方法論記事

マウス手術モデルにおける拡張78%肝切除術

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DOI：

10.3791/66528

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2024年5月24日

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1Division of Vascular and Endovascular Surgery and the Center for Vascular Biology Research, Department of Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2The Transplant Institute and the Division of Nephrology, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School

この記事について

サマリー

部分的な2/3(66%)肝切除術のマウスモデルは文献でよく説明されていますが、肝移植後のスモールフォーサイズ症候群を模倣したより広範な肝切除術はほとんど使用されていません。マウスモデルにおける拡張78%肝切除術手順について説明し、健康なマウスで術後致死率が約50%になります。

要約

マウスの部分的な2/3肝切除術は、肝臓の再生能力を研究し、多くの疾患モデルにおける肝臓切除の結果を調査するための研究で使用されています。マウスの古典的な部分的な 2/3 肝切除術では、5 つの肝葉のうち 2 つ、つまり肝臓質量の約 66% を占める左葉と正中葉が 一括 で切除され、術後生存率は 100% と予想されます。より積極的な部分肝切除術は技術的により困難であるため、マウスではほとんど使用されていません。当グループでは、左上葉、正中葉、右上葉を含む5つの肝葉のうち3つを別々に切除し、肝臓全体の約78%を切除する拡張肝切除術のマウスモデルを開発しました。この拡張切除は、他の点では健康なマウスでは、常に適切でタイムリーな再生を維持できるとは限らない残存肝臓を残します。再生に失敗すると、劇症肝不全により、最終的に術後 1 週間以内に 50% の致死率が得られます。マウスにおける拡張78%肝切除術のこの手順は、スモール・フォー・サイズ症候群の研究と、肝臓移植または癌の拡張肝切除の設定における肝臓再生と転帰を改善するための治療戦略の評価のためのユニークな手術モデルを表しています。

概要

1931年に初めて報告されたマウスおよびラットの外科的肝臓切除モデルは、肝臓再生の分子基盤を研究するために利用される最も一般的な実験モデルです。また、トランスレーショナルサイエンス研究において、長期にわたる肝切除術や最適でない肝移植片の移植後の転帰を改善するための戦略を試験し、開発するための有用性も期待できます1,2,3,4。マウスの部分肝切除術 (PH) では、総肝臓量 (TLM) の約 2/3 (66%) の除去が必要ですが、健康な動物で実施すると、優れた結果が得られます5。この手順は期間が短く、マウスの肝臓の解剖学的構造にほとんどばらつきがないため、簡単に再現でき、術後の生存率は通常100%に近くなります1。

左葉(LL)と正中葉(ML)の切除を含む部分的な2/3肝切除術は、葉の炎症や肝臓の流入と流出の制限によって比較的妨げられることなく、残存葉を再生することを可能にします。むしろ、PH後の肝臓の正弦波内皮細胞の門脈の流れとそれに続くせん断ストレスの増加は、内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)の発現の持続的なアップレギュレーションとそれに続く一酸化窒素(NO)の放出をもたらし、これは増殖と肝臓再生のための肝細胞のプライミングに貢献します3。非アルコール性脂肪性肝疾患などの疾患モデルや特定の遺伝的背景で 2/3 PH 後に一般的に研究される結果には、急性肝不全のリスク、肝臓再生能力の定性的および定量的測定、およびストレスや外傷に対するその他の生物学的反応が含まれます 1,3。

しかし、機能的または解剖学的に小さなサイズの症候群を模倣したマウスモデルは、癌に対する長期の肝臓切除、または辺縁(脂肪症または長期の虚血時間)または部分的(分割または生体ドナーの肝臓からの)移植後に発生するため、まだ十分に確立されていません。このニーズに対処するには、最小の(および機能的な)肝臓腫瘤の維持を超えて拡張するより広範な肝臓切除のモデルが必要であり、これは、サイズに対して小さい肝臓症候群と、この症候群に関連する死亡率の上昇をモデル化する必要があります6,7。

マウスの肝臓の解剖学的構造は、最小限のばらつきを示します。マウスの肝臓は5つの葉から構成され、それぞれが肝臓の総質量に占める割合は、左葉(LL;34.4 ± 1.9%)、中央葉(ML;26.2 ± 1.9%)、右上葉(右上葉とも呼ばれる)葉(RUL;16.6 ± 1.4%)、右下葉(右下葉とも呼ばれる)14.7 ± 1.4±%)です。5.各葉は、肝動脈の枝、門脈の枝、および胆管5を含む門脈トライアドによって供給される。歴史的に、LLとMLを切除することにより2/3 PHを実行するいくつかの手法が説明されていました。これらには、1)切除された各葉の基部に単一の結紮糸を一括して配置する古典的な技術が含まれます。2)切除された葉の基部に適用されるチタンクリップを使用する止血クリップ技術。3)クランプの近位にピアス縫合糸を使用する血管指向の実質保存技術。4) 門脈と肝動脈の枝が葉切除術1 の前に結紮される血管指向の顕微手術技術。各手法には相対的な長所と短所がありますが、致死率が高いものはありません1,8,9。

この研究では、マウスで78%PHを延長するための新しい方法を紹介します。このモデルでは、LL、ML、RULを含む5つの肝葉のうち3つが、結紮糸法を使用して別々に除去されます(図1)。この手順により、全肝臓量の約78%(77.2±5.2%)が切除されます。LLとMLを別々に除去するという私たちの選択は、古典的なPH技術のように「一括」ではなく、これら2つの葉の一括切除に関連する合併症を最小限に抑えます。たとえば、肝上大静脈狭窄や、単一の結紮糸が大静脈1に近すぎると残りの葉の壊死のリスクが高まります。10、11、12、13、14。これは、RULを削除する手順の最終ステップに進む前に重要です。8-12週齢の野生型C57BL/6マウスにおけるこの広範な肝切除術は、肝臓再生の失敗により、手術後1週間以内に50%の致死率を引き起こし、劇症肝不全を引き起こします15,16。このマウスモデルは、78%の肝切除術を延長した後の致死率の上昇を示しており、スモール・フォー・サイズ症候群の病態生理を適切に再現し、転帰を改善するための新しい戦略の開発と試験を可能にします。

プロトコル

この手順プロトコルに記載されている方法は、ベスイスラエルディーコネスメディカルセンター(BIDMC)の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。すべての実験は、IACUCおよびBIDMC動物研究施設ガイドラインに準拠して完了しました。

1. マウス術前準備

  1. マウスの腹部を胸骨中央部から恥骨上部までバリカンで剃ります。
  2. 100%酸素中の1〜4%イソフルランで全身麻酔を誘発します。麻酔をかけたら、マウスを仰臥位にして手術野に置き、その下に加熱パッドを付けます。切開を行う前に、つま先をしっかりとつまんで、ペダル反射がないことを確認します(存在する場合、動物は反応します)。全身麻酔の状態を達成するために、必要に応じて麻酔レベルを調整します。
    注:適切な全身麻酔を維持するために、必要に応じてイソフルランを滴定します。.
  3. 術後鎮痛のために1.2 mg / kgのブプレノルフィン徐放性(ER)を皮下投与します。.マウスを仰臥位にして前肢と後肢を伸ばし、手足をテープで固定します。次に、手術用の滅菌フィールドを準備します。
    注意: 呼吸が妨げられないように、固定されているときは前肢がリラックスしていることを確認してください。
  4. 温かい滅菌生理食塩水とベタジン綿棒で腹部を各綿棒を交互に3回準備します。腹部を無菌的にドレープします。

2.肝切除術

  1. メスを使用して、剣状突起から恥骨上領域までの皮膚を縦正中線開腹切開術にします。次に、鋭利なハサミでリネアアルバを切開して腹腔に入り、この切開部を皮膚切開の長さまで延長します。
    注:最初に、肝臓が腹壁に深くある剣状突起下領域でリネアアルバを切開して、下にある腸の損傷を防ぐ方が安全です。
  2. 適切なリトラクターを使用して腹壁を横方向に引っ込めます。次に、剣状突起を止血器で固定し、胸骨を上方向に引っ込めて肝臓を露出させます。
  3. 肝臓を下方向に引っ込めて鎌状靭帯を露出させ、次に鋭利なハサミを使用して肝臓の長さに沿って靭帯を横断します。肝臓を胸部に向かって上方に引っ込めて、肝胃靭帯と肝内葉靭帯を露出させ、鋭利なマイクロハサミを使用してこれらの構造を横断します。
    注:グリッソンのカプセルでカプセル化された肝臓は非常に壊れやすく、打撲傷や裂傷がしやすいため、収縮は湿った綿の先端のアプリケーターで非常に穏やかに行う必要があります。
  4. 左ローブを元の解剖学的位置に保ちながら、中央ローブを上方向に引っ込めます。LLの上内側部分に5-0シルク縫合糸を巻き付け、LLを胸部に向けて上向きに反射させて葉の下面を露出させ、葉の基部で縫合糸の端をまとめ、縫合糸を基部で結びます。縫合糸を結紐してLLを結紮する前に、縫合糸が下大静脈(IVC)または門脈の血流を妨げないことを確認してください。
    注:この縫合糸は、LLが胸部に向かって上向きに反射しているときに結束し、結紮中にポータルトライアドが十分に露出するようにするのが最善です。これにより、隣接する構造を損なうことなく、基部に近い葉の切除が容易になります。
  5. 鋭利なハサミを使用して縫合糸のタイのすぐ遠位にあるLLを切除し、組織の小さなカフ(~2 mm)が切除された葉の端から縫合糸を分離することを確認します。止血を確認します。
  6. 中央葉を胸部に向かって上向きに反射させ、MLの基部の周りに5-0のシルク縫合糸を配置し、MLを元の解剖学的位置に戻します。縫合糸の端をMLの上面の基部に近似し、葉の基部でそれらを結びます。結紮されたMLを切除し、縫合タイの周りに残存組織の小さなカフを残します。止血を確認します。
  7. 肝臓を右から左に動員して右上葉と下葉を露出させ、これらの葉を内側と下に注意深く反映させます。RULの上内側面に5-0縫合糸を巻き付けて、縫合糸がRUL基部を取り囲むようにし、次にRULを胸部に向けて反射させます。縫合糸をRULの下に巻き付け、端をその基部近くに結び付けてから、縫合糸の結束の周りに残りの組織の小さな袖口を残して切除します。
    注: RUL の基部で近位に結びすぎると、RLL への血液供給が損なわれ、RLL の虚血を引き起こし、術後 24 時間以内にマウスが死亡する可能性があります。対照的に、RUL基部から遠位に結びすぎると、肝臓腫瘤の切除量が減少し、それによって術後生存率が予想以上に増加します。
  8. 残りの肝臓を安静時の解剖学的位置に戻して、止血を確保します。必要に応じて、切除した肝縁の軽度の出血の領域にガーゼで圧力をかけます。.
  9. 5-0ポリグラクチン縫合糸を使用して、正中線腹壁(筋膜と筋肉層)を中断なく閉じます。ステープルまたは5-0モノフィラメント縫合糸で皮膚切開を閉じます。
  10. 麻酔を中止し、マウスが意識を取り戻し、正常に歩行できるようになるまでマウスを監視します。

3. 術後ケア

  1. 術後にマウスを観察して、適切な回復(つまり、マウスが目を覚まし、警戒し、ケージ内で歩行している)と痛みのコントロールを確認します。マウスは、手術後6時間まで2時間ごとに、その後は毎日検査します。
    注: 術後、マウスはケージ内でゆっくりと動くことが予想されます。マウスは、他のマウスから隔離されたケージで回復し、完全に回復したときにのみ他のマウスの会社に戻る必要があります。
  2. マウスが感覚不良の液体または手術による過度の失血により血液量減少になった場合は、温めた生理食塩水注射(0.1-1.0 mL、皮下または腹腔内)を投与します。.

結果

78% の延長肝切除術が成功すると、8 週齢16 週齢の健康な成体マウスで 1 週間以内に 50% の死亡率が誘発されると予想されます。適切に実施されれば、最小限の失血が期待されます。持続する残留出血は、手動圧力で制御できます。手術後24時間以内の周術期死亡は、多くの場合、技術的なエラーによって引き起こされます。技術的な失敗には、大きな血管への不注意な損傷が含まれ、難治性の術中出血を引き起こします。術後の重大な出血は、多くの場合、切除された肝縁からの残留出血によるものです。隣接する門脈トライアド、門脈、またはIVCの不注意による結紮などの周囲の構造への損傷;RULの結紮に続発するRLLの虚血は、ローブ基部に近すぎる。全身麻酔による合併症。肝不全の兆候には、進行性の嗜眠、髪の毛の凝集、食欲不振、低血糖症などがあり、手術後24時間以内に明らかになることがよくあります。

78%の肝切除術を延長した後に期待される2つの結果は、生存または死亡のいずれかです。最初のシナリオでは、マウスは手術後に適切に回復し、72時間以内に通常の活動を再開し、7日を超えて生存します。術後9〜10日で行われた開腹術は、手術前の肝臓量4,16,17,18の完全な回復を示しています。2番目の結果は、術後2〜7日以内の死亡率です。マウスは、手術後最初の12時間で回復の最初の兆候を示すことがありますが、劇症肝不全の発症により、その後比較的急速に悪化します16。マウスは、ストレス、体重減少、および死ぬまで進行性の無気力の兆候を示します。予期せぬ結果の例としては、技術的な合併症による死亡や、78%の肝切除術を延長した後のマウスの生存率が50%をはるかに上回るまたは下回るなどがあります。

私たちの研究室は、この拡張された78%肝切除術の先駆者であり、8週齢の健康なBALB/cマウスで78%の肝切除術を延長すると50%の致死率が得られることを示す以前の論文でその有用性を検証しました。これは、マウスの肝臓がA20(腫瘍壊死因子誘導タンパク質3[TNFAIP3])を発現するように事前に操作されていれば、組換えアデノウイルス16を使用して静脈内投与され、廃止される可能性があります。Longoらによるこの研究では、健康なBALB/cマウスは、ヒトA20(rAd.A20)または対照β-ガラクトシダーゼ(rAd.βGal)を発現する組換えアデノウイルスベクターの投与後5日で78%の肝切除術を受けました。追加の未治療対照群も含まれていました。78%の肝切除術後、Longoらは、未治療のマウス12匹のうち6匹(50%)が手術を生き残ったことを観察しました(図2)16。

習熟度の 2 つの決定要因には、1) 上記のように、RLL虚血が早期死亡を引き起こすという技術的な合併症を制限すること、2) RULの十分な動員を確保すること、それなしではRULの全サイズを理解できず、したがって、RULを適切に切除できないことが含まれます。これにより、切除される肝臓の量が減少するため、全生存率は予想の50%をはるかに上回って改善されます。研究者/著者のトレーニングの初期期間では、11〜21週齢の健康な成人男性および雌のCD1およびC57BL / 6マウス15匹中10匹(67%)が、78%肝切除術後1週間生存しました(3人の技術的死亡を除く)(表1)19,20,21。推定パーセント肝切除術で測定されるRUL動員を改善し、適切な切除を促進するためのマウス肝臓解剖学の理解の文脈でのさらなるトレーニングは、78%肝切除術後に予想される50%の生存率を達成するために不可欠でした。技術的熟練度が完全に達成されたと感じた後、16匹中8匹のマウス(50%、1人の技術的死亡を除く)が78%の肝切除術後に1週間生存した。

ラット肝臓の解剖学図;実験的肝葉除去のための外科的結紮ポイント。
図1:マウス肝切除術のポジショニングと肝臓の解剖学 (左)開腹術と拡張78%肝切除術のためのマウスのポジショニングの視覚的表現。マウスは仰臥位で描かれており、正中線開腹切開術が施されています。(右)下から描かれたマウスの肝臓の解剖学的構造と、切除部位を描写する色付きの線。左葉、正中葉、および右上葉は、基部での縫合結紮に続いて順次切除されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

78% 肝切除生存率グラフ。NI、rAdを比較します。A20、rAd。術後日数は β ガロンです。
図2:A20を過剰発現するように操作されたマウスの拡張(78%)肝切除術後の生存優位性。 未治療(非感染NI)、rAd.βGal、およびrAd.A20で治療されたマウスのコントロールにおける78%の拡張肝切除術後の生存データ。マウス肝臓におけるA20の過剰発現は、NI(50%)およびrAd.βGalコントロール(13%)(n = 12マウス/グループ)と比較して有意な生存優位性をもたらしました。この図はLongo et al.16からのものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

生き残った死者技術的な失敗トータル推定% 肝切除術生存率
プレ・プリ・プリシチュエンシー10531868±3.9%10/15 (66%)
ポスト・プロフィシエンシー8811779±2.4%8/16 (50%)

表1:拡張78%の肝切除術トレーニング結果。 11〜21週齢の健康な成人CD1およびC57BL / 6マウスにおける78%肝切除術の延長後1週間以内の生存結果。技術的習熟度は、技術的成功の観察可能な改善と、推定肝切除術率 (平均 ± SEM) によって計算された右上葉の適切な切除によって自己決定されました。

ディスカッション

マウスで50%の致死率を引き起こす拡張78%肝切除術を成功させるには、各肝葉を正確に切除することが重要です。このレベルの能力と精度は、手順を繰り返し実行することによってのみ達成できます。トレーニング曲線はオペレーターによって異なりますが、通常は3〜6か月の練習が必要です。TLMの78%未満を切除する肝臓切除は生存率が高く、TLMの78%以上を切除する肝臓切除は致死率が高くなります。各葉切除は、同じ程度ではありませんが、困難です。

左葉は最も確実に切除するのが簡単です。LL基部は狭く、上向きに反射すると、オペレーターは肝臓基部を簡単に識別し、毎回ほぼ同じ葉切除量で縫合糸を同じ位置に結ぶことができます。中央ローブは、LLおよびRULと比較した場合、最も広いベースを持っています。したがって、オペレーターは、ローブを切除する前に、縫合糸を配置する必要がある場所を慎重に推定し、MLの基部で縫合糸の端を慎重に近似する必要があります。MLが近位に結びすぎると、縫合糸が静脈肝ドレナージを損なったり、IVCから心臓への血液の戻りを妨げたりする可能性があります。MLが遠位に結びすぎると、肝臓の質量が不十分になり、ML基部が広くなるため、切除断端での出血のリスクが高まります。右上葉は、おそらく最も確実に切除するのが難しいです。腹腔内の後方にある RUL の解剖学的位置により、縫合糸をその基部に完全に巻き付けることが困難になり、この葉の切除が不完全になる可能性があります。対照的に、縫合糸がRUL基部で近位に結び付けられすぎると、右下葉への血液供給が危険にさらされ、このRLLの虚血を引き起こし、術後死亡の可能性が高まる可能性があります。

手順関連のリスクを最小限に抑えるための他の重要な要素には、毒性を減らすための全身麻酔(イソフルランなど)の最小化、および術後出血を制限するための各葉切除後の適切な止血の確保が含まれます。これは、拡張78%肝切除術は、成人の8-12週齢マウスで好ましく行われることを考慮することが重要です、なぜなら、高齢のマウスは、そのより大きな体重と再生肝容量の減少のために生存率のより多くの変動を示すことができますが、若いマウスは、肝臓のサイズが小さく、麻酔関連の合併症の割合が高いため、より大きな技術的合併症に苦しむ可能性があります。78%の肝切除術後に観察された50%の致死率は、個々の動物間の総肝臓質量に対する各肝葉質量の相対的な割合の微妙な解剖学的変動に関連する固有の単一マウス特性に対応すると推測します。マウスの78%の肝切除術は、動物の50%だけがタイムリーかつ成功裏に再生して生き残ることができ、残りの50%は再生に失敗して死亡するという解剖学的閾値を表しています。また、肝臓操作の微妙な違いが、異なる程度の肝臓障害と関連している可能性があることも認識しており、したがって、この微妙なバランスを再生の失敗と死に傾けている可能性があります22。

とはいえ、最も制限的な要因は、外科的処置自体の習得であり、それは練習によってのみ得られるものです。各肝葉の基部にある縫合糸の正確なマッピングを通じて再現性のある結果を確保するためには、実践が不可欠です。注意点の1つは、マウスの肝臓の解剖学的構造の個々のバリエーション(まれですが)には、技術の変更が必要な場合があるということです。成功を改善するためにケースバイケースで考慮すべき他の介入には、高い感知性体液の損失または重大な出血の場合の通常の生理食塩水ボーラスの投与、および出血が持続する場合の肝臓縁での長時間の手動圧力または電気焼灼が含まれます。

要約すると、マウスモデルにおける78%の肝切除術は、トランスレーショナルサイエンス研究にとって貴重な技術です。この手順に関連する技術的に成功した結果を達成するためには、広範なトレーニングが重要です。マウスは、扱いやすく比較的安価な好まれる小動物種であるだけでなく、遺伝子組み換え系統(トランスジェニック、ノックアウト(KO)、細胞型特異的、条件付きKO)の数が増え続けていることに加えて、よく研究された多くの近交系でも入手可能であり、優れた機構研究を可能にしています3,9,23。.遺伝子組み換えマウスに加えて、肝臓切除後の生存および転帰に影響を与えることが知られている非アルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変、および糖尿病を含む様々な病状が、マウス24、25、26、27、28、29、30、31において容易に誘発され得る。

先に述べたように、古典的な2/3 PHは依然として非常に価値がありますが、肝臓の塊が解剖学的または機能的に不十分な場合(脂肪肝など)に、癌または肝移植後の小体症候群に対する拡張肝切除に関連する高い致死性を再現していません7,32,33,34 .適切に実施された場合、この拡張された78%の肝切除術は、外傷または癌のための広範な肝臓切除後の臨床的現実をよりよく反映し、限界肝移植片の移植後の小サイズ症候群の文脈で、また重度の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)または肝硬変16の患者の単なる肝臓手術後、32.このマウスモデルは、これらすべての条件で結果を改善するための新しい治療戦略をテストするための非常に価値があり、必要な概念実証ステップを表しています。マウスで肯定的な結果が得られれば、革新的な治療法の臨床応用に先立って、大動物間の翻訳前研究を行うために必要な動物の数が大幅に減少するはずです。

開示事項

開示すべき利益相反はありません。

謝辞

HL086741 DK063275 PBとTAは、NHLBI T32トレーニング助成金HL007734からNRSAフェローシップの受賞者です。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2 x 2 ガーゼCovidien2146手術:解剖
5-O ナイロンモノフィラメント縫合Oasis50-118-0631手術:皮膚閉鎖
5-O シルク縫合ファインサイエンスツール18020-50手術:肝葉結紮
5-O Vicryl 縫合EthiconNC9335902手術:腹壁閉鎖
Addson 鉗子Braintree ScientificFC028Surgery: 解剖
アルコール綿棒 (2)BD326895消毒剤
ブプレノルフィン徐放製剤 ZoopharmN / A鎮痛コード
レストリマーBraintreeサイエンティフィックCLP-9868-14シェービング
湾曲鉗子BraintreeサイエンティフィックFC0038:解剖
止血ブレインツリーサイエンティフィックFC79-1:解剖
イソフルラン吸入麻酔薬 Patterson VeterinaryRXISO-250全身麻酔
マグネットフィクセター(2スロット) (2)Braintree ScientificACD-001Surgery: 小型リトラクターを保持するマグネット
フィクセター(4スロット) Braintree ScientificACD-002手術:小さなリトラクターを保持する
マイクロハサミBraintree ScientificSC-MI 151手術:解剖
手術トレイBraintree ScientificACD-0014手術:手術野の確立 
ポビドンヨウ素10%スワブスティック (2)MedlineMDS093901ZZ消毒メス
(15枚刃)アスペン外科製品371615手術:解剖
シャープハサミ(湾曲)ブレインツリーサイエンティフィックSC-T-406手術:解剖
シャープハサミ(ストレート)ブレインツリーサイエンティフィックSC-T-405手術:解剖
スモール綿先端アプリケーターフィッシャーサイエンティフィック23-400-118手術:解剖
組織鉗子(ストレートx2)ブレインツリーサイエンティフィックFC1001:解剖
ウォーミングパッド(18インチ×26インチ)ストライカーTP700ミングウォーミング
パッドポンプストライカーTP700ミング
ワイヤーハンドルリトラクター(2) Braintree ScientificACD-005Surgery:腹腔の露出を容易にするために
Xenotec Isoflurane Small Animal Anesthesia SystemBraintree ScientificEZ-108SA全身麻酔:イソフルランvaborizer&コンソール、誘導チャンバー、レギュレーター/ホース、フェイスマスク(M)が含まれています
糸 糸 糸 手術手術手術ウォーウォー

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