Method Article

ラットex vivo肺灌流モデルにおける次世代重合ヘモグロビンベースの酸素キャリアを用いた代替灌流ソリューションの探索

DOI:

10.3791/66702

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June 14th, 2024

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1COPPER Laboratory, Department of Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 3William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, College of Engineering, The Ohio State University

In This Article

Summary

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ここでは、重合ヒトヘモグロビン(PolyhHb)ベースの酸素キャリアを灌流液として適用する方法と、この灌流溶液をラット のex vivo 肺灌流モデルで試験できるプロトコルについて説明します。

Abstract

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肺移植は、適切なドナーの不足によって妨げられています。以前は、限界的または不十分であると考えられていたドナーは破棄されていました。しかし、 ex vivo 肺灌流 (EVLP) などの新しくエキサイティングな技術により、肺移植提供者は限界ドナー同種移植片に対する評価を延長できます。このダイナミックな評価プラットフォームにより、肺移植が増加し、医療提供者は以前は廃棄されていたドナーを使用できるようになったため、ドナープールが拡大しました。現在の灌流技術は、細胞性灌流または無細胞性灌流物を使用しており、どちらにも明確な長所と短所があります。灌流組成物は、恒常性を維持し、適切な代謝サポートを提供し、炎症と細胞死を減少させ、最終的には臓器機能を改善するために重要です。灌流溶液には、適切な膠質浸透圧を維持するために十分なタンパク質濃度が含まれている必要があります。しかし、現在の灌流溶液は、肺内皮を介した体液の血管外漏出につながることが多く、不注意による肺水腫や損傷を引き起こします。したがって、適切な細胞恒常性を維持しながら過度の損傷を防ぐ新しい灌流ソリューションを開発する必要があります。ここでは、重合ヒトヘモグロビン(PolyhHb)ベースの酸素キャリアを灌流液として適用する方法と、この灌流溶液をラットEVLPのモデルで試験できるプロトコルについて説明します。この研究の目標は、肺移植コミュニティに、新しい灌流ソリューションの設計と開発における重要な情報と、臨床的に関連するトランスレーショナル移植モデルでそれらをテストするための適切なプロトコルを提供することです。

Introduction

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固形臓器移植の他の分野と同様に、肺移植はドナー臓器の不足に悩まされています。ドナープールを増やすために、かつて移植に適さないと考えられていた同種移植片、すなわち拡張基準ドナー(ECD)の可能性を調査するために重要な研究が捧げられてきました。これらの同種移植片は、疑わしい品質、機能の低下、感染、外傷、長期にわたる温かくまたは寒い虚血性時間、高齢など、さまざまな理由でECDと見なすことができます1,2。場合によっては、これらの肺が即時移植3に適している場合、これらの肺をさらに評価して移植への適合性を判断することは、提供者とレシピエントの両方にとって有利であることがよくあります。Ex vivo 肺灌流 (EVLP) は、ドナー 2,4,5,6,7 の外部の閉回路で潜在的な肺同種移植片の拡張評価を可能にする技術であり、移植提供者が移植の適合性を判断できるようにします。EVLPは、ドナー臓器8,9,10,11を適切に評価する能力を示しており、虚血性再灌流障害(IRI)12,13の影響を減らし、ドナープール14,15を増加させることで、肺移植をすべての人にとってよりアクセスしやすい治療法にしています。

一般に、EVLPシステムは、換気回路(人工呼吸器を気管に接続してシステムに空気を導入することによって実現される)と血管回路(左心房(LA)を肺動脈(PA)にチューブで接続することによって実現される)を備えた閉鎖システムです7。血管回路には、冷却虚血時間(CIT)5,8,16,17を制限しながら、肺に重要な栄養素と酸素を供給するために、チューブを通って灌流液が流れています。この溶液は、血液ベース(すなわち、パック赤血球(PRBC)の添加による)16,17または無細胞ベース(すなわち、PRBCなし)4,5のいずれかである。ただし、PRBC を使用することにはいくつかの顕著な欠点があります。外傷または脳死ドナー(BDD)で死亡したドナーからのPRBCを使用する場合、これらの液体には炎症性サイトカインが大量に含まれていることが多く、EVLP中の細胞損傷を増加させるだけでなく、細胞にさらなる損傷を与える無細胞ヘモグロビン(Hb)、ヘム、鉄、および細胞断片のレベルを上昇させる可能性があります18,19.さらに、これらのドナーは多臓器であることが多いため、調達前にPRBCを収集すると、ドナーの血液量が減少し、その結果、すべての臓器の虚血が増加する可能性があります。別の供給源からのPRBCを使用する場合、これはそれ自体が希少な材料であるため、プロバイダーは血液不足に直面する可能性があります20,21。最後に、PRBCは、その発生源に関係なくEVLP回路上で機械的に溶解する傾向があり、Hbや細胞損傷の原因となる他の成分を放出します。

したがって、多くの理由から、灌流サプリメントとして人工赤血球代替品、すなわちヘモグロビンベースの酸素キャリア(HBOC)を使用することが有利になる可能性があります。特に有望なHBOCの1つは、重合ヒトヘモグロビン(PolyhHb)です。PolyhHbは、即時輸血に適さないと判断された期限切れのPRBCから精製されたHbから合成されます22。それらは、出血性ショック23および移植24において生存可能な血液代替品であることが示されており、大量に産生することができる22。しかし、PolyhHb の大規模な採用は、血管収縮、血圧上昇、心停止などの予期せぬ合併症のために失敗しています23,25。これらの発見の背後にある理由は、PolyhHb溶液中に無細胞Hbまたは低分子量Hbポリマー(<500kDa)が存在するためである可能性が高く、組織空間に血管外漏出する傾向があり、その結果、一酸化窒素の利用可能性が低下し、その後の血管収縮、全身性高血圧、そして最終的には酸化的組織損傷がもたらされました26,27。.これらの問題を改善するために、パーマー研究所は、最小限の低MW種と無細胞Hbを含む次世代のPolyhHbの開発に取り組んでおり、生物物理学的特性とin vivo応答の改善が実証されています22,28,29,30。動物でのいくつかの輸血研究では、低分子量HbポリマーがHBOCから排除されると、血管収縮、全身性高血圧、および酸化的損傷を軽減できることが示されています28,29,31,32,33,34,35。したがって、この次世代のPolyhHbは有望な灌流剤候補となっています。

ここでは、灌流液に使用する次世代PolyhHbのアプリケーションと、この灌流溶液をラットEVLPのモデルで試験するためのプロトコルについて説明します。この研究の目標は、肺移植コミュニティに新しい灌流ソリューションの設計と開発における重要な情報を提供するとともに、臨床的に関連するトランスレーショナル移植モデルでそれらをテストするためのプロトコルを提供することです。

Protocol

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Sprague-Dawleyラット(体重300g)は、オハイオ州立大学ウェクスナー医療センター動物施設で病原体のない条件下で商業的に入手され、飼育されました。すべての手順は、NIHおよびNational Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animalsに従い、オハイオ州立大学施設動物管理および使用委員会(IACUC Protocol 2023A00000071)の承認を得て、人道的に行われました。

1. PolyhHbの合成および精製

注:以下のEVLP実験に使用されたPolyhHb材料の製造と合成は、2020年にCuddingtonらによって最初に発表されました22。PolyhHb合成の詳細な回路図と解析については、この資料を参照してください。以下は、パイロットスケールでのPolyhHbの合成と精製、およびその後の灌流剤としての調製についてまとめたものです。

  1. RBC洗浄、溶解、およびHb精製
    1. 18ユニットの呼気満了ヒトPRBCを調達し、20Lのろ過容器に注ぎ、0.9 wt%生理食塩水で希釈して最終ヘマトクリットを22%にします(図1B、C)。
    2. 0.65 μm の変性ポリエチレンスルホン(mPES)タンジェンシャルフローろ過(TFF)モジュールで、RBC 溶液に 0.9 wt% 生理食塩水を加えて、6 回のシステム容量交換(ダイアサイクル)を行います。注:この洗浄ステップの目的は、溶血前に損傷したRBC、膜片、およびその他の細胞外物質を除去することです(図1B、C)。
    3. RBC溶液を10 Lのリン酸緩衝液(PB、3.75 mM、pH 7.4)で4°Cで1時間、絶えず撹拌しながら溶解します。
    4. 500 kDaのTFFモジュールで溶液をろ過し、30 Lのバッチ反応器容器で透過液を回収することにより、溶解した膜断片と他の凝集体を除去します(図1A-C)。
    5. 480 gのHbが反応器に入ったら、塩チャージを追加してPBをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に変換します。
    6. 窒素が供給されたガスコンタクターを介してHbを再循環させ、反応器内の窒素ヘッドスペースを維持して、タンパク質を一晩脱酸素化します。14°Cに冷却して、メトヘモグロビン(metHb)の形成を制限します。
  2. Hb重合
    1. Hb溶液を生理学的温度(37°C)に加熱しながら、ガスコンタクタループ上で溶液を再循環させます。
      注:目標は、タンパク質を0〜10 mmHgのpO2 に脱酸素化して、Hbの大部分が緊張した四次状態にあることを確認することです(図1A)。
    2. 必要に応じて、ジチオン酸ナトリウムを1 gチャージして、効果的な脱酸素を確保します。
    3. 再循環ループを維持し、Hb溶液を脱気しながら、3 Lの脱酸素PBS(pH 7.4)で希釈したHbに対して、グルタルアルデヒド(GA)を30:1モル比で加えます。
    4. 反応器容器に溶液を3時間以上加え、さらに1時間の反応時間を設けます。
    5. シアノ水素化ホウ素ナトリウムとGAのモル比7:1で、3 L PBS(pH 7.4)で希釈して架橋反応をクエンします。反応器に10分以上加えます。
    6. 原子炉を14°Cで一晩冷やします。
  3. PolyhHbの精製
    1. 反応器の内容物を10 Lのろ過容器にポンプで送り込み、0.2 μmのポリエチレンスルホン(PES)TFFモジュール(ステージ1)を介して循環を開始します。この手順により、大きな骨材と望ましくない汚染物質が除去されます。
    2. 透過液を二次10Lろ過容器に供給し、満杯になると500 kDaのポリスルホン(PS)TFFモジュール(ステージ2)上を循環します。原子炉が空になるまで続けます(図1B、D)。
    3. リアクターが精製回路に空になったら、ステージ1で修飾乳酸リンゲル液(pH 7.4)と賦形剤交換を開始します。各全体積交換後、紫外可視分光法を使用してステージ1の透過液中のタンパク質濃度を測定します。
    4. ステージ1の透過液の濃度が1 mg Hb / mL未満の場合は、修飾したリンゲル液をステージ2に移します。.ステージ1でのホールドアップは無駄であり、適切に廃棄する必要があります。合計で、修正されたRingerの溶液の全量交換が両方のステージで12回行われることを確認します。
    5. ダイアサイクルの完了後、ステージ2の内容物を500kDaのTFFモジュールに少なくとも10g/dLまで濃縮します。
    6. 濃縮溶液を50mLのコニカルチューブに包装し、使用するまで-80°Cで保存します。

2.灌流剤の処方

  1. 灌流液を最終容量165mLまで調製します。PolyhHbをWilliam's E Mediumで最終濃度3.7 g/dLに希釈します。
  2. ヒト血清アルブミン(HSA)を最終濃度3%HSA重量まで添加します。最終溶液にヘパリン1mLを加えます。

3. Ex Vivo 肺灌流回路のセットアップ

  1. PolyhHb灌流液をEVLP回路リザーバーに入れ、温水浴を37°Cにオンにします。 ローラーポンプをオンにして、灌流液が回路内を循環していることを確認します。
  2. 脱酸素ガス(つまり、6%O2、8%CO2、84%N2)を中空糸酸素化器に接続して、灌流液を脱酸素します。これは、灌流液を酸素化する肺の能力を評価するために行われます。
  3. 近くのコンピュータでデータ集録ソフトウェアを開きます。肺動脈圧、気管差圧、呼吸流量差圧、肺重量、およびポンプ速度トランスデューサが回路とデータコンバータボックスの両方に接続されていることを確認します。
  4. すべてのチューブ接続を注意深く調べて、システム全体に漏れがないこと、および温水が全体に循環していることを確認します(図2)。データ収集ソフトウェアの Run を押して、すべての圧力トランスデューサが機能していることを確認します。システムが適切に機能したら、ローラーポンプの電源を切ります。

4. ドナーラット肺ブロックの調達

  1. 手術台を設置し、器具をレイアウトします(図3)。すべての機器を121°Cで30分間オートクレーブします。
  2. 1200 U / kgのヘパリン、麻酔薬用のケタミン/キシラジン混合物(60 mg / kgケタミンおよび5 mg / kg)、および5〜10 cmの長さの絹縫合糸(3-0または4-0)を準備します。
  3. ケタミン/キシラジン溶液を腹腔内にラットに注射します。.麻酔面が発達するまで5〜10分待ちます。適切な麻酔レベルを確保するために、ラットをつま先でつまんで反応を引き出します。反応がない場合は、適切な麻酔レベルが満たされています。
  4. ラットの腹部を剃り、ラットを手術ボードの仰臥位に置きます。ポビドンヨードと70%エタノールで腹部を洗浄します。乾燥を防ぐために、ラットの目の下に眼科用軟膏を置きます。.
  5. ラットを手術用ボードに移動し、ラットを所定の位置に固定します(図4A)。データ集録ソフトウェアの電源を入れ、録音を開始します。4 mL/kg で人工呼吸器をオンにし、呼気終末陽圧 (PEEP) が約 2 cm/H2O であることを確認します。
    注:これらの初期設定は実験固有です。個々の実験に最適な換気戦略を決定するのは、すべての研究者に委ねられています。
  6. 適切な麻酔の深さが満たされたら、はさみを使用して剣状突起から恥骨結合までの正中線開腹術を行います。次に、内側外側内臓回転を行い、鈍器械(IVC)36,37,38を用いて肝臓下下大静脈を可視化する(図4B)。20Gの針でIVCにヘパリンを注入します(図4C)。
  7. 首に注意を向け、ハサミで胸骨のノッチから下顎の角度のすぐ下まで皮膚を切り取ります。次に、気管に向かって解剖を開始します(図5A)。
  8. 首で、気管を露出させるために必要なストラップの筋肉をぶっきらぼうに解剖します(図5B)。気管内(ET)チューブ(数ミリメートル)に十分な大きさの軟骨リングの間の前気管にハサミで横切開を行いますが、気管の後部を切開しないでください。気管の周りに5-0シルク縫合糸を配置します(図5C)。
  9. 気管内チューブを挿入し、前述の5-0シルク縫合糸で所定の位置に固定します(図5D)。ETチューブを人工呼吸器に接続し、適切な胸部の上昇を確認します。
  10. 胸骨正中切開術を行い、ハサミを使用して再び胸腔に入ります。胸壁リトラクターを配置して、心臓と肺を露出させます(図6A)。肺は信じられないほどもろいので、肺の不注意な操作は避けてください。
  11. 鋭利な(はさみ)と鈍い解剖の組み合わせにより、前縦隔から胸腺を取り除きます。大きな血管や肺を傷つけないように注意してください。
  12. 肺動脈(PA; 図6B)そして、カニューレ挿入の準備をするために、その周りに5-0シルク縫合糸を置きます(図6C)。ラットの大血管の顕微鏡的な解剖学的構造により、PAと大動脈の周囲に縫合糸を同時に配置する方が容易であることがよくあります。
  13. はさみ(図2D-E)を使用して右心室流出トラック(RVOT)に6〜6mmの切開を行い、動脈カニューレをPA内に配置し、前のステップで説明した5-0縫合糸で所定の位置に固定します(図6F)。
  14. はさみを使用して、左心室 (LV) と肝下 IVC に 5 mm の切開を行い、ラットを安楽死させます。肺保存液を動脈カニューレにすばやく接続して、肺を約20mLで重力洗浄します(図7A-B)。肺保存液は動脈カニューレに接続する前に、空気塞栓が肺に非常に損傷を与えるため、肺保存液が空気を抜いていることを確認してください。
  15. 動脈カニューレをEVLP回路に接続します。ローラーポンプをオンにし、少量の灌流液が肺を通って左心室から胸腔に流れ込むのを待ちます。灌流液が左心房から流れ出始めたら、ローラーポンプをオフにします(図7C)。灌流液を流す際には、PAの圧力が急上昇しないようにしてください。これは、詰まりや誤った配置を示しています。
  16. 小さな鉗子をLVに置き、僧帽弁輪を静かに伸ばすと、左心房(LA)カニューレが導入されます(図8A)。5-0シルクネクタイを心臓の周りに置き、ゆるく結びます(図8B)。
  17. LAカニューレをLVに挿入し、アトリウム内に見えるまでLAカニューレを進めます。事前に結ばれた5-0縫合糸でLAを固定します(図8C)。
  18. 食道を特定し、横隔膜のできるだけ近くで止血器で固定します。止血器の下の食道を切って、胸腔にこぼれないようにします(図9A)。
  19. 脊椎をガイドとして使用して、はさみを使用して、心肺ブロックを周囲の構造に接続するすべての靭帯アタッチメントを切断します(図9B)。心肺ブロックが自由に可動するようになったら、首から気管を解剖し、最後にハサミを使用してETチューブの上の気管を切断し、心肺ブロックを解放します(図9C)。
  20. 心肺ブロックをEVLP回路内の胸部ジャケットに移動し、LAカニューレをEVLP回路に取り付けます(図9D)。ローラーポンプをオンにし、ベンチレーターモニターを接続します。
  21. バブルトラップをチェックして、システムに空気塞栓が導入されていないことを確認します。
  22. 最初の15分間36,37,38の間に、換気と灌流の設定を希望の実験レベルにゆっくりと変更します。さらに、この最初のランプアップフェーズでは、灌流流量を目的の速度および/または圧力まで増やします。
  23. 実験指定の時点で、灌流ガスレベルと肺機能検査を確認してください。

Results

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当社のPolyhHbベースの灌流液の検証、さらにこの灌流液の数時間にわたる安定性を図10に示します。最初の1時間で、試験したすべての灌流液(PolyhHb、コントロール(Williams Media + 5% HSA)、RBCベース)では、LA pO2(Post pO2)がわずかに減少しました。しかし、RBCベースの灌流液は、PolyhHbと比較して1時間で有意な減少を示しました(p < 0.05)。その後数時間にわたって試験したところ、PolyhHb 灌流液とコントロール灌流液の LA pO 2 は安定していましたが、PolyhHb は pO2 が高いという有意でない傾向(p > 0.05)を示しました(図 10A)。デルタpO2、すなわちPA pO2からのLA pO2の変化は、RBC灌流群(p < 0.05)では1時間後に再び有意に減少しましたが、PolyhHbおよびControl灌流では安定しており、PolyhHbグループではpO2が高い(p>0.05)という有意でない傾向(p 0.05)を示しました(図10B)。LA pCO2 は、最初の 1 時間後の PolyhHb 灌流水と比較して、RBC 灌流液とコントロール灌流液で有意に低く (p < 0.05)、これは PolyhHb とコントロール灌流水を比較すると、次の数時間にわたって当てはまりました (図 10C)。最後に、デルタpCO2(すなわち、PA pCO2からのLA pCO2の変化)は、1時間後にRBC灌流液で有意に増加し(p < 0.05)、数時間後にはPolyhHb灌流液とコントロール灌流液の両方で安定なままでした(図10D)。

取得ソフトウェアを通じて収集されたリアルタイムの肺生理学的データは、灌流ガスレベルを補完する情報を提供します(図11)。肺血管抵抗(PVR)は、RBC灌流液が最初の1時間で有意に増加したことを再度示しました(p < 0.05)。残りの数時間にわたって、PolyhHb 灌流液とコントロール灌流液の PVR は安定しており、PVR は低かった(図 11A)。肺重量の変化は、最初の1時間でRBC灌流液でも有意に増加し(p < 0.05)、残りの時間でPolyhHb灌流液とコントロール灌流液の両方で増加し、PolyhHb灌流液の重量がわずかに増加しました(図11B)。最後に、RBC灌流群では最初の1時間以内にコンプライアンスが有意に低下しました(p < 0.05)、PolyhHbおよびコントロール灌流液では有意な減少はなく(p > 0.05)、4時間後にPolyhHbが最もコンプライアンスが高かった(図11C)。

技術的な成功と失敗(図12)の観点から、注意を引くべき重要な点がいくつかあります。図12Aでは、肺血管系内の血栓の可能性による右上葉壊死による同種移植片の失敗を見ることができます。図12Bでは、右葉内にも重度の組織浮腫があり、実験の失敗につながっていることに気づきます。図12C-Eは、それぞれの実験条件内での適切な組織の保存および外観を示す。最後に、図12Fでは、肺保存溶液でフラッシングした後の理想的な組織保存を見ることができます。

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図1:パイロットスケールでのPolyhHbの合成と精製。 (A)重合用バイオリアクター。(B)タンジェンシャルフローフィルトレーション(TFF)プロセスは、4°Cの冷蔵庫でセットアップされます。(C)赤血球(RBC)洗浄とヘモグロビン(Hb)精製のための並行TFFセットアップのクローズアップ。(D)PolyhHb精製のための2段シリーズTFFシステムのクローズアップ。ステージ1とステージ2の容器は、それぞれフィルターの左側と右側に配置されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:Ex vivo lung perfusion(EVLP)回路の概要(A)EVLP回路の概略図。(B)肺動脈カニューレと左心房カニューレのin vivo留置。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3: ex vivo 肺灌流に使用される手術器具。 (A)絹の縫合糸。(B)先端の細い鉗子(中の長さ)。(C)先端の細い鉗子(長い長さ)。(D)湾曲した先端の細い鉗子。(E)マヨハサミ。(F)気管カニューレ。(G)肺動脈(PA)カニューレ。(H)左心房(LA)カニューレ。(I)胸郭リトラクター。(J)スプリングハサミ。(K)デベイキー鉗子。(L)止血剤。(M)小さなハサミ。(N)小さく湾曲した細い先端の鉗子。(O)広告ピックアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:下大静脈(IVC)の外科的位置決めと露出(IVC)(A)肺調達のためのラットの位置決め。(B)肝下IVCの露出。(C)IVCをカニューレし、27G針でヘパリンを注入します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:気管内(ET)チューブで気管をカニューレします。 (A)首の部分の皮膚を切ることから始めます。(B)ストラップの筋肉と結合組織を解剖して気管を露出させます。(C)ETチューブに十分な大きさの軟骨輪の間の前気管に横切開を行います。(D)ETチューブを気管に挿入し、シルク縫合糸で所定の位置に固定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:肺動脈カニューレの配置(A)胸腔を露出させて心臓と肺を視覚化する。(B)PAを特定し、それを分離する。(C)PAの周りに縫合糸を配置します。(D)PAカニューレ用の右心室流出路(RVOT)に小さな穴を開けます。(E)PAの内側のPAカニューレの適切な配置。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:保存液で肺を洗い流す(A)フラッシュカニューレを肺動脈(PA)カニューレに接続する。(B)左心房(LA)から透明な液体が出てくるはずです。(C)PAカニューレをex vivo肺灌流回路に接続して、PAカニューレの適切な流れと配置を確保します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図8:左心房(LA)カニューレの配置(A)。一対の鉗子で僧帽弁輪を穏やかに拡張します。(B)左心室(LV)の周りに絹の縫合糸をゆるく配置します。LAカニューレを左心房内に配置。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図9:心肺ブロックの抽出(A)止血板の下の食道の結紮。(B)解剖により、心肺ブロックが脊椎から解放されます。(C)気管を解剖します。(D)ex vivo肺灌流(EVLP)カニューレの適切な接続と配置。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 10.時間の経過とともにガスレベルを灌流します。(A) ポスト pO2、すなわち左心房 (LA) pO2、4 時間以上の灌流。(B)デルタpO2、すなわち、4時間の灌流にわたる肺動脈(PA)pO2からのLA pO2の変化。(C)pCO2、すなわちLA pO2を4時間灌流して後処理する。(D)デルタpCO2、すなわち、4時間の灌流によるPA pO2からのLA pO2の変化。青はPolyhHb灌流液、黒はコントロール灌流液(標準ウィリアムズ培地)、赤はRBCベースの灌流液を表します。グループあたり N=6。エラーバーは標準偏差を示します。有意性はスチューデントのT検定を使用して検定され、*、p、<0.05で表されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 11.リアルタイムの肺生理学的データ。 (A) 4 時間にわたる再灌流による肺血管抵抗 (PVR)。(B)経時的な肺重量の変化(Δで表される)。(C)4時間以上の再灌流に対するコンプライアンス。青はPolyhHb灌流液、黒はコントロール灌流液(標準ウィリアムズ培地)、赤はRBCベースの灌流液を表します。グループあたり N=6。エラーバーは標準偏差を示します。有意性はスチューデントのT検定を使用して検定され、*、p、<0.05で表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図12:代表的な技術結果 (A)右上葉梗塞による移植片の欠損。(B)重度の右葉浮腫による移植片の失敗。(C) RBC 灌流液による肺同種移植片のカニューレ挿入と灌流の成功。(D)PolyhHb灌流液による肺同種移植片のカニューレ挿入と灌流の成功。(E) 標準灌流液による肺同種移植片のカニューレ挿入と灌流の成功。(F)肺保存液によるフラッシング後の理想的な組織保存。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

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灌流ソリューションの開発とテストは、世界中の多くの人々が着手している斬新な試みです。伝統的に、標準的な灌流剤は、虚血時間を中断し、虚血に伴う損傷を軽減する能力、および再灌流18を提供します。しかし、EVLPの次の進化は、現在の灌流技術を改善し、修復および再調整療法を組み込むことです39,40,41,42,43。

この研究で説明されたPolyhHbは、材料が回路から肺に血管外漏出するのを防ぐために、500kDaから0.2μmの間で括弧で囲まれており、血管収縮とPA圧力の上昇を防ぎます30。この合成の重合ステップ全体を通じて、酸素分圧(pO2)が目的の酸素親和性PolyhHb生成物の適切な値に維持されることが重要です。これには、反応全体を通じて添加されるすべての溶液(架橋剤、クエンチング溶液など)で、バイオリアクターに適合するpO2を持つ(すなわち、窒素で脱気された、酸素化されたものなど)ものが含まれます。この合成手順の主な利点は、最終製品が、異なる酸素要求量を持つさまざまなアプリケーション(すなわち、輸血薬のための低酸素親和性PolyhHb、肺灌流のための中等度の酸素親和性、または標的酸素送達のための高酸素親和性)を可能にするために、変更可能な酸素平衡を有することである。また、バイオリアクターには、接触点への過度の加熱を引き起こして損傷したタンパク質の形成を引き起こさないように、加熱メカニズムがあることを確認することも重要です。その結果、容器全体に銅コイルを張った方が、容器の外側にある断熱ヒーティングジャケットよりも均一でダメージの少ない加熱/冷却が可能であることが分かりました(図1A)。

EVLPラットモデルの開発は新しいものではありませんが、結果の改善につながる可能性のあるいくつかの領域に注目しています。まず、循環を通じて肺に入る可能性のある追加の空気がないように、犠牲にIVCに小さな切開を行う必要があります。肺同種移植片を肺保存液で洗い流すと、肺の均一な淡い白色がマイクロサージョンに、調達プロセスの技術的成功があることを知らせます。実質内にまだピンク色の肺がある場合は、肺全体が均一に灌流されるようにPAカニューレを調整することをお勧めします。PAカニューレは、多くの場合、手順の完了が簡単な部分ですが、LAカニューレの導入は少し難しくなります。LAカニューレをLAに到達するためには、常に僧帽弁輪を拡張する必要があります。ただし、心室や心房に穿孔しやすいため、これには細心の注意を払って行う必要があります。カニューレの先端が心房内に入ると、心室の周りの縫合糸を固定する際に、カニューレがずれてしまうことがよくあります。多くの場合、テーブルの角度を調整する(より水平にする)か、カニューレの下部にガーゼを置いて所定の位置に留まる必要があります。

制限
このモデルにはいくつかの制限があります。灌流剤の有効性と潜在的な同種移植片を改善する能力を評価することは有用ですが、これは、異なる灌流剤や技術の in vivo 結果を教えてくれる移植モデルではありません。さらに、PolyhHbはエキサイティングな新しい灌流技術ですが、この技術の広範な採用を検討する前に、その使用、有効性、および潜在的な制限を、追加の前臨床および臨床灌流実験でさらに実証する必要があります。

結論
ここでは、次世代のPolyhHb灌流液の応用と、この灌流溶液をラットEVLPのモデルで試験するためのプロトコルを実証しました。灌流技術が進歩するにつれて、従来の灌流30の潜在的な代替品としてPolyhHbを使用する可能性を探求することが有利になるだろう。前世代のPolyhHbは、その組成に基づいて有害な副作用を引き起こしてきました。しかし、合成の改良により、血管外漏出、浮腫を引き起こし、したがって細胞損傷を引き起こす可能性が低いポリマーが作成されました30。PolyhHbを使用すると、RBCを必要とせずにEVLPを実行しながら、肺同種移植片の代謝要求を満たすことができます。これにより、 ex vivoでの同種移植片機能が向上することは間違いありません。しかし、前臨床と臨床の両方の設定でPolyhHbのさらなる検証が必要です。このプロトコルが、新しい灌流ソリューションの設計と開発における重要な情報と、臨床的に関連するトランスレーショナル移植モデルでそれらをテストするための適切なプロトコルを肺移植コミュニティに提供することを願っています。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品で提示されている資料については、A.F.P.、A.G.、およびC.C.は、米国特許出願PCT/US2022/041743の発明者です。A.F.P.、C.C.、B.A.W.、S.M.B.は、米国特許出願PCT/US2023/017765の発明者です。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、ジュエル・アンド・フランク・ベンソン・ファミリー基金とジュエル・アンド・フランク・ベンソン研究教授職の多大な支援を受けました。B.A.W.は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01HL143000によって部分的にサポートされています。AFPは、NIHの助成金R01HL126945、R01EB021926、R01HL131720、R01HL138116、および米国陸軍医学研究および資材司令部の助成金W81XWH1810059によってサポートされています。S.M.B.はNIH R01 DK123475でサポートされています。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 ccインスリン注射器 29 G x 1/2 "針B-D309301
30 L ガラスバッチバイオリアクターAce Glass
30g 針Med 針BD-305106
バイトリル(エンロフロキサシン)抗菌錠エランコNA
塩化カルシウム二水和物 (CaCl2.2H2O)シグマ アルドリッチ10035-04-8改良型リンガー乳酸
CFBA キャリア周波数ブリッジ増幅器 タイプ 672ハーバード装置731747
コネクト キット D150コール・パーマー VK 73-3763
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - 角度付き 45°ファインサイエンスツール11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water HeaterLaudaLCK 1879
期限切れのヒト白血球減少、パックされたRBCユニットWexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
ForcepsFine Scienceツール11027-12
グルタルアルデヒド (C5H8O2 70 wt%)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito HemostatRoboz SurgicalRS-7112
Heparin 30,000 units per 30 mlAPP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)OctaPharma Plasma灌流液
IL2チューブセットハーバード装置733842
IPL-2 基本肺灌流システムハーバード装置
ケタミン 5 ml あたり 500 mgJHP 医薬品
左心房カニューレハーバード装置730712
Liqui-Cel EXF シリーズ G420 メンブレン コンタクタ3MG420ガス接触器
低カリウムデキストラングルコース溶液(perfadex)XVIVO溶液で肺を洗い流す
Masterflexプラチナコーティングチューブ(サイズ:73,17,16,24)コールパーマーN
-アセチル-L-システイン(NALC、C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1(A7250)修飾リンゲル乳酸
Nalgene血管(10L、20L)NalgeneFiltration vessels
蠕動ポンプ イスマテック ISM 827B
PES、0.65 µm TFFモジュールRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
ポリエーテルスルホン(PES)、0.2 & micro;m TFFモジュールRepligenN02-S20U-05-N
ポリスルホン(PS)、500 kDa TFFモジュールRepligenN02-P500-05-N
塩化カリウム(KCl)Fisher Scientific7447-40-7PBS
PowerLab 8/35用 ADInstruments730045
Pulmonary Artery cannulaHarvard Apparatus730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube 眼科軟膏DechraNA
はさみファインサイエンスツール14090-11
灌流用SCPサーボコントローラー 704ハーバード装置732806
小動物ベンチレーター モデル683ハーバード装置55-000
塩化ナトリウム(NaCl)フィッシャーサイエンティフィック7647-14-5 (S271-10)PBSおよび生理食塩水用
シアノ水素化ホウ素ナトリウム (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
ジチオン酸ナトリウム (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
水酸化ナトリウム (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2変性リンガー乳酸用
乳酸ナトリウム (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1修飾リンガーの乳酸
塩基性 (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4PBS
リン酸ナトリウム一塩基性 (NaH2PO4)Fisher Scientific7558-80-7PBS
SomnoSuite小動物麻酔システム用ケントサイエンティフィックコーポレーションSS-MVGモジュール
Sprague-DawleyラットEnvigo
TAM-Aトランスデューサアンプモジュールタイプ705/1ハーバード装置73-0065
TAM-Dトランスデューサアンプタイプ705/2ハーバード装置 73-1793
TCM 時間制御モジュール タイプ 686ハーバード装置731750
気管カニューレハーバード装置733557
モイストチャンバー用チューブセットハーバード装置nbsp;73V83157
チューブカセットコールパーマーIS0649
ピンセット#5デュモスターケントサイエンティフィックコーポレーション INS500085-A
ピンセット #5 ステンレス鋼、湾曲ケント・サイエンティフィック・コーポレーションIND500232
ピンセット #7 チタン・ケント・サイエンティフィック・コーポレーション 
タイゴンE-3603 チューブ 内径 2.4 mmハーバード 装置721017灌流ライン 肺に入る
タイゴン E-3603 チューブ 3.2 mm 内径ハーバード 装置721019灌流ライン 肺を離れる
Vannas-Tubingen スプリング はさみファイン サイエンス ツール15008-08
VCM 人工呼吸器 制御モジュール タイプ 681ハーバード 装置731741
William's E MediaGibco、ThermoFisher ScientificA12176-01灌流添加剤
キシラジン 1 ml あたり 100 mgAkorn
用添加剤ナトリウム二 &INS600187

References

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