高分解能質量分析分析と分子ドッキングを伝統的な漢方薬研究に統合する一般的なプロトコールについて説明します。
方法論記事
Gynura bicolor DCの化学成分を研究するための高分解能タンデム質量分析
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
目的の化学成分の分離と分析は、伝統的な中国医学(TCM)の基礎研究にとって重要な課題です。超高速液体クロマトグラフィー四重極飛行時間型タンデム質量分析(UPLC-Q-TOF-MS/MS)は、TCM成分の同定のための主要な技術として徐々に普及しています。 GynuraバイカラーDC。 中国で薬や食品に使われる多年草の茎のないハーブ(BFH)は、熱をすっきりさせる、肺を潤す、咳を緩和する、うっ血を分散させる、むくみを和らげるなどの薬効があります。ポリフェノールやフラボノイドには多数の異性体が含まれており、BFH中の錯体化合物の同定を妨げています。この論文では、UPLC-Q-TOF-MSによる溶媒抽出と統合データに基づいて、BFHの化学成分を研究するための体系的なプロトコルを提示します。
ここで説明する方法には、サンプルの前処理、MSキャリブレーション、MS取得、データ処理、および結果の分析のための体系的なプロトコルが含まれています。サンプルの前処理には、収集、洗浄、乾燥、破砕、抽出が含まれます。MSキャリブレーションは、マルチポイント補正とシングルポイント補正で構成されています。データ処理には、データのインポート、メソッドの確立、分析処理、および結果の表示が含まれます。この論文では、 Gynura bicolor DC. (BFH)におけるフェノール酸、エステル、および配糖体の典型的なフラグメンテーションパターンの代表的な結果を示します。さらに、有機溶媒の選択、抽出、データ統合、衝突エネルギーの選択、およびメソッドの改善について詳しく説明します。この汎用プロトコールは、TCM中の複雑な化合物を同定するために広く使用できます。
概要
中国では何千年にもわたって中国で臨床が行われており、中国人の健康維持に重要な役割を果たしています1。TCMの組成は多様で複雑であり、TCMは化学組成に焦点を当てた多くの定性的研究で広く報告されています2。TCMの化学成分は、アルカロイド、有機酸、フェニルプロパノイド、クマリン、リグナン、キノン、フラボノイド、テルペノイド、トリテルペノイドサポニン、ステロイドサポニン、強心配糖体、タンニン3などのカテゴリに大別できます。TCMには未知の成分や見分けがつかない異性体が多数存在することを考えると、目的の化学成分の分離と分析はTCM4の基礎研究にとって重要な課題です。
超高速液体クロマトグラフィー四重極飛行時間型質量分析(UPLC-Q-TOF-MS)は、超高速液体クロマトグラフィー5,6で分離できる漢方薬(TCM)の物質を分析するために適用されています。MSの高分解能は、広範なイオン情報を提供することができ、誤差が5ppm未満のデータベース分析に使用されます7。コリジョンエネルギーをオンにした後、二次MSモードは、エネルギー8の大きさによって強度と数が影響を受ける二次フラグメントイオンを取得できます。
GynuraバイカラーDC。 (BFH)は、薬や食用に広く使用されている多年生の茎のないハーブ(図1A)で、中国9に固有の希少で絶滅の危機に瀕している植物です。BFHには、アントシアニン、ポリフェノール、フラボノイドが豊富で、強力な抗酸化能力があります10。BFHには、熱の除去、血液の冷却、肺の湿潤、咳の緩和、うっ血の分散、腫れの緩和、夏の暑さの緩和、熱の除去などの薬効があります。BFH11の化学組成に焦点を当てた研究はほとんどありません。ポリフェノールやフラボノイドには多数の異性体が含まれているため、BFH中の錯体化合物の同定が困難です。化学成分を同定するための普遍的な方法を開発する必要があります。これはあらゆる種類のTCMに適用できます。この研究は、UPLC-Q-TOF-MS による溶媒抽出と統合データに基づいて、BFH の化学成分を研究するための体系的なプロトコルを報告することを目的としています。
プロトコル
1.サンプル前処理
- 目に見える堆積物や不純物がなくなるまで、BFHのハーブ全体を純水で洗います。きれいなBFHを皿に入れてからオーブンに入れます(図1B)。オーブンを50°Cに24時間設定します。
注:BFHの全工場は中国の四川省で収集されました。 - 高速多機能破砕機でBFHを粉砕乾燥。粗い粉末を50メッシュのふるいに移します(図1C)。微粉末を密閉袋に集め、乾燥塔に保管します。
- それぞれ0.25 gのBFHサンプル6個を正確に秤量し、6つの円錐形フラスコに入れます。30 mLの有機溶媒(50%エタノール水、70%エタノール水、クロロホルム、石油エーテル、酢酸エチル、およびn-ブチルアルコール)を各コニカルボトル(図1D)に加えます。
- 混合物を超音波浴超音波装置に移し、25°Cで30分間抽出します。 サンプルを14,000 x g で5分間遠心分離します。注射用シリンジと0.22μmの有機微多孔質メンブレンフィルターを調製します。すべての上清を2mLのサンプルボトルにろ過します。
2. MSキャリブレーション
- 1,000 μLの範囲のピペットを使用して、500 μLの0.1 M水酸化ナトリウム溶液を100 mLメスフラスコに移し、次に450 μLの脱イオン水または超純水を100 mLメスフラスコに移します(図2)。
- 200 μLの範囲のピペットを使用して、50 μLのギ酸を100 mLメスフラスコに加えます。90:10 2-プロパノール:水で総容量100 mLにし、溶液を5分間超音波処理します。フラスコに 0.5 mMギ酸ナトリウム溶液を90:10 2-プロパノール:水で ラベル付けし、冷蔵庫で保存します。
注:ギ酸ナトリウム溶液は、室温で1週間で期限切れになります。 - UPLC-Q-TOF-MS制御ソフトウェアを起動し、 MS tune ウィンドウを開きます。 サンプルフローコントロールパネル で、 注入流量 オプションで25μL / minを設定し、 リザーバー オプションでCを選択します。自動パージが終了するまで約1分待ちます。
- フローボタンをクリックして、ギ酸ナトリウム溶液の供給を開始します。Positive(ポジティブ)ボタンをクリックしてポジティブイオンモードに切り替え、Sensitivity(感度)ボタンをクリックして感度モードに切り替えます。
注:ギ酸ナトリウムの特性ピークがリアルタイムスペクトルウィンドウに表示されるまで、次のステップに進みます。 - UPLC-Q-TOF-MS制御ソフトウェアで、 MS Console ウィンドウを開きます。左の位置で、 SYNAPT XS オプションと Intellistart オプションを順番に選択します。
- 「キャリブレーションを作成」にチェックを入れ、「開始」ボタンをクリックします。Nextボタンをクリックし、ドロップダウンメニューからCalibration Profileを選択します。[次へ]ボタンをクリックし、[正極性]で[感度]モードを選択します。[Next]、[Tune Page]、[Next]、[Start]ボタンを順番にクリックします。
- MS tuneウィンドウに切り替え、Negativeボタンをクリックしてマイナスイオンモードに切り替えます。MS コンソール ウィンドウに戻ります。
- 「キャリブレーションを作成」にチェックを入れ、「開始」ボタンをクリックします。次へボタンをクリックし、ドロップダウンメニューからキャリブレーションプロファイルを選択します。[次へ]ボタンをクリックし、[負極性]で[感度]モードを選択します。[Next]、[Tune Page]、[Next]、[Start]ボタンを順番にクリックします。
- LockSpray Flow Controlパネルで、流量を50 μL/minに設定し、[Flow]ボタンをクリックしてLE溶液を質量分析計に送ります。MS Tuneウィンドウに切り替え、LockSpray Source Setupにチェックを入れ、Startボタンをクリックしてキャリブレーションを開始します。
3. MS取得
- メインインターフェースに切り替えて、[ Inlet File ]列を右クリックして液体クロマトグラフィーメソッドを開きます。
- Inletボタンをクリックし、Run timeやGradientなどのパラメータを設定します。[Autosampler]ボタンをクリックし、[Run time]、[Column]、[Sample]などのパラメータを設定します。「保存」ボタンをクリックします。
- [MS Method]カラムを右クリックして、質量分析メソッドを開きます。
- [Information]ボタンをクリックし、[End Time]、[Polarity]、[Analyser Mode]、[Low Mass]、[High Mass]、[Ramp Transfer Collision Energy]などのパラメータを設定します。[OK]ボタンをクリックしてから、[保存]ボタンをクリックします。
- 配列表にファイル名、バイアル、および巻を記入します。 [保存 ]ボタンをクリックします。
- 実行するサンプルのシーケンステーブルで行を選択します。 [実行 ]ボタンをクリックし、ポップアップするウィンドウで [OK ]ボタンをクリックします。
4. データ処理
- データ分析ソフトウェアを起動します。 [My Work ]列で、[ Import MassLynx Data ]ボタンをクリックして新しいウィンドウを開きます。
- プラス記号ボタンをクリックして、ポジティブモードの5つのrawファイルすべてを確認します。グループ名を入力し、[Create UNIFI Sample Set] ボタンをクリックしてデータのインポートを開始します (図 3A)。
- ポジモードでAnalysis Methodファイルをダブルクリックします。 「Processing 」ラベルをクリックし、「 Target by Mass 」ボタンをクリックします。「Target match tolerance」と「Fragment match tolerance」の後の入力ボックスに 5 ppm の数値を入力します。
- ホームボタンをクリックし、付加体ボタンをクリックします。+H と +Na の行を選択し、右矢印のボタンをクリックします。[Save]ボタンをクリックします(図3B)。
- ネガティブモードでAnalysis Methodファイルをダブルクリックします。 「Processing 」ラベルをクリックし、「 Target by Mass 」ボタンをクリックします。「Target match tolerance」と「Fragment match tolerance」の後に入力ボックスに 5ppm の数値を入力します。
- ホームボタンをクリックしてから、 付加 体ボタンをクリックします。-H と +HCOO の行を選択し、 右矢印の形をした ボタンをクリックします。 [保存 ]ボタンをクリックします。
- My Work列で、Analysisボタンをクリックして新しいウィンドウを開きます。インポートしたデータと作成した方法を選択し、[次へ]ボタンをクリックします。ファイル名を入力します。解析データが保存されているフォルダを選択し、[完了]ボタンをクリックします
- [Process]ボタンをクリックし、結果が表示されるまで数分待ちます(図3C)。
- 結果テーブルを空白の形式にコピーします (図 3D)。
5. 結果分析
- 結果テーブルで化合物を選択します。対応するセカンダリーマススペクトルが右下隅に表示されます(図4A)。
- 表状のボタンをクリックし、[High Energy Fragments]オプションを選択して、二次フラグメントイオンの表を表示します(図4B)。
- 表中の二次フラグメントイオンを選択します。セカンダリーマススペクトルに対応するイオンピークの上にマウスを移動すると、対応する構造フラクチャーが画面に表示されます(図4C)。
注:ソフトウェアによって与えられたクラッキングの合理性を手動で評価し、二次フラグメントイオンに基づいて異性体を区別します。 - 描画ソフトウェアでフラグメンテーションパターンを手動で描画します。
注:フラグメンテーションパターンの例は、代表的な結果のセクションで詳しく説明しています。
結果
BFHの化学組成同定をモデルとして、代表的な結果を表示しました。溶媒抽出した Gynura バイカラー DC のベースピーククロマトグラム。は Supplemental File 1-Supplemental Figure S1-S6に、観測された保持時間(RT)、成分名、式、質量電荷比(m/z)、および質量誤差は表S1-S6にリストされています。ZBTKでは、UPLC-TOF-MSの分離されたピークから35種類の化合物すべてが同定されました。 Supplemental File 1-Supplemental Table S1に示すように、主な化学物質には酸(キナ酸、DL-リンゴ酸、クエン酸、o-クマル酸、3-O-トランス-クマロイルキナ酸)、配糖体(ゲンチオピクリン、ピクロシドII、サフルチコシドJ、コポリン、ボルネオール-2-O-β-D-アピオフラノシル-(1→6)-β-D-グルコシド)、エステル(ビロバリド、クエン酸トリメチル、トランス-O-グルコシル-メチル-トランス-シンナメート)が含まれていました。ZBTK-CTでは、25種類の追加化合物が検出され(Supplemental File 1-Supplemental Table S2)、合計45種類の化合物が観察されました。
抽出剤としてクロロホルムを使用したところ、50種類の化合物すべてが見つかりました。その中には、コロナリン酸、サンレン酸、アグリモールA、アルテミサートメチルなど28種類の追加化合物が含まれていました(Supplemental File 1-Supplemental Table S3)。石油エーテルを抽出剤として用いたところ、44種類の総化合物が観察されました。その結果、ノトプテロール、オンジサポニン、クニデオールBなど17種類の化合物が検出された(Supplemental File 1-Supplemental Table S4)。酢酸エチルを抽出剤として用いた溶媒中で、合計65種類の化合物を得た。前の4つの抽出物と比較して、ダフネチン、アセトバニロンB、およびスチグマステロール-3-O-β-D-グルコシドなどの37の追加の化合物が認められました(補足ファイル1-補足表S5)。ブチルアルコール抽出物には、レンギオシドC、クロモン、アツラメテリンF、デアセチルマトリカリン-8-O-β-D-グルコピラノシドなど26種類の追加化合物を含む67種類の総化合物が検出された(Supplemental File 1-Supplemental Table S6)。要約すると、6つの抽出物のすべての化合物結果に基づいて168の化合物を見つけました。
UPLC-TOF-MSにおける化合物タイプの切断経路を深く理解するために、例として3つの化合物を選択しました。酸の場合、m/z = 337.09222の3-O-トランス-クマロイルキニン酸は、加水分解反応を介してC7H10O5 またはC9H8O2 基を失い、それぞれm / z = 163.04116または199.05557の中間体を形成する可能性があります(図4D)。エステルについては、m/z = 385.11308 の trans-O-グルコシル-メチル-トランス - 桂皮酸を、異なる部位での C-C 開裂により m/z = 153.07485 または 135.04679 の中間体に変換できます(図 4E)。配糖体については、m/z = 385.11308のシトルシンCは、脂肪族鎖のC-C結合開裂を介してm/z = 272.09174の中間体に変換されましたが、C7H6O2 基の損失は、m/z = 113.02534の中間体をもたらしました(図4F)。別の経路では、ベンゼン環上のC-O-C結合の切断により、m/z = 163.11245の中間体が形成され、ヘキソースユニットは消失しました。
分子ドッキングの代表的な結果は、それぞれ図4G,Hに2次元構造と3次元構造を示しました。Gene Ontology Enrichment解析は、生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、および分子機能(MF;図4I)。京都遺伝子大百科事典とゲノムパスウェイアノテーション解析では、発現差のある遺伝子のパスウェイ結果が示され、遺伝子の機能の理解に利用できる可能性があります(図4J)。分子ドッキングの詳細な結果をSupplemental File 1-Supplemental Table S7およびSupplemental File 1-Supplemental Figure S7-S9に示します。
図1:漢方薬の前治療方法 (A) Gynura bicolor DC.(B)洗浄と乾燥。(C)粉砕。(D)有機溶剤の添加。(E)超音波抽出。(f)混合物の遠心分離。(G)上清のろ過。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:UPLC-Q-TOF-MS/MS.の操作手順 (A)ギ酸ナトリウム調製。(B)質量軸キャリブレーション。(C)MSチューン。(D)サンプルの配置。(E)マススペクトル取得。(F)マススペクトル表示。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:データ処理と統合 (A)データ変換(B)方法の変更。(C) データ処理。(D) 結果の統計分析 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:詳細な結果解析 (A)二次マススペクトル。(B)二次フラグメントイオンディスプレイ。(C)骨折部位の表示。(D)フラグメンテーションパターン1。(E)フラグメンテーションパターン2。(F)フラグメンテーションパターン3。(G)有効成分の行動目標のデモンストレーション。(H)有効成分作用目標の3次元構造。(I)GOエンリッチメント分析。(J)KEGG経路アノテーション解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:化合物の同定、分子ドッキング結果、ベースピーククロマトグラム、およびネットワーク解析。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
水煎じ薬12の他に、有機溶媒抽出は、TCM前処理13の別の一般的な方法である。同様の相溶解の原理によれば、種々の有機溶媒14の組み合わせにより多数の成分が抽出されている。超音波支援抽出は、TCM15の成分を得るために使用される主要な方法の1つです。超臨界二酸化炭素抽出は、リグナンなどの特定の種類の物質を抽出するのに適しています16。さらに、イオン液体(IL)中のマイクロ波支援抽出は、従来の有機溶媒抽出の代替として調査された17。しかし、マイクロ波エネルギーの精密な制御は難しく、エーテル化脱水やエステル化脱水などの二次反応を引き起こす可能性があります。
コリジョンエネルギーを最適に設定すると、追加の 2 次 MS フラグメント情報が得られます。タンデムMS、すなわちMSE モードからの情報は、分子イオン情報を得るための低エネルギーまたはフルスキャンの正確な質量断片化イオンを得るための高エネルギーのいずれかを用いた2つの並列交互スキャンによって提供された18。高エネルギーパラメータの設定中、10〜35Vの範囲は通常、前駆体フラグメンテーション効率19を高めるためにランプ伝達衝突エネルギーに使用される。
膨大な量の生MSデータは高分解能MSから生成されたため、MSスペクトルの分子イオンピークとMS/MSスペクトルのフラグメントイオンピークを含む生MSデータは、徹底的に処理および統合する必要があります。MSデータ解析ソフトウェアは、生体試料中の全ての代謝物を網羅的に解析することを目的としたソフトウェアである20。硫酸化代謝物のスクリーニングは、フルMSスキャンおよび多次元代謝物データ21のデータ依存的な取得に基づいていた。進化する技術に基づいて、人工知能予測はMSデータ分析の実行可能な開発方向になります。
この方法では、化合物の大部分を同定することができます。しかし、限られた二次断片では、フラボノイドやタンニンを含むすべての異性体を完全に同定することはできません。構造同定を達成するために、研究者はタンデム質量分析を使用してフラグメントイオンに関するさらなる情報を得ることができ、化合物構造の同定に役立ちます8。エレクトロスプレーイオン化イオンや大気圧化学イオン化源の制限を考えると、高分解能MSは高分子分析には適していません。マトリックス支援レーザー脱離イオン化は、タンパク質22などの大きな分子化合物のイオン化を促進することができる。要約すると、UPLC-Q-TOF-MS/MS は、TCM 化合物の同定に最も広く適用できる手法の 1 つです。臨床医学やエネルギー化学など、他の分野への応用も期待されています。
開示事項
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金会(82104881)、免疫疾患のTCM治療の継承およびイノベーションチーム、重慶医学科学研究プロジェクト(重慶衛生委員会と科学技術局の共同プロジェクト)(2022DBXM007)、重慶科学研究所のパフォーマンスインセンティブとガイダンスのための特別プロジェクト(cstc2022jxjl120005)、重慶ポスドク科学財団の特別プロジェクト(2022CQBSHTB3035)、 重慶市の老人医療人材プログラム、重慶市科学機関プログラム(独立研究課題No.2022GDRC015)。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| クロロホルム | シノファーム ケミカル試薬株式会社 | CAS 67-66-3 | |
| エタノール | ChuandongChemical | CAS 64-17-5 | |
| 酢酸エチル | ChuandongChemical | CAS 141-78-6 | |
| 液体クロマトグラフ | Waters | ACQUITY Class 1 plus | |
| MassLynx | Waters V4.2 | MS 制御ソフトウェア | |
| n-ブチルアルコール | ChuandongChemical | CAS 71-36-3 | |
| 石油エーテル | ChuandongChemical | CAS 8032-32-4 | |
| 四重極飛行時間型質量分析 | Waters | SYNAPT XS | |
| UNIFI | Waters | データ解析ソフトウェア |
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