バイオハイブリッド型蚊取りを用いた原子間力顕微鏡プローブの開発

サマリー

昆虫を噛む行動の定量的かつ制御された調査は、ベクター媒介性疾患と戦うための効果的な戦略を考案するために重要です。これに関連して、バイオハイブリッド原子間力顕微鏡(AFM)プローブを製造する方法が導入されます。

要約

蚊は、病気を媒介する能力があるため、人間にとって最も致命的な動物として悪名高く、公衆衛生に永続的な課題を提起しています。現在使用されている一次予防戦略には化学忌避剤が含まれますが、蚊が急速に耐性を発達させるため、効果がないことがよくあります。したがって、新しい予防方法の発明は非常に重要です。このような開発は、蚊に刺される行動を完全に理解することにかかっており、制御可能なテストパラメータと定量的測定を使用して実際の刺すシナリオを正確に再現する実験設定が必要です。このギャップを埋めるために、バイオハイブリッド原子間力顕微鏡(AFM)プローブが設計され、その先端として生物学的針(特に蚊の唇)が特徴付けられました。このバイオハイブリッドプローブは、標準的なAFMシステムと互換性があり、蚊の侵入挙動をほぼ本物に近いシミュレーションで実現します。この方法は、噛むメカニズムの定量的研究における一歩前進を示し、ベクター媒介性疾患(VBD)に対する効果的な障壁の作成につながり、蚊が媒介する病気との闘いに新たな道を開く可能性があります。

概要

世界保健機関(WHO)は、ベクター媒介性疾患(VBD)が全感染症の17%以上を占め、世界で年間70万人以上の死亡を引き起こしていると報告しました。例えば、世界で最も致命的な動物である蚊は、デング熱、マラリア、ジカ熱などの多くの病原体を、血液を媒介する節足動物を介して拡散させ、毎年7億件の感染をもたらしています¹。蚊の侵入行動を模倣して蚊を刺すメカニズムを調べたり、侵入防止の有効性を証明するための潜在的な障壁の研究など、VBDを予防するための効果的な対策の開発に向けた探求は非常に重要です。重要な課題の1つは、そのような調査を実行するための適切なアプローチを開発することです。蚊の針の形状に似たマイクロスケールの針の開発など、文献で努力が払われてきました。しかし、これらのマイクロニードルを作るために使用される材料の多くは、粘弾性材料²、シリコン(Si)、ガラス、セラミック³など)は、蚊の吻の生物学的材料とは異なる機械的特性を持っています。設計された材料は脆く、破壊や座屈を起こしやすい^{可能性があります3,4}が、蚊の吻は破壊や座屈によく耐えることができます⁴。人工材料の代わりに蚊の唇を使用するバイオハイブリッドプローブを持つことの利点は、蚊の穿刺メカニズムをより正確に表現できることです。また、力⁵の正確な測定など、定量的な研究を行うには、特殊なツールをマイクロニードルと統合する必要がありますが、これは、設計されたマイクロニードルを使用したカスタマイズされたセットアップでは簡単に達成できません。

原子間力顕微鏡(AFM)ベースのアプローチは、サンプルの表面近くに注意深く配置された超微細チップを備えたカンチレバーを採用することによって動作するという点で有望です。先端は、表面を横切ってスキャンするか、表面に向かって/押し込むことができ、サンプルとの相互作用により、さまざまな引力または反発力を受けます⁶。これらの相互作用は、カンチレバーの偏向につながり、カンチレバーの上部から光検出器⁶へのレーザービームの反射によって追跡される。システムの動きに対する並外れた感度により、AFMは、ピコメートル精度の形態学的マッピング、ピコニュートンからマイクロニュートンまでの力測定、包括的なマルチフィジックス調査7など、さまざまな測定^{を行うことができます。}例えば、AFMインデンテーションは、試料に加えられた力に対する応答を正確に評価するために実行することができ、また、適切な分析モデル⁸と結合することによって、試料の硬度、弾性、およびその他の機械的特性を測定することができる。AFMのプローブは、最も一般的には、長さ20〜300μm9、先端半径が数〜数十ナノメートル^{のオーダー10}のシリコン(Si)または窒化ケイ素(_Si3N4)⁸でできています。ナノメートルスケールの先端半径は、高解像度イメージングなどのアプリケーションに最適です。ただし、剛性、半径、形状、およびアスペクト比の点で浸透動作を模倣しようとする研究用の生物学的針の特性はありません。例えば、蚊の微小針構造は束であり、そのアスペクト比は~60¹¹(長さ~1.5mmから2mm、直径~30μm)¹²である。従来のAFMプローブは、唇のような生物学的な針に似ていると想定できますが、その明確な材料特性と寸法は、噛み合わせ中の実際の状況を反映していません。

昆虫などの生物咬傷を針で模倣した浸透挙動を定量的に調べるために、生物針を先端とするバイオハイブリッドAFM片持ち梁を作製するプロセスを開発した。ケーススタディとして、蚊の唇の先端が取り付けられたAFMカンチレバーのデモンストレーションに成功しました。蚊が犠牲者の皮膚を突き刺すために使用する典型的な挿入力に関する文献からの既存の情報を利用する^12,13、このバイオハイブリッドAFMカンチレバーは、通常のAFMの下で蚊に刺された蚊のほぼ現実的な模倣を可能にする可能性があります。マイクロバイオバイオスティンガーを活用してバイオハイブリッドAFMカンチレバーを製造するプロトコルは、さまざまな噛み込みメカニズムの定量的研究のための他の鋭いスティンガーベースのバイオハイブリッドAFMカンチレバーの開発にも適用できます。

用語
吻とその関心のあるコンポーネントの概略図を図1に示し、それらの定義は、(1)テング:蚊が自分自身を養うことを可能にする蚊の口からの体の部分で、束(コア)と陰唇(シェル)で構成されるコアシェル構造、(2)陰唇:テング²の暗くて鈍い外側のカバー、(3)束:2つの上顎、2つの下顎、下咽頭、および唇を含む、陰唇の内側に含まれる細い針のグループ²、(4)下咽頭:宿主の血流に唾液を分泌する^{役割を果たします2}、(5)上顎:摂食メカニズムを補助する鋸歯状の^{メンバー2}、(5)下顎:上顎と同様に、摂食メカニズムで蚊を助け、鋭い先端²を持っています、(6)唇:上顎、下顎骨、下咽頭よりもはるかに大きい、犠牲者の皮膚を貫通するための主要なメンバー。また、皮膚の下の血管や内部チャネルを見つけることができる感覚構造も備えています²、 (7) マニピュレータ:位置決めのための3つの自由度とミクロンスケールの精度を備えたアセンブリで、XYZ方向への移動を可能にします (8) クランプアセンブリ : 実験中にチップレスAFMカンチレバーをクランプするために使用されるマニピュレータに取り付けられたカスタムメイドの2部構成クランプ。

プロトコル

このプロトコルに使用される蚊の種は、感染していない成虫 のネッタイシマカ (A. aegypti)であり、冷凍され、-20°Cの冷凍庫に保管されます。この種は、NIH/NIAIDフィラリア症研究試薬リソースセンターから提供され、BEI Resources、NIAID、NIH:Uninfected Aedes aegypti、Strain Black Eye Liverpool (Frozen)、NR-48920を通じて配布されました。研究に使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1.吻から陰唇を解剖する

1. ピンセットを使用して、死んだ蚊を顕微鏡下のスライドガラスの上に置き、吻の端に先細りの先端があることを確認します(図2A)。
2. 蚊をスライドガラスの上に置いたまま、メスの刃を蚊の頭の近くの陰唇にそっと置きます(図2B)。
3. 陰唇の厚さを通る浅い浸透深さで、陰唇の上半分全体(約80μmのカット)を切開します。陰唇だけをカットし、下にある束はカットしないように、ブレードに軽く圧力をかけるようにしてください。
4. ピンセットで蚊の頭をしっかりと保持し、別の精密ピンセットで、先細りの先端と切開位置の間の任意の位置で陰唇を軽くつまみます(図2B)。
   1. 陰唇を保持しているピンセットを先細りの先端の方向に引きます(図2C)。陰唇が引き裂かれ、束から完全に取り除かれるまで、ピンセットを引っ張り続けます。
5. 蚊を顕微鏡の下に置き、唇の先端が存在するかどうかを確認します。これは、束に先細りの先端があることで識別できます(図2D)。

2.唇の先端を他の束のメンバーから分離する

1. 精密ピンセットの先端をクランプして閉じ、ピンセットの先端を唇のすぐ横の先端近くに置きます。
2. ピンセットの先端を使用して、束の長さに垂直な方向に唇に穏やかな力を加えます(図3A)。
3. 唇が他の束メンバーから分離されるまで、唇をスライドガラス全体に押し続けます。
4. 顕微鏡で試料を検査し、唇と他の束部材との適切な分離が達成されたことを確認します(図3、左)。分離に失敗した場合は、手順2.1に戻ってください。

3.唇の先端を切る

1. 唇がまだスライドガラス上にある間に、唇の先端から約~200 μmの距離で唇の上にメスの刃を置きます(図4A)。十分な圧力をそっとかけ、唇の先端を完全に切ります。唇の先端はできるだけ短くするのが理想的ですが、現在のアプローチで処理できるのが~200μmが最適です。
2. デジタル測定ソフトウェアを使用して、切断された唇の長さを測定し、300μmを超えないことを確認します(図4B)。このプロトコルでは、ImageJが使用されました¹⁴。

4.唇の先端をつかむ

1. 精密なピンセットを使用して、スライドガラス上の唇の先端を見つけて分離します。唇の先端以外のスライドガラスに残っているすべての部品を廃棄します。
2. 同じ精密ピンセットで、ゆっくりと軽く唇をつまんで、切り口の端が自由になり、ピンセットに遮られないようにします。また、唇の向きがピンセットの長さの方向に平行であり、唇の切断端がピンセットの本体から離れていることを確認してください。
3. 試験片をしっかりと挟んだら、ピンセットの先端を固定しているクランプ力を取り除きます。唇の先端はピンセットの先端の1つにくっつきます。
4. 顕微鏡下で、ピンセットの先端を検査し、唇の先端がピンセットの先端の1つに存在することを確認します(図5)。唇の先端がピンセットにない場合は手順4.2に戻り、唇の先端がピンセットにもスライドガラスにもない場合は手順1に戻ります。

5.チップレスカンチレバービームにエポキシを塗布する

1. 新しいスライドガラスの端にエポキシを滴下(~0.05 mL)し、元のボトル/容器から接着剤を直接滴下します。エポキシ含有スライドガラスをプローブステーションの下に置き、焦点を合わせます。
2. チップレスAFMカンチレバーをクランプアセンブリに取り付けて、ベース(つまり、大きい方の端)を固定し、カンチレバーの端を自由にしてスペースに吊り下げます。AFMカンチレバーの底部が下を向いていることを確認してください。
3. マニピュレータをプローブステーションに取り付けます。
4. マニピュレーターのZ軸を、チップレスカンチレバーがエポキシ含有スライドガラスの数ミリメートル上にある位置まで上げます。
5. マニピュレータを手動で動かして、チップレスカンチレバーがプローブステーションのカメラのフィールドビューに表示されるようにします。
6. マニピュレータを使用して、カンチレバーの先端がスライドガラスの端にあるエポキシの真上に来るまで、AFMカンチレバーをX方向とY方向に沿って動かします。
7. マニピュレーターをもう一度使用して、スライドガラスの端を越えて、チップレスカンチレバーをZ方向にゆっくりと下げます。
8. カンチレバーが下がってスライドガラスに近づくと、カンチレバーが最初にエポキシに触れるまで、カンチレバーを非常にゆっくりと下げ続けます。カンチレバーをこれ以上下げないでください。
9. 慎重に、マニピュレーターをかみ合わせてカンチレバーをX方向またはY方向にゆっくりと動かし、カンチレバーがスライドガラス上のエポキシから完全に分離されるまで、カンチレバーを選択した方向に連続的に移動させることにより、エポキシのプールからカンチレバーを取り外します。チップレスカンチレバーの先端には、プローブステーションの下に見えるエポキシのミニチュアバブルが必要です。
10. マニピュレータを使用してカンチレバーをZ方向に持ち上げます。

6. 唇の先端をチップレスカンチレバー梁に接着する

1. カンチレバーの長軸を中心にマニピュレータを90度回転させ、マニピュレータをプローブステーションの横に置きます。この構成では、AFMカンチレバーの長さに沿った厚さは垂直方向になります。
2. 唇の先端を含む精密ピンセットをプローブステーションのカメラの下に配置して、唇の先端の全長がコンピューターのモニターに表示されるようにします。
3. クランプとチップレスカンチレバーを保持しているマニピュレーターアセンブリをプローブステーションカメラの下に配置して、チップレスカンチレバーの全長がコンピューターモニターに表示されるようにします。
4. プローブステーション顕微鏡を唇の先端と先端のないカンチレバーに焦点を合わせます。
5. マニピュレータを慎重に手動で回転させて、カンチレバーを唇の先端に垂直に向けます(図6A)。
6. マニピュレータの自由度を使用して、カンチレバーの接着剤が唇の先端の切断端に接触するように、チップレスカンチレバーをゆっくりとXY方向に動かします(図6B)。
7. エポキシを硬化させ、カンチレバーと蚊の唇の交差点を固めます。
8. エポキシ樹脂が硬化したら、マニピュレータをXY方向に静かにかみ合わせ、カンチレバーをピンセットから離し、唇の先端がチップレスカンチレバービームの上に立っていることを確認します(図6C)。

結果

作製したバイオハイブリッドAFMプローブの走査型電子顕微鏡(SEM)画像を 図7に示します。唇の端は、チップレスカンチレバービームにうまく接着されました。蚊の針の自然な曲率と提示されたプロトコルの手動操作のために、片持ち梁に対して完全に垂直な針の先端を持つ片持ちを得ることは非常に困難です。スティンガーとカンチレバーに垂直な仮想の中心線との間の中心から外れた角度は、通常~10度です。AFMカンチ^レバー15にプローブを取り付ける場合の一般的な問題のようですが、力/応力解析を実行する際には意図しない傾きを考慮する必要があります。今後の研究は、製造プロトコルの改善に焦点を当て、バイオハイブリッドプローブを使用して研究を行うことが興味深いでしょう。これは、昆虫の針を使用してバイオハイブリッドAFMプローブを作成する最初の試みです。

図1:蚊の吻の概略図。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2:蚊の吻の陰唇の除去(A)無傷の先細りの先端の存在を示す完全な吻を持つ蚊。(B)陰唇除去プロセス中の陰唇切開の位置と陰唇上のピンセットの配置。(C)陰唇の除去中にピンセットを引っ張る方向。(D)陰唇除去後の先端が無傷で、先細りの唇先端がまだ存在し、無傷の状態で、最終的に解剖された束。スケールバー:200μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:不要な束のメンバーからの唇の分離(A)ピンセットの配置の位置と、吻の束のメンバーを分離する技術としてのピンセットの押し方。(B)唇を他の束のメンバーから分離するために操作された後のテング。スケールバー:200μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:AFMカンチレバーに取り付けるための所望の唇先端の分離 (A)唇の先端を除去するための唇切開の位置。スケールバー:200μm.(B)唇の先端は、唇の本体から切り取られると、長さは約200〜300μmです。スケールバー:50μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:接着プロセスの前に唇の先端をピンセットに取り付ける。 唇の先端はピンセットの先端の1つにくっついており、唇の切断されていない端は自由で、ピンセットの体から離れています。スケールバー:200μmこの 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図6:唇の先端を先端のないカンチレバーに取り付けるためのシーケンス(A)唇に対して垂直な位置にチップレスカンチレバーを向ける。(B)チップレスカンチレバーを唇と融合させ、2つのコンポーネント間の接合部を固めるために使用されるエポキシ接着剤を硬化させます。(C)唇がピンセットで支えられていない、最終的に硬化したバイオハイブリッドAFMプローブ。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図7:バイオハイブリッドAFMプローブのSEM画像(A)唇の先端とチップレスカンチレバーの全体像。スケールバー:200μm.(B)唇の先端の拡大図。スケールバー:50μm.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

プロトコルのステップ1は、不要な陰唇の生物学的サンプルを洗浄することを目的としています。これを達成するために、陰唇を切開しますが、陰唇の真下にある束には切開しません(図1)。束と陰唇はそれらの界面で結合されていないため(つまり、陰唇は束に沿って自由にスライドし、蚊の頭に付着することによってのみ所定の位置に保持されます)、実行された切開は、陰唇の一部を蚊の頭から分離し、外側のカバーの取り外しを容易にします。陰唇がサンプルから引き出されるとき、技術者は陰唇の下半分がまだ蚊に付着していることによって引き起こされるわずかな抵抗を経験するはずです。切開部は生体材料の亀裂伝播を促進し、陰唇の未切断部分を裂き、引っ張り動作中に陰唇全体が束から滑り落ちるため、この抵抗力は比較的容易に解放されることが期待されます。切開が不十分な場合、技術者は引っ張るときに過度の抵抗を経験する可能性があるため、プロトコルを続行する前に別の切開を試みることをお勧めします。

ピンセットでつまんで唇を操作するときは、ステップ1とステップ4で柔らかなタッチと忍耐力を発揮することが重要です。 唇は比較的弾力性がありますが、ピンセットで強く圧縮しすぎると、損傷を受ける可能性があります。技術者は、陰唇/唇を軽くつまむように導かれます、つまり、唇/唇を保持するためにピンセットに必要な最小限の力を実行する必要があります。損傷の有無の評価は、ステップ1とステップ4の最後に、顕微鏡下でサンプルを検査するときに実行できます。吻の長さに沿って異常(つまり、へこみ、裂け目、セグメントの分離)がないか調べることをお勧めします。サンプルが唇の先端で損傷している疑いがある場合は、それを廃棄してプロトコルを再開します。

ステップ3やステップ6など、プロトコルの主要なプロセスステップには特別な注意が必要です。ステップ3を達成するには、唇の先端をメスで手動で切断する必要があります。短く切りすぎると、小さすぎて操作できないため、実験の残りの部分が指数関数的に難しくなります。逆に、先端の長さが300μmを超えると、唇先端とAFMカンチレバーの間に過剰な垂直オフセットが生じるため、AFMカンチレバーに取り付けるには長すぎます。このオフセットは、埋込工程の不完全性やサンプルに存在する可能性のある曲率によって引き起こされ、どちらも唇の長さが長くなると問題になります。また、先端が非常に長いカンチレバーは、AFMの下でも非常に使いにくいでしょう。ステップ3では、この手順ですべての束スタイレット(唇、上顎、下顎、および下咽頭)が切断される可能性が高いことに注意することが重要です。唇は、ステップ2で行われた手動分離のため、ステップ4で残りのスタイレットから簡単に特定および分離されます。ステップ6では、光学顕微鏡で先端がカンチレバーに対して完全に垂直であることを確認することはほぼ不可能ですが、将来の使用で不要な負荷条件を回避するために、傾斜角度を最小限に抑える必要があります。

また、AFMカンチレバーへのスティンガーの取り付けに適したエポキシを選択することも重要です。さまざまなゆっくりと硬化する2液性エポキシがテストされましたが、硬化プロセス中に実験室の床に小さな振動があると実験が失敗する可能性があるため、後に理想的ではないことが証明されました。したがって、最終的にUV硬化型エポキシが採用されました。使用される接着剤は、UV曝露から5秒以内に硬化できる低粘度の高速硬化エポキシです。固化すると、接着剤は非常に硬くなり、優れた強度を持ち、製造された唇カンチレバープローブは単一の物体として動作し、接着位置で故障したり変形したりしません。このオプションは、硬化前に十分な時間を確保し、スティンガーをAFMカンチレバーに接着するための適切な位置にセットアップを構成することができ(ステップ6.3)、コマンドによる硬化動作による環境振動に関連する問題を排除しました。

このプロトコルの残りの重要な機器は、プローブステーション、鋭いピンセット、およびカンチレバーです。使用されるプローブステーションには、カメラに取り付けられた5倍レンズが装備されています。ただし、このプロトコルにこの正確なプローブステーションモデルを使用することは必須ではありません。プローブステーションを選択する際の唯一の優先事項は、AFMカンチレバーと唇の明確で簡単な視認性を確保することです。使用した鋭利なピンセットは、先端のサイズが0.5mm×0.1mmでした。この先端寸法または類似のピンセットを使用することは、より低い細かさの鉗子を使用すると、唇の操作中に困難になる可能性があるため、使用することが不可欠です。このプロトコルで使用されるカンチレバーは、市販の供給源から入手しています( 材料の表を参照)。このカンチレバーモデルは、実際の皮膚への浸透を模倣するために、蚊のプローブの先端に大きな力を伝達する必要があるため、剛性が高いために選択されました。一般に、すべてのスティンガーベースのプローブでは、剛性の欠如はAFMテスト中にカンチレバーの曲がりにつながり、スティンガープローブの先端での圧力発生の欠如につながるため、AFMカンチレバーは柔らかすぎることはありません。これにより、プローブがスティンギングプロセスを不正確に模倣するため、このプロトコルの要件となる高剛性のチップレスAFMカンチレバーが要求されます。

要約すると、同様の研究を実施するために生きている蚊と人間のボランティア^4,11,12を必要とする他の方法と比較して、定量的な機械的浸透/噛みつき研究にスティンガーベースのバイオハイブリッドAFMプローブを使用することには、独自の利点があります。AFMの超高センシング分解能は、前例のない精度での測定を可能にし、バイオハイブリッドプローブは、人間のボランティアを必要とせずに統計的に有意な数の測定を組み込んで、実際の噛みつきシナリオの現実に近いエミュレーションを可能にします4,11,12。さらに、人工マイクロニードルの製造に使用される材料は、通常、蚊の吻を代表するものではない、骨折または座屈しやすい^3,4。蚊の部位自体を使用すると、実際の刺すシナリオによく似ています。このプロトコルは、ハイスループット生産のためにさらに開発および自動化できる可能性があります。最後に、開発されたプロトコルは、さまざまな噛みつき/浸透行動の定量的研究のために、さまざまな動物の針を使用して他のバイオハイブリッドAFMプローブを製造するために使用できる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5-SA-SEストレートテーパーウルトラファインポインテッドピンセット	Excelta	N / A	グの操作/解剖用。
C-4Dプローブステーション	Everbeing Int'l Corp	N/A	AFMの組み立てに使用します。
チップレスタッピングモードカンチレバー	USA	TL-NCH	AFM カンチレバー 仕様はここに示されている： Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) 共振周波数: 330 kHz (204 - 497 kHz) 長さ: 125 µメートル(115 - 135 & マイクロ;m) Width:30 &メートル(22.5 - 37.5 & マイクロ;m) 厚さ:4 &メートル ( 3 - 5 & マイクロ;m)
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