術後イレウスマウスモデル

サマリー

腸の操作によって生成された術後イレウスのマウスモデルについて説明します。胃腸トランジット機能、病理学的変化、および免疫細胞の活性化は、手術の24時間後に評価されました。

要約

ほとんどの患者は、手術後に術後イレウス(POI)を経験し、これは罹患率、死亡率、および入院時間の増加に関連しています。POIは、手術中の機械的損傷の結果であり、胃腸管の運動性が乱れます。POIのメカニズムは、異常なニューロンの感受性、上皮バリア機能の障害、および局所炎症の増加に関連しています。しかし、詳細は謎のままです。したがって、POI損傷の病態生理学とメカニズムを解明し、新しい治療法を開発するためには、実験的なマウスモデルが重要です。

ここでは、臨床手術と同様の腸操作(IM)によって生成されたPOIのマウスモデルを紹介します。これは、綿棒で腹部を1〜3回マッサージすることにより、小腸に機械的損傷を与えることによって達成されます。IM は、手術後 24 時間で消化管通過を遅らせました。これは、FITC-デキストラン強制経口投与および分節消化管の蛍光検出によって評価されます。さらに、粘膜下組織の腫脹と免疫細胞の浸潤をヘマトキシリンとエオシンの染色とフローサイトメトリーによって調べました。IMの適切な圧力と腸への充血の影響は、手順にとって重要です。このPOIのマウスモデルは、腹部手術後の腸の損傷と回復のメカニズムを研究するために利用できます。

概要

術後イレウス (POI) は、人間の健康の分野、特に腹部手術を受ける患者の管理において大きな課題となる症候群です。POI は、胃腸の運動性の回復が遅れることを特徴とするため、入院期間の長期化と医療費の増加の一因となりますが、確立された定義、病因、または治療法は存在しません¹。最近の研究では、POI ^2,3,4の進行における免疫細胞の重要な役割が明らかになっていますが、その根本的なメカニズムを解明するためには、さらなる研究が必要です。

このプロトコルでは、腹腔内手術によって誘発されるPOIのマウスモデルを導入し、腹部手術が消化管に与える影響を厳密に模倣します。私たちの目標は、マウスでPOIをモデル化するための標準化された方法を提供し、研究者がその病態生理学を調査し、新しい治療介入を探求できるようにすることでした。

この技術の開発と利用の背後にある理論的根拠は、POIを研究するための信頼性の高い前臨床モデルの必要性にあります。POIを研究する従来のアプローチでは、翻訳の関連性が欠けていたり、状態に寄与する要因の複雑な相互作用を捉えることができなかったりすることがよくあります。臨床シナリオを忠実に再現したマウスモデルを導入することで、研究者はPOIの根底にあるメカニズムをより正確に調査し、制御された実験環境で潜在的な治療介入をテストできます。

他の手法と比較して、このプロトコルで提示されるPOIのマウスモデルにはいくつかの利点があります。当初、私たちは実験結果を最近の進歩と統合して、実験動物にPOIを誘導するための標準化された再現性のあるプロトコルを確立しました。このプロトコルは、胃腸トランジット機能の一貫した評価を容易にします。次に、組織学的染色とフローサイトメトリーを使用することで、組織の腫脹、免疫細胞の増殖、活性化の評価が可能になり、POI⁵の根底にある炎症過程に関する貴重な洞察が得られました。

文献のより広い文脈では、POIのマウスモデルを確立することは、この状態の病態生理学を理解することを目的とした研究の拡大に貢献します。基礎科学と臨床診療の間のギャップを埋めることにより、前臨床モデルはPOI⁶の新規治療戦略の開発において極めて重要な役割を果たします。さらに、標準化された動物モデルが利用できるため、異なる研究室間での研究結果の再現性と比較可能性が向上します。ただし、このPOIモデルは、外科的処置中の機械的刺激に依存しています。他の形態の刺激誘発性イレウスは、このモデルには適していない可能性があります。さらに、研究者は、このモデルを使用して実験を計画する際に、動物福祉の規制、倫理的考慮事項、リソースの利用可能性などの要素を考慮する必要があります。

要約すると、POIのマウスモデルの導入は、この衰弱状態に関する前臨床研究の注目すべき進歩を意味します。さらに、H&E染色とフローサイトメトリーを使用して、組織の腫脹と免疫細胞の増殖と活性化を評価しました。マウスのPOIモデルの確立は、POIメカニズムの発見を促進し、POIの新規治療法の開発を促進するでしょう。

プロトコル

動物の世話と実験手順は、動物の世話と使用の指導原則(中国)に従って実施され、北京友好病院の倫理審査委員会(NO.20-2056)によって承認されました。C57BL/6マウス(8-12週齢)を研究に使用しました。

1. 手術の準備

1. 実験条件の標準化を満たすために、計画されたモデリングの12時間前にすべてのマウスを高速にしてください(図1A)。
2. 手術器具を準備し、滅菌します。
3. 麻酔薬のトリブロモエタノールと加熱パッドを準備します。加熱パッドを監視して過熱を防ぎ、一定の温度(37.5°C)に保ちます。

2.麻酔

1. 各マウスをトリブロモエタノールで麻酔します。
   1. トリブロモエタノールを希釈して、生理食塩水で20 mg / mL溶液を調製します。腹腔内注射により、体重10 gあたり0.2 mLのトリブロモエタノール作業溶液を投与します。.麻酔下での乾燥を防ぐために、マウスの目に眼科用軟膏を使用してください。.
   2. マウスが5分以内に完全に麻酔をかけられ、20分間麻酔をかけられたままであることを確認してください。
2. マウスが直立していないことを観察して麻酔の深さを評価し、筋肉の弛緩を確認します。随意運動の喪失、まばたき反射、反射刺激への反応(つま先や尻尾をしっかりとつまむ)を観察します。
3. 胸壁と腹部の動きを監視することにより、マウスの呼吸数とパターンを評価します。最適な麻酔下で呼吸数が~55-65呼吸/分であることを確認してください。
4. 麻酔をかけたマウスをボードの上に置き、テープで固定します。
5. マウスに完全に麻酔をかけた後、電動ヘアシェーバーを使用して腹部から毛を取り除きます。髭剃り後、生理食塩水で湿らせたコットンボールで腹部の抜け毛を全て拭き取ります。
   注:トリブロモエタノールを取り扱うときは、曝露リスクを最小限に抑えるために、適切な換気とヒュームフードまたはバイオセーフティキャビネットの使用を確認してください。処置中は、化学物質や生物学的物質との偶発的な接触を防ぐために、手袋や白衣などの適切な個人用保護具を着用してください。

3. 手術

1. 手足を完全に伸ばして腹部を露出させます。マウスの頭が気道が空くように配置されていることを確認します(図1B)。
2. 75%アルコールを染み込ませたコットンボールを使用して、手術部位の皮膚を2回消毒します。消毒後、乾燥した滅菌済みの医療用ガーゼを使用して、腹部から余分なアルコールを取り除きます。リドカイン(10 mg / kg、皮下)を切開前に目的の部位に投与します。.
3. 滅菌メスを使用して皮膚を切開し、ピンセットを使用して腹部の中央にある腹直筋を持ち上げます。
   1. 腹部直筋の正中線に沿って小さな切開を行い、腹部のさまざまな臓器が損傷しないように注意します。
   2. 切開のおおよその範囲が次のとおりであることを確認してください。切開部の上縁が胸骨の剣状突起から 6〜8 mm 、下縁が外性器から 6〜8 mm 、切開部の長さが ~1 cm であることを確認します。
4. 腹部切開の両側に滅菌外科用ドレープまたは滅菌ガーゼを置きます。止血鉗子を使用して、切開部の上端と下端に滅菌ガーゼを固定し、切開部を露出させます(図1C)。
   注:偽のグループでは、切開部を湿ったガーゼで5分間覆い、外科的手術は行わなかった。
5. 滅菌ドレープまたはガーゼを適切に固定し、生理食塩水で事前に湿らせた2本の綿棒を使用して、切開部に隣接する腹壁の両側を優しく押します。切開部から腸管を少量絞り出し、滅菌ドレープまたはガーゼの上に置いて露出させます(図1D)。
6. 2本の滅菌綿棒を生理食塩水で完全に湿らせます。湿らせた綿棒で腸内組織をやさしくつかみ、小腸を丁寧に取り除きます。
   1. 盲腸の位置を特定し、膵臓に触れないように胃の2cm前まで滅菌綿棒で腸を取り出します。膵臓-十二指腸靭帯の近位端から回盲領域の遠位端まで腸を延長します。
7. 近位端から遠位端まで小腸全体に沿って一定の圧力をかけます。腸の表面に小さな出血斑が現れるまで、5分間均一な力を加えます(図1E)。
8. 5分後、事前に湿らせた滅菌綿棒を使用して、小腸の正常な生理学的解剖学的位置に従って、すべての小腸を慎重に腹腔に戻します。
9. 滅菌ガーゼと腹壁を横切って腹部を3〜5秒間優しくマッサージして、腸が自然な解剖学的位置に回復することを確認し、手術後の人工的な機械的腸閉塞または腸間膜捻転を防ぎます。
10. 腹腔内に生理食塩水を100μL注入して、手術中に失われた体液を補充し、腹部組織を潤滑します。
11. 6-0外科用縫合糸を使用して腹部を閉じ、腹部切開部で2層閉鎖を行います。腹部の臓器への損傷を避けるために注意しながら、連続縫合糸で筋肉層を閉じることから始めます。縫合中に腹直筋を持ち上げます(図1F)。
12. 腹直筋を完全に閉じた後、6-0外科用縫合糸を使用して単純な間欠縫合で完全に縫合します。ステッチの長さは~0.5mm、針の間隔は~2mmに保ちます。
13. 腹部切開部を閉じた後、切開部付近を乾燥滅菌医療用ガーゼで優しく拭き、血液、組織液、または生理食塩水から乾燥して清潔に保ちます。
14. 手術後の裂け目を避けるために、切開部とその周囲に少量の医療用切開接着剤を塗布します。
15. 医療用切開用接着剤が完全に乾いたら、マウスをペーパータオルに移し、マウスが完全に回復するまで37.5°Cの一定温度に維持された加熱ブランケットの上にケージペーパータオルを置きます。動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
16. 覚醒したマウスを動物の摂食バリア環境に移し、検出時間まで自由に飲ませます。

4. 胃腸トランジットアッセイ

1. 手術後22.5時間で絶食マウスに200μLのFITC-デキストラン溶液(PBSで5 mg / mL)を強制経口投与します(図1A)。
2. 施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認された方法、たとえば_CO2 吸入とそれに続く子宮頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させます。
   1. 消化管を分離するには、横隔膜から骨盤まで正中線を切開し、周囲の結合組織と臓器を慎重に取り除きます。
   2. 消化管を周囲の組織や臓器から分離し、胃から肛門までの全管が含まれるようにします。
3. 消化管を生理学的位置(配列:St -S1:S10-Ce-L1:L3)に基づいて1から15までの順番に番号付けされた15の等しいセグメント(胃から結腸まで)に分割します(図2A)。
4. 腸組織の各セグメントをその内容物とともに1〜4 mmの小片に切断し、1 mLのDPBSを含む別々の1.5 mL遠心分離チューブに入れます。.
5. 遠心分離管を10秒間ボルテックスして、サンプルを均質化します。
6. チューブを500 × g で1分間遠心分離します。マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、FITC蛍光定量のために上清を収集します。
7. FITC-デキストランの幾何学的中心 (GC) を計算して胃腸トランジットを説明し、次の式を使用して計算します: (Σ[% FITC per segment x segment number])/100。

5. パラフィン包埋とヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色

1. CO₂ 吸入とそれに続く24時間後の子宮頸部脱臼によりマウスを安楽死させます。パラフィン包埋と消化管アッセイを同じ動物で実施します。
2. 腹腔を開き、小腸組織を採取してさらに分析します。
3. Carnoyの固定液(60%メタノール+10%酢酸+30%クロロホルム)の腸内容物で腸全体を4°Cで2時間固定します。
4. 毎回30分間、メタノールで2回すすいで、組織を脱酸します。
5. メタノールをエタノールに2回、30分間ずつ置き換えます。
6. 毎回30分間、メタノールで2回すすいで、組織を脱酸します。キシレンで組織の透明性を得るには、組織をキシレンに浸し、1時間インキュベートします。
7. パラフィン包埋機を使用して、組織をパラフィンワックスに埋め込みます。ミクロトームを使用して、埋め込まれた組織を4 μmの厚さにスライスします。
   注意: パフォーマンスを向上させるために、小腸をさまざまなワックスに分割します。セグメントに適切なラベルを付けて、その位置を特定します。
8. HE染色キットを使用してHE染色を行います。スライドを密封し、顕微鏡で分析のために調べます。

6. 免疫細胞の単離とフローサイトメトリー

1. 次の解決策を準備します。
   1. 消化前溶液:Ca²⁺ およびMg²⁺ を含まないハンクの平衡塩溶液を、1 mMジチオスレイトール(DTT)および10 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で調製します。
   2. 消化液:RPMI 1640に200 μg/mL DNAase I、500 μg/mLコラゲナーゼIV、4% FBS、および100 μM HEPESバッファーを含む溶液を調製します。
   3. 磁気活性化セルソーティングワークス(MACS)バッファー:Ca²⁺ またはMg²⁺を含まないPBSに5 g/L BSAおよび2 mM EDTAを含むバッファーを調製します。
2. 通常の生理食塩水で腸を洗って、糞便の内容物を取り除きます。小腸のパイエルパッチと結合組織を取り除きます。.小腸を縦方向に切り開き、次に氷冷PBSで1cmのセグメントに切ります。
3. 腸セグメントを消化前溶液で37°Cで20分間、オービタルシェーカーで洗浄します。消化前溶液を採取し、70 μmセルストレーナーでろ過して、上皮内リンパ球(IEL)を取得します。
4. 消化溶液中でセグメントを30分間消化した後、70 μmの細胞ストレーナーで懸濁液をろ過し、固有層リンパ球(LPL)を得ます。
5. LPL細胞を500 × g で10分間遠心分離し、上清を捨てます。
6. 細胞をDPBS(アジ化ナトリウム、Tris、およびタンパク質フリー)で1 x 10⁶ 細胞/100 μLの濃度で洗浄し、懸濁します。
7. 細胞を蛍光生存率色素(1:500)で室温(RT)の暗所で15分間インキュベートします。
8. 細胞をMACSバッファーで懸濁し、500 × g で5分間遠心分離します。
9. 血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、染色された細胞をカウントします。細胞を1 x 10⁶ 細胞/100μLのMACSバッファーの濃度で再懸濁します。細胞懸濁液に適量の抗体を添加し、4°Cで15分間インキュベートすることにより、抗体染色(1:200-1:400)を行います。
10. ステップ6.8の説明に従って細胞を洗浄します。
11. フローサイトメトリーを使用してサンプルを検出し、関連するフローサイトメトリーソフトウェア^7,8でデータを分析します。

結果

このプロトコルでは、POI は腸操作 (IM) によって外科的に誘発されましたが、これは臨床手術の効果に似ています。偽のグループでは、IMなしで切開が行われました。POIマウスは、偽対照マウスとともにPOI手術の24時間後に犠牲にされました。消化管の重要な機能である内容物輸送機能は、FITC-デキストランの強制によって検出されました。POIモデルは、FITC強度が小腸の近位部分で増加したため、成功したと見なされました(図2B)。平均GCは、IMのトランジット機能障害を定量化し、操作の一貫性を示すために計算されました(図2C)。

HE染色は、消化管のさまざまなセグメントの形態を示しました(図3)。十二指腸と回腸の粘膜下層と平滑筋層は、POI導入の24時間後に腫れました(図3A、B)。偽マウスのそれらと比較して、十二指腸のHE染色は、POIマウスの免疫細胞浸潤の増加を明らかにしました(図3A)。

マルチカラーフローサイトメトリー解析は、免疫細胞の割合、状態、および機能を解析するための中心的な方法です。腸組織をコラゲナーゼとデオキシリボヌクレアーゼで消化し、フローサイトメトリーのために単一細胞懸濁液に分離しました。ゲーティング戦略を使用して、LPL中のCD3 T細胞および関連する亜集団の割合を決定しました(図4A)。POIマウスでは、活性化および接着マーカーCD69、およびCD4 T細胞、CD8 T細胞、およびgd T細胞の発現がアップレギュレーションされています(図4B)⁷。同様に、CD44+ PD-1+(活性化、末端分化、および消耗マーカー)亜集団の割合は、増加傾向を示した(図4C)⁷。リンパ球に加えて、骨髄細胞サブセット(好中球、樹状細胞、およびマクロファージ)の割合もIM手術後に増加します(図4D)⁸。

図1:術後イレウスのマウスモデル(A)術後イレウスのマウスモデルの模式図。(B)麻酔および髭剃り後のマウスの固定。(C)切開部を露出させ、医療用滅菌ガーゼで覆いました。(D)腸管を腹部切開部から腹腔外に絞り出し、滅菌ガーゼに装着して露出させた。(E)小腸全体を湿らせた滅菌綿棒にさらしました。(F)筋肉層を外科的縫合糸で閉じた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:消化管機能評価のための消化管トランジットアッセイ。 手術後22.5時間で、偽マウスまたはPOIマウスをFITC-デキストラン溶液で強制経口投与し、90分後に犠牲にしました。(A)消化管は15のセグメントに分割され、生理学的位置に従って番号が付けられました。(B)偽マウスとPOIマウスの消化管からのすべてのセグメントのFITC強度。(C)投与されたFITC-デキストランの幾何学的中心が計算され、バイオリンプロットとして示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:POIマウスの小腸の代表的なHE染色。 偽マウスおよびPOIマウスの(A)十二指腸および(B)回腸の断面のHE染色。スケールバー:100 μmまたは25 μm(インセットの拡大画像)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:POIマウス由来の小腸免疫細胞の代表的なフローサイトメトリー解析。 (A)手術後24時間後のPOIマウスの小腸組織由来のT細胞集団に対するフローサイトメトリーゲーティング戦略。(B)偽マウスおよびPOIマウスの小腸由来のCD4 T細胞、CD8 T細胞、およびgd T細胞におけるT細胞活性マーカーCD69⁺の割合。(C)偽マウスおよびPOIマウスの小腸におけるCD4 T細胞、CD8 T細胞、およびgd T細胞におけるCD44⁺ PD-1⁺活性マーカーの割合。(D)偽マウスとPOIマウスの小腸からのCD45^{+アクアライブ}免疫細胞のうち、好中球(Ly6G ⁺ CD11b ⁺)、樹状細胞(CD11c ⁺ MHC-II⁺)、およびマクロファージ(CD11b ⁺ F4 / 80 ⁺)の割合。各パネルの数字は、それぞれのセルタイプの割合を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

手術の成功は、いくつかの重要なステップにかかっています。まず、腸内壁内(IM)手術中に一貫性を維持することは、小腸に広範な損傷を誘発するために不可欠です。IM手術中に加えられる適切な圧力と、その結果として生じる腸への充血の影響は、手術の成功にとって非常に重要です。綿棒でこすった後、消化管全体がピンク色に変わり、赤い出血性の斑点を示す観察は、手術が成功したことを示す指標として役立ちました。さらに、手術後の平均GC値が約5に留まるようにすることは、モデルが偽マウスのモデルと比較して成功したことを示しています。HE染色で示されているように、粘膜下組織の腫脹と免疫細胞の浸潤の顕微鏡検査も、POIの重症度を検証するための重要なステップとして機能します。

結果を最適化したり、遭遇した課題をトラブルシューティングしたりするために、プロトコルの変更が必要になる場合があります。例えば、腸上皮の形態学的変化を正確に示すためには、Carnoyの固定液を用いて腸組織とその内容物を埋め込むことが推奨される⁹。この独自のインベデンディングプロトコルにより、組織の形態保存に不可欠な迅速な固定が可能です。ただし、研究者の目的が上皮または固有層に焦点を当てている場合は、腸組織製剤のワックス埋め込みに改良されたスイス圧延技術を採用することをお勧めします¹⁰。この技術は、腸組織の隙間を圧縮し、絨毛の方向を一定に保ち、ワックスで包埋された1つのサンプルに小腸全体を包埋することを容易にします。

その有用性にもかかわらず、プロトコルには制限があります。1つの制限は、動物モデルに依存していることであり、これは人間の病態生理学の複雑さを完全に再現できない可能性があります。さらに、手術手技や個々のマウスの反応のばらつきにより、結果にばらつきが生じる可能性があります。私たちの最近の研究によると、一貫した演算子を使用することは、演算子に依存する変動性を減らすための重要な原則です。さらに、Vanらは、腸に特定の重量を加えることができる自作のデバイスを導入し、異なるマウス¹¹間でIMに一貫した圧力を確保する。このアプローチは、モデルの一貫性を維持する上で確かに価値があることが証明されています。

このプロトコルは、マウスのIM手術を通じてPOIを誘導するための標準化された方法を提供することにより、この分野への貴重な貢献を表しています。このプロトコルは、重要なステップを解明し、組織包埋と免疫細胞単離のための修飾を提供することにより、POIモデリングの再現性と信頼性を向上させます。免疫細胞解析にフローサイトメト^リー7,8を利用することで、POIの病因の根底にある免疫応答を包括的に調査することができ、既存の技術を補完し、この複雑な症候群の理解を深めることができます。

ここで紹介するプロトコルは、POIの理解と治療に焦点を当てた将来の前臨床研究に有望です。外科的技術を洗練し、組織処理方法を最適化することで、研究者はPOI開発の根底にあるメカニズムをさらに探求し、新しい治療標的を特定できます。さらに、このプロトコルとフローサイトメトリーの互換性により、詳細な免疫プロファイリングが可能になり、POI症状の緩和を目的とした免疫調節介入の研究への道が開かれます。全体として、このプロトコルは、POIに関する知識を深め、患者の転帰を改善するための標的治療戦略を開発するための基礎を築くものです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC 抗マウス I-A/I-E (MHC-II)	バイオレジェンド	107614
APC 抗マウス TCRb	バイオレジェンド	109212
APC/Cy7 抗マウス CD4	バイオレジェンド	100414
APC/Cy7 抗マウス Ly6G	バイオレジェンド	127624
ブリリアントバイオレット 421 抗マウス CD69	バイオレジェンド	104545
ブリリアントバイオレット 421 抗マウス F4/80	バイオレジェンド	123132
ブリリアントバイオレット 785 抗マウス/ヒト CD44	バイオレジェンド	103041
BUV395 抗マウス CD8a	BD	563786
BUV737 抗マウス CD3e	BD	612771
コラゲナーゼIV	Sigma-Aldrich	C5138
培養顕微鏡	CKX53	リンパス
デオキシリボヌクレアーゼ I 牛膵臓由来 (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol solution	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC 抗マウス CD45	Biolegend
FITC-デキストラン (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal Transit Assay
HE staining kit	solarbio	G1120
PE anti-mouse CD11b	Biolegend	101208
PE anti-mouse PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Flow cytometer	BD-Immune	cell detection and sorting
トリブロモエタノール	Sigma-Aldrich	T48402	Anesthesia
Varioskan LUX	Thermo	N16699	マルチモードマイクロプレートリーダー
Zombie Aqua Fixable Viability kit	Biolegend	423102	Fluorescent生存率染料