マウス脾臓組織形成研究のための基底膜マトリックスカプセル化細胞凝集

サマリー

この記事は半固体基底の膜のマトリックス内の脾臓のセルを凝集し、カプセル封入するためのプロトコルを記述する。基底膜マトリックスコンストラクトは、オルガノイド発生の研究、または in vivo 移植および組織再生研究のための三次元培養に使用できます。

要約

脾臓は、血液媒介性免疫応答に重要な役割を果たす免疫器官です。この組織の解剖学的または機能的な喪失は、重度の血液感染症および敗血症に対する感受性を高める。脾臓切片の自家移植は、失われた組織を補充し、免疫機能を回復させるために臨床的に使用されています。しかし、堅牢で免疫学的に機能する脾臓組織の再生を促進するメカニズムは完全には解明されていません。本研究では、脾臓細胞を半固体マトリックス内に凝集・カプセル化する方法を開発し、脾臓組織形成に必要な細胞を解明することを目指しています。基底膜マトリックスカプセル化された細胞コンストラクトは、三次元オルガノイドの in vitro 組織培養と、 in vivo 組織形成を直接評価するための腎臓カプセル下移植の両方に適しています。インプット細胞の凝集とカプセル化を操作することで、移植モデル動物移植モデルにおける脾臓組織の再生には、移植片由来のPDGFRβ⁺MAdCAM-1^- 新生児間質細胞が必要であることを実証しました。

概要

脾臓の外傷性破裂と体内の複数の脾臓結節の出現は、脾臓組織が再生能力を持っていることを示す最初の兆候の1つでした^1,2。脾臓自家移植は、緊急脾臓摘^{出術を必要とする}患者の脾臓組織を保存するために、後にクリニックに導入されました3。しかし、何十年にもわたって臨床診療の一部となっているにもかかわらず、脾臓がどのように再生するかについてはほとんど知られていません。動物移植モデルは、脾臓の再生と免疫機能の複数のパラメータに関する洞察を与えてきました^4,5。特に、移植片調製法の実験的変更により、組織再生を細胞および分子レベルでより詳細に研究できるようになりました。

脾臓全切片を含む移植は、新しい脾臓構造^{が再構築される前に}、大量壊死の段階を経る6。移植片壊死の初期段階は、移植された組織の大部分が赤血球と白血球で構成されており、脾臓の再生には不要であることを示唆しています。これは、マウス腎臓嚢の下に移植する前に、脾臓移植片から造血細胞を除外することによって実験的に調査されました。ここで、間質細胞と内皮細胞を含む脾臓の非白血球/非赤血球画分は、de novo組織形成を誘導するのに十分であることが示された⁷。脾臓間質組織をさらに単一細胞懸濁液に加工することで、細胞移植片の組成を操作するための細胞選別技術の使用が可能になります。候補細胞型を選択的に除去することにより、移植片の発生に不可欠な2つのCD45-TER-119^-間質細胞集団、すなわち内皮様CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺細胞集団と、より広義のPDGFRβ⁺間葉系^{細胞集団が}同定された8。

脾臓細胞からの移植片の構築は、支持体と細胞ローディングプロセスの点で異なります。組織工学的脾臓は、脾臓ユニットをポリグリコール酸/ポリL乳酸ポリマー足場^5,9にロードすることによって以前に調製されてきました。興味深いことに、コラーゲンスポンジに吸収された脾臓間質細胞は生着に失敗し、間質細胞が凝集してコラーゲンシート上にロードされると、脾臓の再生が促進されました⁸。マトリゲル基底膜マトリックス内の脾臓間質細胞の再懸濁も、3次元培養条件下で細胞凝集を誘導することが実証されている¹⁰。ただし、この方法は移植モデルでの使用についてはテストされていません。現在のプロトコルの全体的な目標は、脾臓間質細胞を基底膜マトリックス内に強制的に凝集して直接カプセル化することであり、その後、3次元のin vitro組織培養システムに移したり、動物モデル移植の媒体として使用したりできます(補足図1)。

プロトコル

すべての動物実験は、クイーンズランド大学動物倫理委員会(UQBR/079/19)によって承認された実験プロトコルに従って実施されました。

1. 組織採取と間質細胞の調製

1. 0.5〜1.5日齢の雄および/または雌のBALB / c新生児ドナーマウスを、ティッシュペーパーの中に動物を包み、砕いた氷の下に>10分間置くことにより、低体温を誘発して安楽死させます。
   注:このプロトコルは、さまざまなマウス株、年齢、および動物の数に適合させることができます。
2. 滅菌手術器具を準備します。
3. マウスを右横置きにします。80%エタノールで皮膚を綿棒で拭き取り、虹彩手術用ハサミで1cm切開して腹壁を露出させます。
4. 脾臓の上に2回目の0.5cm切開を行い、一対の細かい鉗子を使用して組織を静かに持ち上げます。手術用ハサミを使用して血管を切断し、組織を切除します。氷冷したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むペトリ皿に組織を移します。脾臓に付着している残りの結合組織をすべて取り除きます。
   注意: 実体顕微鏡は、手術器具の操作に必要な微細な運動を補助することができます。
5. 組織全体を解離させるには、新生児脾臓(10個以下のプール)を逆さにした14 mLの円錐形チューブキャップの内側の縁に移します。1 mLシリンジプランジャーのプラスチック製後端を使用して、押し付け動作で組織を機械的に破壊します。
6. 10 mLのコールドPBSを含む14 mLのコニカルチューブにキャップをしっかりと置き、固定します。チューブを5回ひっくり返して、キャップからチューブに破壊されたすべての組織を洗い流します。
7. 残りの組織について、手順1.6を繰り返します。
8. チューブを氷上に1分間置いて、組織をチューブの底に沈殿させます。
9. 上清(造血細胞を含む)をリバーシブルの70μmセルストレーナーに通して慎重に廃棄します。
10. 1 mg/mLのコラゲナーゼIV、40 μg/mLのDNase I、および2%ウシ胎児血清(FBS)を含む新たに調製した2 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(sDMEM)を新たに調製して、間質組織を14 mLのコニカルチューブに洗浄することにより、非可溶性間質画分を回収します。
    注意:コラゲナーゼIVおよびコラゲナーゼDは有害物質であり、適切な個人用保護具を使用してバイオセーフティキャビネット内で取り扱う必要があります。
11. 単一細胞懸濁液を調製するには、プールされた組織(最大20個)を37°Cで10分間、一定回転で酵素消化します。
12. 1 mg/mLのコラゲナーゼD、40 μg/mLのDNase I、および2% FBSを含む4 mLの新しく調製したsDMEMを間質組織を含むチューブに直接添加します。37°Cでさらに10分間、一定の回転でインキュベートします。
13. 氷冷したPBSを8 mL添加して消化を停止します。4°Cで200 x g で5分間遠心分離して細胞を回収します。
14. 上清を廃棄し、1 mLの冷たいPBSに再懸濁し、200 x g で4°Cで5分間遠心分離して細胞を2回洗浄します。 細胞を氷上に保管します。
    注:細胞をカウントし、希望の濃度に調整することができます。これには、異なる細胞集団に対する最適化が必要な場合があります。このプロトコルを使用して、0.5 x 10⁶- 1 x 10⁶ 間質細胞/脾臓は、ドナーマウスの年齢に応じて、通常回収されます。この段階で細胞を染色し、FACSを選別して細胞組成を定義することができます。

2. 細胞凝集体のマトリックス封入

1. 滅菌済みP200ピペットチップを-20°Cの冷凍庫で予冷します。
2. 柔軟な実験用フィルム(パラフィルムなど)を1 cm x 2 cmに切断し、80%エタノールに10分間浸漬し、続いてPBSで10分間浸して滅菌します。実験用フィルムは事前に準備し、無菌状態で保存することができます。
3. 4°Cで5分間、200 x gで遠心分離することにより、0.5 x 10 6-2.5 x 10⁶細胞を調製します。 上清を注意深く吸引し、残りのPBS容量を約20 μL残します。細胞ペレットを氷上に保管します。
   注:残りのPBSは、細胞ペレットを乱すことなく穏やかに吸引して、容量を確認できます。
4. P20ピペッターを使用して、氷冷した基底膜マトリックス2 μLを、事前に冷却したP200ピペットチップに吸引します。
   注:高濃度の基底膜マトリックス(Corning Matrigel Matrix High Concentrationなど)は、強力な凝固プラグの形成に役立ちます。
5. ゆっくりとひねってピペットチップを取り出します。滅菌済みのラボ用フィルムのストリップを伸ばし、フィルムに穴を開けないように注意しながら、ピペットチップの端に置きます。チップをフィルムで包み続け、ピペットチップを密封します。密封された先端を慎重に氷の上に直接置き、フィルムを破裂させないように注意します。
6. 細胞ペレットを残りのPBSに再懸濁し、基底膜マトリックス上に溶液を静かに層状にします。構造物を氷の上に保管します。
7. 14 mLのコニカルチューブの中に1.2 mLのクラスターチューブを入れて、遠心分離チューブを調製します。
8. ピペットチップをネストチューブ内に置き、400 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。
9. 14 mL コニカルチューブを垂直方向に配置し、37 °C で 15 分間インキュベートして、基底メンブレンマトリックスがピペットチップ内で固化します。
   注:14 mLのコニカルチューブは、下流のアプリケーションで必要になるまで氷上に置くことができます。

3. 三次元オルガノイド培養

1. ピペットチップからラボ用フィルムを慎重に剥がします。
2. 細いステンレス製ワイヤープランジャーをピペットチップの大きな開口部に挿入します。
3. 10% FBS、1x Glutamax、1x 非必須アミノ酸(NEAA)、10 μM ロック阻害剤、10 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、50 μM β-メルカプトエタノールを添加した 2 mL の sDMEM を含む未処理の 6 ウェル組織培養プレートの 1 つのウェルにチップから放出されるまで、マトリックスプラグを排出します。
   注:組織培養容器と対応する培地の容量は、必要に応じて調整できます。
   注意: NEAA、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびβ-メルカプトエタノールは有害物質であり、適切な個人用保護具を使用してバイオセーフティキャビネット内で取り扱う必要があります。
4. オルガノイドを37°C、5%_CO2、湿度95%で4〜12週間培養します。
5. 5日ごとに培地の半分を交換してください。
   注:オルガノイドが組織培養プレートに付着し始めたら、新しいウェルに移してください。

4.腎臓嚢移植

1. 滅菌手術器具を準備します。
2. 基底膜マトリックスプラグの嚢下腎移植を実行します。
   1. 8週齢のBALB/c雌レシピエントマウスにイソフルランを投与し、動物倫理ガイドラインに従って麻酔をかけます。
      注意:イソフルランは有害物質です。排ガスは、作業環境への侵入を防ぐために清掃する必要があります。
   2. マウスを右横置きにします。
   3. 手術部位の毛を剃り、施設のガイドラインに従って皮膚を消毒します。
      注意: 手術部位は、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースとアルコールベースのスクラブを交互に使用して円を描くように3回消毒することをお勧めします。
   4. 脊椎に垂直に皮膚を2cm切開し、腹壁を露出させます。
      注意: 皮膚の切開には、細かい手術用ハサミまたはメスの刃を使用できます。使用者は、施設の動物倫理ガイドラインまたは標準作業手順に従う必要があります。
   5. 腎臓の上の腹壁に0.5cmの小さな切開を行います。
      注:切開は、移植中に腎臓が外部化されたままになるように、腎臓の幅に近づける必要があります。
   6. 親指と人差し指を使って下向きの圧力をかけることにより、腹膜開口部から腎臓を外部化します。一対のリングピンセットを使用して、外在化を補助することができます。綿棒を使用して滅菌PBSを定期的に塗布することにより、手順全体を通して腎臓が湿っていることを確認してください。
   7. 実体顕微鏡下で、腎臓の片方の極にある一対の曲がった超微細鉗子で腎臓嚢の腎周囲脂肪をつまみます。2組目の曲がった超微細鉗子を使用して、腎臓嚢膜を反対方向に上向きにそっと引き裂き、小さな開口部を作ります。
   8. 片方の鉗子の突起をカプセル膜の下に慎重に挿入します。ゆっくりとしたスイープ動作を使用して、カプセル膜を腎臓実質から分離します。
   9. ピペットチップから実験用フィルムを剥がして、移植用の基底膜マトリックスプラグを準備します。
   10. 鉗子の片方のプロングを使用して腎臓カプセルを持ち上げ、ピペットチップを開口部に挿入し、腎臓の反対側の極に向かって押します。.
   11. ワイヤープランジャーをピペットチップに挿入し、マトリックスプラグを排出すると同時に、ピペットチップを腎臓から引き出します。
   12. PBSで腎臓を湿らせ、再内在化します。
   13. 腹壁を5-0 Vicryl縫合糸1本で閉じ、オートクリップ2本で皮膚を閉じます。
   14. 鎮痛剤(0.05-0.1 mg / kgのブプレノルフィンを皮下投与するか、施設動物倫理ガイドラインに従って投与します)。.
       注意: ブプレノルフィンは有害物質であり、適切な個人用保護具で取り扱う必要があります。
3. イソフルランの流れを止めますが、酸素の流れはオンのままにして、マウスが意識を取り戻し始めるまで純粋な酸素を呼吸できるようにします。
4. マウスをケージに戻します。回復中は、ケージを加熱パッドの上またはヒートランプの下に部分的に置いて動物を暖かく保ち、マウスが麻酔から完全に回復するまで監視します。
5. 最初の2週間、または施設のガイドラインで要求されているように、術後の回復を監視します。

結果

細胞凝集は、細胞間の接触とシグナル伝達を促進するために重要です。基底膜マトリックス内に細胞凝集体を包むことで、 in vitro 組織オルガノイド形成のための3次元培養と、移植片移植のための腎カプセルへの細胞の機械的送達の両方が容易になりました。これらの構造を確立するために、まず基底膜マトリックスを氷冷条件下で流動状態に維持しました。その後、濃縮された細胞懸濁液を上に重ね、遠心力を利用して細胞を高密度マトリックスに押し込むことで、細胞凝集を達成しました。遠心分離速度(200-2000 x g)の最適化は、中間層のセルポジショニング(図1A)を達成するために必要であり、これも細胞数に依存していました。より高い遠心力(>500 x g)は、細胞をピペットの先端まで押し出し(図1B)、柔軟な実験用フィルムカバーの除去中に失われる可能性のある細胞数が小さい(つまり、<5 x 10⁵)には注意が必要です。逆に、G力が低すぎる場合(≤200 x...

ディスカッション

半固体培地内での新生児脾臓細胞の凝集は、脾臓構築物を生成するための実行可能な方法である。同様の基底膜マトリックスベースのプロトコルが、3次元脾臓培養を開始するために使用されている¹⁰。ここでは、脾臓構造物が in vitro オルガノイド培養システムと in vivo 移植モデルに等しく従順であることを実証します。注目すべきは、 in vitro 培養脾臓オルガノイドの移植はまだテストされていないことですが、脾臓組織の完全または部分的な再生能力を決定することは興味深いことです。このプロトコルはまた前の脾臓の移植の調査⁸で記述されているセル凝集の技術を受継ぐ。これらの研究では、コラーゲンシート上に細胞凝集体をロードし、腎臓嚢の下に移植しました。基底膜マトリックス内に細胞凝集体を包み込むことは、コラーゲンシート側を下向きにした場合と細胞凝集体側を下向きにした場合の移植に伴うばらつきが排除される、移植片の配向という点で明確な利点があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルポリプロピレン1.2 mLクラスターチューブ	コーニング	CLS4401	14 mlコニカルチューブ内に置くため
B-メルカプトエタノール	Gibco	21985023	ストック 55 mM、50 uMで使用
ラゲナーゼD	Roche	11088858001
コラゲナーゼIV	Sigma-Aldrich	C5138	Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I(DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	デオキシリボヌクレアーゼ I ウシ膵臓由来、II-S 型、凍結乾燥粉末、タンパク質 ≥80%≥2,000単位/mgタンパク質
ダルベッコ'のモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L グルコース、L-グルタミン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウムなし、液体。滅菌フィルター付き。
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	塩化カルシウムと塩化マグネシウムなし、滅菌ろ過された
Eclipse 200 μl ピペットチップ	Labcon	1030-260-000	ベベルポイント
ウシ胎児血清 (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	ストック100X、1X
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	で	15140122ストック10,000ユニット/ mlペニシリン、10,000 ug / mlストレプトマイシン
可逆細胞ストレーナーSTEMCELL	Technologies	27216	70 μm
リングピンセット	NAPOX	A-26	リングサイズ:3 mm
ロックインヒビター (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
サーモフィッシャー ヘレウス メガフュージ 40R 遠心分離	サーモフィッシャー		加速速度と減速速度は 8 個に設定しました
ファインピンセット	EMS	78340-51S	スタイル51S。耐磁性/抗酸SA低炭素オーステナイト鋼ピンセットは耐腐食性があります。アンチグレアサテン仕上げ。
Vicryl 5/0縫合糸Ligapak	Ethicon	J283G
Wiretrol IIロングワイヤープランジャー	モンド	5-000-2002-L	ステンレス鋼プランジャー、25&50 &L/WRTL II, ロング
傷クリップアプラ	イヤーMikRon	427630
傷口クリップ	MikRon	427631	9 mm

コから使用 機 ウルトラリールドラ