
96 V底円錐形ウェル	住友バケリット	MS-9096VZ
接着顕微鏡スライド	CITOTEST	188105	フィックス スライス
AggreWell 培地	STEMCELL Technologies	5893	中
無水エタノール	SINOPHARM	10009218	脱水
抗 CHX10	サンタクルーズ	sc-365519	一次抗体
退色防止液	ZSGB-BIO	ZLI-9556
抗 KI67	アブカム	ab16667	一次抗体
抗ネスティン	シグマ	N5413	一次抗体
抗神経 クラス III &β;-チューブリン(TUJ1)	Beyotime	AT809	一次抗体
抗PAX6	Abcam	ab195045	一次抗体
細胞解離溶液(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	細胞解離
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3&/β阻害剤
コレステロール 脂質濃縮物	Gibco	12531018	250×
クエン酸抗原賦活化液	Servicebio	G1202-250ML	20回, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	細胞凍結培地
DAPI	ロシュ	10236276001	核対比染色
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	二次抗体
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	二次抗体
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)Biosharp		BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	コーニング354277		コーティングプレート
F12-Glutamax	Gibco	31765035	中
ウシ胎児血清	Gibco	A5669701
Flow-like 組織細胞定量分析装置	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	スキャンセクション
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt阻害剤
ノックアウト血清交換	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP阻害剤
低接着性 24ウェルプレート	Corning	3473
低接着性6ウェルプレート	Corning	3471
メンテナンス培地 (MM)	STEMCELL Technologies	85850	ミディアム
N2 サプリメント	Gibco	17502048
ノーマル ロバ セラム	ソーラーバイオ	SL050	ブロッキングバッファー
パラプラスト	ライカ	39601006	組織包埋
PBS pH 7.4 塩基性 (1x)	Gibco	C10010500BT	Ca+、Mg+
Reconbinant Human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	主要なタンパク質因子
レチノイン酸		Σ R2625	粉末、光を避けて
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5阻害剤
SU5402	Selleckchem	S7667	チロシンキナーゼ阻害剤
スーパーPAPペン	ZSGB-BIO	ZLI-9305
タウリン	シグマ	T0625-10G
チオグリセロール		Sigma M1753
Triton X-100	Sigma	X100	透過化
WA09 胚性幹細胞株	WiCell Research Institute		細胞株
キシレン	SINOPHARM	10023418	脱ロウ
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor