ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

Summary

このプロトコルは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からのヒト破骨細胞の微分を示し、破骨細胞および破骨細胞の前駆細胞の性格描写のための方法を記述する。

Abstract

このプロトコルでは、ヒトiPS細胞の増殖と継代、および破骨細胞への分化について詳しく説明します。まず、iPS細胞を単一細胞懸濁液に解離し、胚様体誘導に利用します。中胚葉誘導後、胚様体は造血分化を受け、浮遊造血細胞集団を産生します。その後、採取された造血細胞は、マクロファージコロニー刺激因子の成熟段階を経て、最後に破骨細胞の分化を経ます。破骨細胞の分化後、破骨細胞はメチルグリーン核染色と組み合わせたTRAPの染色を特徴としています。破骨細胞は、多核のTRAP+多核として観察されます。それらの同定は、カテプシンK染色によってさらに裏付けられます。骨およびミネラル吸収アッセイは、機能的特性評価を可能にし、真正な破骨細胞の同一性を確認します。このプロトコールは、ヒト破骨細胞とiPS細胞を区別するための堅牢で汎用性の高い方法を実証し、大量の機能的なヒト破骨細胞を必要とするアプリケーションへの容易な採用を可能にします。骨研究、がん研究、組織工学、人工骨内研究などの分野での応用が想定されています。

Introduction

破骨細胞(OC)は造血由来の^1,2汎用性の高い細胞タイプであり、骨疾患研究3,4、がん研究^5,6、組織工学^7,8、エンドプロテーゼ研究^9,10などの分野の研究者によって一般的に使用されています.それにもかかわらず、機能的なOCを作製するには単核前駆体の多核OCへの融合が必要であるため、OCの分化は困難な場合があります¹¹。OCの分化には、NF-κBリガンド受容体活性化因子(RANKL)やマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)など、いくつかの生物学的因子が必要です。M-CSFは、細胞増殖、細胞生存、およびRANK発現にプラスの効果をもたらすことが報告されています12,13,14。一方、RANKLはRANKに結合し、破骨細胞形成を誘導する下流のシグナル伝達カスケードを活性化します。活性化はTNF受容体関連因子6(TRAF6)を介して媒介され、NF-κB二量体に結合する結合タンパク質であるB細胞阻害剤α(IκB-α)のκ光ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子の分解につながる^16,17。したがって、IκB-α分解によりNF-κB二量体が放出され、これが核内に移動し、転写因子c-Fosおよび活性化T細胞核因子1(NFATc1)の発現が誘導されます。これにより、多数のOC分化関連タンパク質の転写が引き起こされる^15,18。DC-StampやAtp6v0d2などのアップレギュレーションされたタンパク質は、OC前駆体の細胞間融合を媒介し、合胞体の形成を引き起こします^19,20,21。

ヒト初代細胞に関しては、CD34⁺ およびCD14⁺ PBMCが現在、OCへの分化に最も広く使用されている細胞型である²²。しかしながら、このアプローチは、ドナーから採取された細胞のCD34⁺ 集団内の不均一性²³ およびそれらの限られた拡張性によって制限される。ヒトiPS細胞は、OCの代替供給源となります。それらは無期限に伝播することができる^ので24、それらはOC生産の拡張性とアップスケーリングを可能にします。これにより、多数のOCの区別が可能になり、OC研究が容易になります。

iPS細胞をOCに分化させるためのいくつかのプロトコルが発表されています25,26,27。分化過程全体は、iPS細胞増殖部、中胚葉分化部、造血分化部、OC分化に分けられます。分化プロセスの前にiPS細胞を増殖させることで、分化前のOC産生のスケールアップが可能になります。中胚葉分化と造血分化に関しては、いくつかのアプローチがあります。従来、胚様体(EB)形成は造血細胞の分化に使用されてきましたが、単層ベースのアプローチは、EB誘導を必要としない別の造血分化戦略を表しています。それにもかかわらず、単層ベースのシステムは、EBベースのアプローチがOCの分化のためにより頑健であることを発見したため、さらなる最適化が必要であるようです。

ここでは、EBベースのプロトコルを用いたヒトiPS細胞からのOCの鑑別について説明します。このプロトコルは、Rössler et ^al.26 から採用され、頑健性を高め、分化プロセス中の凍結保存を可能にするように修正されました。まず、10日間の分化後に造血細胞を1回だけ採取しました。その後、造血細胞を凍結保存し、分化プロセス中の柔軟性を高めました。さらに、造血細胞の播種密度を1 x 10⁵ から2 x 10⁵ cells/cm² に増やし、OC分化に成功させました。より最近のヒトiPS細胞無血清培地(iPS細胞-SFM、 材料表参照)を使用し、0.1%ゼラチンの代わりに200-300μg/mLの基底膜抽出物( 材料表参照)でウェルをコーティングしました。ペニシリン/ストレプトマイシンは培地に添加しなかった。

Rösslerらによるプロトコル²⁶は、もともとiPS細胞から造血にEB形成を使用するマクロファージ分化プロトコル²⁸に適応したものである。EB形成は造血分化のために研究者によって長期間使用されてきましたが^29,30、EB誘導のいくつかの方法は、自発的凝集、丸底ウェルプレートでの遠心分離、吊り下げドロップ培養、バイオリアクター培養、円錐管培養、ゆっくりと回転する側方血管、およびマイクロモールドゲル培養³¹など、文献に記載されています.このプロトコルでは、解離したiPS細胞を丸底ウェルプレートで遠心分離し、単一のiPS細胞を互いに近づけ、以下で説明するように球体(EB)の形成を可能にします。

Protocol

注:このプロトコルで使用されるすべての試薬は、 材料表に記載されています。特に指定のない限り、すべての培地は使用前に37°Cに事前に平衡化されています。すべての遠心分離ステップは、37°Cで、最も遅い加速/減速モードを使用して実行されます。特に指定のない限り、上清は常に使い捨てのパスツールガラスピペットを使用して除去されます。

1. ヒトiPS細胞の融解と増殖

1. iPS細胞を融解する前日に、6ウェルプレートのウェルに200-300μg/mLの濃度で1mLの基底膜抽出物をコーティングします。ウェルプレートを4°Cで一晩置きます。
2. 翌日、細胞を融解し、P1000ピペットを使用して15 mLチューブに移します。滴下し、5〜7 mLのDMEM/F-12と15 mM HEPESを加えます。
3. 細胞を300 x g で5分間遠心分離します。遠心分離機から細胞をそっと取り出し、細胞ペレットを乱さないように注意してください。
4. パスツールグラスピペットで上清を慎重に除去し、細胞を1 mLのヒトiPS細胞血清遊離培地(10 μMのRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632を含むhiPSC-SFM)に、先端の広いP1000を用いて再懸濁します。
5. 前日に塗布したウェルから基底膜抽出物を吸引し(ステップ1.1)、10μMのY-27632を含むiPSC-SFM1mLをウェルに移します。再懸濁したiPS細胞をウェルに添加し、最終容量がウェルあたり2 mLになるようにします。
6. プレートを回転させてiPS細胞の凝集体を均一に分散させ、37°C、5%_CO2のインキュベーターに入れます。
7. iPSC-SFM(ROCK阻害剤Y-27632を添加しない)を用いて、1日おきに完全な培地交換を行う。iPS細胞は通常、3〜4日で増殖後に70〜80%のコンフルエントに達します。

2. 継代iPS細胞

1. 継代iPS細胞の1日前に、6ウェルプレートのウェルに200〜300μg/mLの濃度で基底膜抽出物をコーティングします。ウェルプレートを4°Cで一晩置きます。
   注:細胞が約70〜80%のコンフルエントに達していることを確認します。iPS細胞が過剰にコンフルエントにならないように(80%以上のコンフルエントに)、自然分化を促進します。
2. 10 μLまたは20 μLのピペットチップまたは細胞スクレーパーを使用して、実体顕微鏡下で分化領域または死体iPS細胞凝集体が多数存在する領域を除去することにより、iPS細胞の継代を開始します。区別された領域は、色が濃くまたは白く表示されます。
   注:掻き落とされた細胞凝集体は、ウェルの底に部分的に付着している可能性があります。
3. ウェルの底を口径の広いP1000ピペットで数回洗浄し、ウェルの底に部分的に付着している凝集体を取り除きます。
4. iPS細胞を培養した使用済み培地のうち、剥離したiPS細胞凝集体を含むものは廃棄してください。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄ステップをさらに2回繰り返します。
5. 次に、ウェルあたり 1 mL の 5 U/mL ディスパーゼを添加します。iPS細胞コロニーの縁はウェルプレートから浮き上がり、室温で3〜5分間インキュベートした後、実体顕微鏡で観察することができます。
6. わずかに剥離した凝集体が除去されないようにディスパーゼを慎重に除去し、1 mL の DMEM/F-12 と 15 mM HEPES を添加します。使い捨てのセルリフターを使用して、凝集体を小さなサイズにスライスします。iPS細胞の凝集体の一貫性は、幹細胞継代ツールで改善することができます。
7. スライスしたiPS細胞の凝集体をウェル内の培地で洗い流し、凝集体を含む培地を5 mLの血清ピペットまたは口径の広いP1000を使用して15 mLのコニカルチューブに移します。
8. ウェルをDMEM/F-12で洗浄し、iPS細胞凝集体を含む15 mLチューブに培地を移します。
9. スライスしたiPS細胞凝集体を200 x g で3分間遠心分離します。パスツールガラスピペットで上清を除去し、2 mLのiPSC-SFMを加えて、5 mLの血清ピペットまたは口径の広いP1000を使用してiPS細胞を除去し、再懸濁します。
10. プレコートされたウェルプレートから残った基底膜抽出物を吸引し、6ウェルプレートの各ウェルに1 mLのhiPSC-SFMを加えます。
11. iPS細胞を6ウェルプレートの新しいウェルに移し、最終容量が2 mLになるように、先端径の広いP1000を使用します。iPS細胞株によっては、分割比を最適化する必要があります。ここでは、1:6の分割比を使用しました。
12. 実体顕微鏡下でウェルに浮遊骨材と骨材サイズがないか確認します。理想的には、凝集体のサイズは50〜200μmである必要があります。
13. 凝集体が移されたら、ウェルプレートを旋回させて細胞をプレート全体に均等に分散させ、37°C、5%CO₂ で70〜80%のコンフルエントになるまでインキュベートします。

3. iPS細胞の凍結

1. iPS細胞を凍結して戻すには、上記のように細胞を継代します(プロトコルステップ「2.iPS細胞の継代」)。細胞をコロニーにスライスし、ウェルの底から洗い流した後(ステップ2.10)、スライスした凝集体を200 x g で3分間スピンダウンします。上澄みを吸引する。
2. 6ウェルプレートのウェルあたり1 mLの無血清凍結保存培地を15 mLチューブに加え、先端径の広いP1000を使用してスライスした凝集体を再懸濁します。
3. 細胞を標識済みのクライオチューブに移します。チューブを閉じ、4°Cで事前に冷却した凍結保存容器にチューブを移します。 細胞を-80°Cで24〜48時間保存します。
4. クライオバイアルを液体窒素に移し、長期保存します。
   メモ:OCの区別プロセスの概略図を 図1に示します。

4.胚様体誘導

1. EB誘導のために、上記のように十分なiPS細胞を培養し、増殖させる。
   注:OC産生は、胚様体の数を増やすことでスケールアップすることができ、その結果、造血細胞の全体的な収量が高くなります。70〜80%のコンフルエントiPS細胞の1つのウェルは、6ウェルプレートウェルのウェルあたり約8.4 x 10⁵ 細胞を生成します。12,500個の単一細胞iPS細胞が1つの胚様体を形成するのに必要です。
2. iPS細胞培養液から使用済み培地を吸引し、iPS細胞コロニーをD-PBSで洗い流します。
3. 室温に予熱したシングルセル解離試薬0.5 mLを6ウェルプレートの各ウェルに加え、培養容器を旋回させてウェル表面全体をコーティングします。培養容器を37°Cで5〜8分間インキュベートします。
4. インキュベーターから容器を取り出し、単一細胞解離試薬を吸引し、50 ng/mLのヒト骨形成タンパク質4(hBMP4)、50 ng/mLのヒト血管内皮増殖因子-165(hVEGF)、20 ng/mLのヒト幹細胞因子(hSCF)を含むiPS細胞血清遊離培地からなるステージ1分化培地1 mLをウェルに加えます。 および10μM Y-27632。
5. ステージ1培地でウェルをすすぐことにより、細胞を静かに剥離します。解離したiPS細胞を15mLのコニカルチューブにプールします。
6. ステージ1の分化培地1 mLをウェルに加え、残っている細胞を洗い流すか、簡単に洗い流せないコロニーにはセルスクレーパーを使用します。
7. すべての細胞をチューブに移した後、室温で200 × gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成します。5 mLの血清ピペットまたはボアチップの広いP1000を使用して、合計2 mLの平衡化済みステージ1分化培地に細胞を吸引し、再懸濁します。
8. 血球計算盤または自動細胞計数装置を使用して細胞をカウントします。単一細胞懸濁液を含む15 mLチューブに培地を添加し、1ウェルあたり12,500個の細胞を丸底超低付着96ウェルプレートにステージ1分化培地100 μLで播種します。
   注:顕微鏡下では、細胞はウェル全体に分散した単一細胞懸濁液として現れます。
9. 96ウェルプレートを100 x gで3分間遠心分離します。遠心分離後、細胞は顕微鏡で見るとスフェロイドに似始めるはずです。プレートを37°Cのインキュベーターに24時間置きます。
10. 1日目と2日目に培地の半分をステージ1の分化培地で交換します。効率を向上させるには、マルチチャンネルピペットを使用して、使用済みのステージ1分化培地50 μLをペトリ皿に廃棄します。
11. 96ウェルプレートから培地を廃棄した後、実体顕微鏡で誤って除去された可能性のあるEBがないか確認します。誤って除去したEBを、口径の広いP1000ピペットを使用して96ウェルプレートに移し替えます。
12. マルチチャンネルピペットを使用して、丸底超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに50 μLの新鮮なステージ1分化培地を加えます。

5. 造血分化

1. 造血分化開始の1日前に、6ウェルプレートのウェルに200〜300μg/mLの濃度で1mLの基底膜抽出物をコーティングします。ウェルプレートを4°Cで一晩置きます。
   注:各ウェルは、このプロトコルの後の時点で8つのEBを受け取ります。準備したEBの数に応じて、それに応じてウェルをコーティングします。
2. 2 mM ウルトラグルタミン、55 μM 2-メルカプトエタノール、25 ng/mL ヒトインターロイキン 3(hIL-3)、および100 ng/mL ヒトマクロファージコロニー刺激因子(hM-CSF)を添加した造血基礎培地からなるステージ 2 分化培地 3 mL で、6 ウェルプレートの余分な基底膜抽出物およびプレフィルウェルを吸引します。
3. ボアチップの広いP1000を使用して、8つのEBを6ウェルプレートの各ウェルに移します。移し替え後、目視または実体顕微鏡で、各ウェルに8つのEBがあることを確認します。
   注:1日後、フローティングEBはウェルの底に付着します。次の5〜7日で、造血細胞を含む浮遊細胞集団が見えるようになります。造血分化期間は、7日間から変更することができます。10日間の分化により、大きなCD45⁺、CD14⁺ 、およびCD11b⁺ 亜集団で構成される造血集団が示されました。
4. ステージ2の分化培地で5日間処理した後、使用済みの培地を除去し、50 mLのコニカルチューブに分注することにより、培地交換を行います。ゆっくりとピペットで操作し、浮遊細胞をできるだけ少なくし、せん断応力をできるだけ低く保ちます。実体顕微鏡下でのピペッティングは、細胞の偶発的な除去を防ぐのに役立ちます。
5. ただちに1 mLの新鮮なステージ2分化培地をウェルに加えます。分化プロセスのこの時点ですでに存在する可能性のある浮遊造血細胞を回収するために、分注した培地を廃棄しないでください。むしろ、使用済みの培地でチューブを300 x g で5分間スピンダウンし、上清を吸引します。
6. 新しいステージ2分化培地をチューブに加え、使用済みの培地と一緒に移された可能性のある細胞を剥離するために再懸濁します。
7. 回収した細胞を含む新鮮なステージ2分化培地2 mLを、ステージ2分化培地1 mLで事前に充填した各ウェルに加えます。
8. 造血分化10日目に、浮遊造血細胞が多数存在するか確認する。50mLのチューブに集めて収穫します。10%DMSO、50%FBS、および40%培地で凍結するか、細胞をOCに分化させるためにすぐに使用できます。

6. M-CSFの成熟とOCの分化

1. 200,000細胞/^cm2 の濃度で細胞を組織培養処理ウェルプレートに播種し、10%FBSおよび50ng/mLのhM-CSFを添加したα-MEMで処理します。
2. 機能アッセイまたはイメージングを行うには、播種後3日後に、先端径の広いP1000を用いて、予め温めたPBSで37°Cに洗浄することにより、M-CSF成熟細胞を剥離します。細胞を完全に剥離するには、洗浄ステップを繰り返す必要がある場合があります。
3. 分離した細胞を、口径の広いP1000を使用して15 mLチューブに移し、300 x g で5分間遠心分離します。上澄みを捨てます。
4. 細胞ペレットを、10% FBS、50 ng/mL hM-CSF、および80 ng/mL hRANKLを添加したα-MEMからなるOC分化培地で再懸濁し、溶解します。血球計算盤または自動細胞計数装置を使用して細胞をカウントし、M-CSF成熟細胞を200,00-250,000細胞/^cm2 の密度で機能アッセイまたはイメージング用の適切な培養器装(すなわち、骨吸収アッセイ、イメージング用のカバースリップスライドなど)に再播種します。
5. OC分化培地で7〜9日間分化します。2〜3日ごとに新鮮なOC分化培地で完全なウェル培地交換を行います。
   注:多核OCは通常、5〜7日後に現れます。

Results

分化プロセス全体にわたる細胞形態のモニタリング
以下に説明するすべての結果は、OC鑑別のためにMCND-TENS2 iPS細胞株を使用して生成されました。このiPS細胞株は、これまでにいくつかの研究で使用されてきた^32,33。それにもかかわらず、他のiPS細胞株もこの分化プロトコルでうまく使用されています。

定期的な目視評価により、iPS細胞からOCへの分化プロセス全体を通じて、iPS細胞の異なる明確な形態学的特徴が明らかになります(図2)。iPS細胞コロニー(図2A)は、遠心分離前に丸底ウェルプレート全体に個々の細胞として現れる単一細胞懸濁液に解離しました(図2B)。遠心分離(プロトコルのステップ4.9)に続いて、細胞は丸底の超低付着ウェルプレートの中心に集まり、続いて球体を形成します(胚様体、EB、 図2C)。EBは、中胚葉の分化過程を通じて2〜3倍のサイズに増加し(図2D)、4日間の分化期間の終わりには目に見えやすくなります(図2E)。EBは、造血分化のために6ウェルプレートのウェルに移した後、ウェルプレートの底部に付着して融合しているのが見られます(プロトコルのステップ5.3、 図2F)。7〜8日後、大量の浮遊造血細胞が培地中に見えるようになります(図2G)。造血細胞を採取して再播種した後、M-CSF成熟期が続き、OC分化が開始されます(プロトコルのステップ6.4)。5〜6日以内に、大きな透明な細胞体を持つ多核細胞が最初に見えるようになります(図2H)。この段階では、まだ多数の単核細胞が見られます。OC分化のさらに2〜3日後、OCは隣接する細胞とさらに融合し、さらに多くの核を持つ大きなポリカリオンを形成します(図2I)。

EB由来造血集団の評価
造血分化は、可変時間にわたって行うことができる。7日から9週間までの期間が文献に記載されています。.このプロトコルでは、造血分化は10日間行われます。10日間の造血分化では、初期のCD34⁺ の数が少なく(0.53%、 図3A)、中期期のCD43⁺ の造血前駆細胞の数が多い(48.5%、 図3B)ことがわかった。さらに重要なことに、10日間の処理期間後に十分な量のCD45⁺ (96.2%、 図3C)、CD14⁺ (33%、 図3D)、およびCD11b⁺ (35.9%、 図3E)のHPCが生成され、それらをOCにさらに分化させることに成功しました。ただし、造血分化のためのサイトカイン処理期間(プロトコルのステップ5.4)は、十分な量のCD45⁺、CD14⁺、およびCD11b⁺ 細胞を生成するために、iPS細胞株に基づいて調整および最適化する必要がある場合があります。

平均して、600万個の造血細胞が、8つのEBで各ウェルから10日間の分化後に回収されました。

OCの形態と活性の評価
OCの分化後、OCは形態学的および機能的に評価できます。OC前駆体は、TRAPまたはカテプシンKの染色時の画質を向上させるために、M-CSF成熟ステップに続いてチャンバースライドまたはカバースリップスライドに再播種されます。さらに、わずかにTRAP陽性の単核細胞が多核OCの間に散在しているのが見られます。RANKLを添加していないネガティブコントロールは、融合した多核OCを表示しません。それにもかかわらず、少数のわずかにTRAP陽性の単核細胞を描写することができます(図4B)。

共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)画像は、カテプシンK(ターコイズ)とF-アクチン(赤)をDAPI核染色(青)と組み合わせて染色したOCを示しています(図4C、4D)。広範なF-アクチン細胞骨格構造とカテプシンKの染色陽性を示すプロトコルに従ってRANKLで処理すると、大きな多核OCが見られます(図4C)。一方、RANKLを添加していないネガティブコントロールでは、融合した多核細胞は見られません。

OCは、吸収活性を測定することにより、さらに機能的に評価することができます。骨またはミネラル吸収アッセイを使用して、吸収活性を決定できます。ここでは、OC前駆体をリン酸カルシウムでコーティングしたウェルに播種し、末端分化しました。鉱物コーティングが再吸収された広い領域は、青みがかった灰色で見えます(図4E)。異なるサイズの吸収ピットを識別できます。再吸収されていない残りのリン酸カルシウムコーティングは茶色で見えます。吸収ピットの存在は、分化した多核細胞がOCであることを裏付ける。さらに、吸収活性を評価および比較するために、吸収ピットをさらに定量化できます。坑井の総表面積に対する再吸収鉱物の総面積は、パーセンテージの尺度として定量化できます。さらに、吸収ピットのサイズと数をさらに定量化できます。未処理のネガティブコントロールでは、吸収ピットは示されませんでした(図4F)。

図1:ヒトiPS細胞からの破骨細胞の分化過程の模式図。 Hannah BlümkeがAffinity Designer 2.1.1を使用して描いたイラスト。この図は、以前に使用された図面³³を利用している。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:ヒトiPS細胞から破骨細胞への分化過程における顕微鏡画像。 (A)増殖中の未分化iPS細胞コロニー。(B)遠心分離前の単一細胞懸濁液に解離した後の丸底ウェル中のiPS細胞。(C)遠心分離後に一元的に採取された単一細胞iPS細胞。(D)EBは、4日間の中胚葉分化期間を通じてサイズが大きくなります。(E)中胚葉分化後の目に見える胚様体。(F)基底膜抽出物でコーティングされた6ウェルプレートに胚様体が移された後、胚様体がウェル底部に付着し、融合しているのが見える。(g)造血分化の5〜7日後、培地中に多数の浮遊造血細胞が観察され得る。(H)M-CSFの成熟後、3〜4個の核を持つ最初の破骨細胞は、RANKLとの分化の5〜7日後に現れます。(I)破骨細胞の分化の終わりには、大きな多核細胞が観察されます。スケールバー:A、D、F、G = 200 μm、B、C、H、I = 50 μm、E = 1 mm。 この 図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:フローサイトメトリーを用いた胚様体由来造血細胞の表面マーカー解析。 マーカー発現により、造血細胞の解析や、シングレットおよび生細胞のゲーティング後の亜集団の同定が可能になります。(A)個体発生学的に早いCD34⁺ のhematopoietic前駆細胞の人口はこのプロトコルと共に不在に非常に小さい。(B)CD43⁺ 細胞は全人口の約50%を占める。(C)後期のCD45⁺ 造血前駆細胞は、造血集団の96.2%と最も大きな部分を占めています。(D、E)より直接的なCD14⁺ およびCD11b⁺ OC前駆体は、それぞれ33%および36%を構成する。赤:未染色のネガティブコントロール、青:アイソタイプコントロール、黄色:それぞれのマーカー抗体で染色された細胞。プロットは、以前に公開されたデータ³³を使用します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:iPS細胞分化型ヒト破骨細胞の形態学的および機能的評価。 (A)破骨細胞分化後のTRAP染色では、大きな多核のTRAP陽性破骨細胞が見られます。わずかにTRAP陽性の単核細胞が、多核破骨細胞の間に散在しているのが見られます。(B)TRAP用に染色したRANKLを添加しないネガティブコントロールでは、融合した多核破骨細胞は示されません。それにもかかわらず、少数のわずかにTRAP陽性の単核細胞を描写することができる。(C)破骨細胞分化化細胞の共焦点レーザー走査型顕微鏡画像は、F-アクチン(赤)およびカテプシンK(ターコイズ)をDAPI核染色(青)と組み合わせて染色したカバーガラススライド上に、大きな多核カテプシンK陽性破骨細胞を示しています。(D)RANKLを添加しないネガティブコントロールは、(B)細胞密度の低い単核細胞と類似している。(E)機能評価は、破骨細胞の吸収活性を評価することにより行うことができる。このために、破骨細胞の分化は骨またはミネラル吸収アッセイで行われます。位相差モードの倒立広視野顕微鏡で取得したタイルウェル画像は、リン酸カルシウム鉱物層の大きな吸収領域を描写します。吸収活性は、総面積にわたる吸収面積を測定することによってさらに定量化することができる。(F)RANKLを添加していないネガティブコントロールでは、吸収領域は示されません。スケールバー:A、B = 100 μm、C、D = 50 μm、E、F = 1 mm。画像は、以前に公開されたデータ³³から編集されている。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコールは、iPS細胞をOCに鑑別するための信頼性が高く堅牢な方法を提供します。それにもかかわらず、差別化プロセス全体で遭遇する可能性のあるいくつかの落とし穴があります。異なる組織起源の細胞から作製されたヒトiPS細胞株は、このプロトコルを用いて分化することに成功している³³。iPS細胞を凍結する場合(プロトコルステップ「3.凍結バックiPS細胞」)、継代を終えた時点で1つのウェルを凍結し、1つのクライオバイアルに戻しました。解凍時(プロトコルステップ「1」を参照。Thawing and propagation of human iPSs")では、1つのクライオバイアルを6ウェルプレートの1つのウェルに融解しました。iPS細胞株が異なれば、挙動も微妙に異なり、増殖速度も異なります。分割レートはそれに応じて調整する必要があります。

iPS細胞を継代したり、iPS細胞を解離してEB誘導を行う際には、中胚葉分化や造血器分化の有効性と効率を向上させるために、自然分化したコロニーや死細胞の凝集体を除去することが重要です。これは、細胞スクレーパー、P10またはP20ピペットのピペットチップ、またはパスツールピペット³⁵から構築されたスクレイピングツールを使用して、実体顕微鏡下で行うことができます。

前述したように、このプロトコルでは、iPS細胞コロニーを単一細胞懸濁液に解離させてEB誘導を行うが、他のプロトコルでは、iPS細胞を凝集体として残し、EB誘導のために遠心分離する³⁶。EBのサイズ、細胞数、形状、および形態はすべて、分化に影響を与えることが報告されています^37,38,39。したがって、単一細胞懸濁液への解離により、遠心分離後のサイズと形状のEB-to-EBの均一性が向上し、その結果、造血細胞産生のより一貫した結果が得られるという仮説を立てています³¹。

EB誘導のための他の方法が記載されている。細胞の生存率を改善するためにROCK阻害剤と組み合わせて単一細胞懸濁液を使用するこのような方法は、EBサイズおよび分化転帰の制御において有利であることが報告されている³¹。

このプロトコルに記載されている丸底96ウェルプレートEB誘導法は、EBの大規模生産に適しており、OC生産のアップスケーリングを可能にします。分化過程を促進する可能性のある胚様体誘導ステップを伴わない造血器分化のためのより新しい方法が最近報告されている³²。それにもかかわらず、これらのプロトコルはOCの分化のためにまだ確立されていない³³。

上記のプロトコルでは、造血分化の5日目の培地の変化について説明します。少数の浮遊細胞は、分化の4〜5日目頃にすでに出現している可能性があります。浮遊細胞の廃棄を避けるために、培地をチューブに集め、遠心分離してから廃棄する必要があります。次に、チューブの底にある細胞ペレットを新鮮な培地と一緒に取り除き、6ウェルプレートのウェルに戻す必要があります。しかし、OC分化における初期の浮遊細胞集団の重要性は、まだ決定される必要がある。

造血細胞の産生は、フローサイトメトリーを用いて評価することができる。破骨細胞の分化には、CD45⁺、CD14⁺、CD11b⁺細胞の高収量が望ましい³³。採取された浮遊造血細胞の凍結保存は、一般的に回収率が限られており、細胞生存率が低いため、困難であることが報告されています^40,41。無血清造血細胞増殖培地(資料表参照)、FBS40%、DMSO10%からなる凍結保存培地中で造血細胞を凍結保存することにより、融解後の細胞生存率約90.3%±2.62SD(n=7)の細胞を回収することができました。

破骨細胞形成には、複数の単核OC前駆体を融合させて、ミネラルと骨の吸収が可能な多核破骨細胞を形成する必要があります。マウスOC前駆細胞株は、OC形成を誘導するためにRANKLを添加するだけで済むが⁴²、ヒト前駆体は細胞の生存と増殖のために追加のM-CSFを必要とする⁴³。OSCARは、これまでリガンドとして同定されていたのはI型コラーゲンのみであるにもかかわらず、OCの分化に関与する追加の受容体として最近発見されました。iPS細胞由来OCを用いたOSCARの研究はまだ限られているが、マウス細胞株における超生理学的 in vitro RANKLおよびM-CSF濃度は、OSCAR活性化の必要性を迂回しているようである⁴⁴が、 in vivo でのOSCARの活性化は破骨細胞形成に必要な共刺激シグナルであるようである⁴⁵。考慮する必要がある追加の要因は、ウェルプレートの表面です。化学的⁴⁶および物理的⁴⁷ の表面特性は、破骨細胞の分化に影響を及ぼすことが知られており、分化の成功を促進または妨げ得る。CD47やDC-STAMPなどの異なる融合関連因子が破骨細胞融合の異なる段階で作用するため、前駆体集団内の特定の不均一性もOCの融合を成功させるために重要であるように思われる⁴⁸。

結論として、このプロトコルは、ヒトOCとiPS細胞の鑑別を可能にし、OC研究を促進および加速します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-メルカプトエタノール	Sigma Aldrich	M6250-10ML
抗体 - 抗カテプシン K	Abcam	ab19027
抗体 - APC-conjugated Anti-Human CD45	BD	555485
抗体 - APC-conjugated Mouse IgG1, κIsotype Control	BD	555751
抗体 - BV711-conjugated Anti-Human CD14	BD	563372
抗体 - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κIsotype Control	BD	563125
抗体 - Goat Anti-Rabbit IgG H&L アレクサ フルオラ®647	Abcam	ab150079
抗体 - PE-conjugated Anti-Human CD14	R&D Systems	FAB3832P-025
抗体 - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b	R&D Systems	FAB16991P-025
抗体 - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34	BD	560710
抗体 - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κIsotype Control	BD	557872
抗体 - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b	Biolegend	301308
抗体 - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κIsotype Ctrl	Biolegend	400118
抗体 - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κIsotype Control	BD	550795
抗体 - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43	BD	563521
Bone Resorption Assay Kit	CosmoBioUSA	CSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher	16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&Dシステム	3434-010-02	基底膜抽出物
DAPI	R&D Systems	5748/10
Dispase (5 U/mL)	STEMCELL Technologies	7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Stem Cell	36254
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
DPBS	Sigma Aldrich	D8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)	STEMCELL Technologies	78211
ヒトIL-3	STEMCELL Technologies	78146.1
ヒトマクロファージコロニー刺激因子(hM-CSF)	STEMCELL Technologies	78150.1
ヒト可溶性受容体核因子活性化因子-κB Ligand (hsRANKL)	STEMCELL Technologies	78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF)	STEMCELL Technologies	78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)	Biolegend	422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165)	STEMCELL Technologies	78073
Invitrogen Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
MEM &α;、ヌクレオシド、フェノールレッドなし	ThermoFisher	41061029
mFreSR	STEMCELL Technologies	05855	無血清凍結保存培地
mTeSR Plus 培地	STEMCELL Technologies	100-0276	ヒトiPSC無血清培地 (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-shapeped-Bottomマイクロプレート	Thermo Scientific	174925	丸底超低アタッチメント 96ウェルプレート
P1000 ワイドボアチップ	ThermoFisher	2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632	STEMCELL Technologies	72304
StemSpan SFEM	StemCell	09650	造血細胞培養培地
TrypLE Select Enzyme (1X)、フェノールレッド不使用	Thermo Fisher	12563011	シングルセル解離試薬
ウルトラグルタミン	バイオサイエンス ロンザ	BE17-605E/U1
X-VIVO 15 無血清造血細胞培地	バイオサイエンス ロンザ	04-418Q	造血基礎培地
µ-スライド 8 ウェル ハイ	同上	80806