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方法論記事

カエルレインとリポ多糖の腹腔内注射の組み合わせによる重症急性膵炎のマウスモデルの準備

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DOI:

10.3791/66780

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2024年5月10日

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1The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 2Medical College of Anhui University of Science & Technology, 3Endocrinology Department, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 4Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

腹腔内薬物投与は、膵臓損傷を誘発するための安全で効果的な非侵襲的アプローチです。この研究では、マウスに対する5つの異なる腹腔内注射プロトコルを比較して、さまざまな程度の膵臓損傷を誘発し、重度の膵臓損傷のモデルを確立して、重度の急性膵炎(SAP)の病理学的変化と治療戦略を調査しました。

要約

死亡率が高い重症急性膵炎(SAP)の治療は、重大な臨床的課題を提起しています。動物モデルを使用してSAPに関連する病理学的変化を調査することは、潜在的な治療標的を特定し、新しい治療アプローチを探求するのに役立ちます。以前の研究では、主にタビアウロコール酸ナトリウムの逆行性胆管注射による膵臓損傷を誘発しましたが、動物モデルの品質に対する外科的損傷の影響は不明のままです。この研究では、C57BL/6Jマウスの膵臓損傷を誘発するために、さまざまな頻度の腹腔内Caerulein注射とさまざまな用量のLPSを組み合わせて使用し、5つの腹腔内注射プロトコル間で損傷の程度を比較しました。マウスの急性膵炎の誘発に関して、腹腔内注射プロトコルが提案されています 5日以内に80%もの死亡率をもたらします。具体的には、マウスにカエルレイン(50μg/kg)を1日10回腹腔内注射し、続いて最後のカエルレイン投与の1時間後にLPS(15mg/kg)を注射しました。注射された薬の頻度と投与量を調整することにより、膵臓損傷の重症度を効果的に操作できます。このモデルは、強力な制御性を示し、複製サイクルが短いため、高価な機器を必要とせずに、1人の研究者で完成させることが可能です。ヒトのSAPで観察される主要な疾患特性を便利かつ正確にシミュレートし、高い再現性を実証します。

概要

重度の急性膵炎は、消化器系疾患領域1内での急速な発症、急速な進行、および高い死亡率を特徴としています。その高い致死率は、常に臨床研究の顕著な焦点でした。臨床状態の予測不可能な変化、疾患症状の不均一性、ヒト検体の入手可能性の制限などにより、動物モデルの確立は疾患研究にとってますます重要になっています。

総胆管へのタウロコール酸ナトリウムの逆行性注射は、SAP2 のラット モデルを作成するために一般的に使用されます。膵胆道閉塞をシミュレートし、胆汁と膵液の逆流を誘発することにより、このモデリング手法は SAP 動物モデルの複製で高い成功率を示します。ただし、侵襲的な手術は動物モデル自体に影響を与えることに注意する必要があります。さらに、この方法は、主に実験対象として使用されるラットやイヌなどの大型動物に限定されています。十二指腸挿管3、直接十二指腸穿刺4、胆管-膵管5の直接穿刺などの代替技術は、モデリング目的で頻繁に利用されます。

腹腔内注射と食事モデリング法は、あらゆるサイズの動物に適用できる非侵襲的な利点を提供します。コリン欠乏エチオニン(CDE)6の摂食によって誘導されるSAPのマウスモデルは、制御が不十分な高血糖や低カルシウム血症などの特定の合併症を呈するため、新しい診断および治療アプローチの評価には適していません。一方、L-アルギニン7と組み合わせたカエルレインの腹腔内注射は、マウスの急性膵炎を誘発するために最も一般的に使用される方法です。具体的には、カエルレイン(コレシストキニン類似体)の腹腔内反復投与は、病因、炎症、再生過程など、この破壊的な疾患に関連するさまざまな側面を調査するための非常に適切なアプローチを提供します。コレシストキニン(CCK)との構造的類似性により、カエルラインは胆嚢の収縮と膵臓の酵素分泌を効果的に刺激し、酵素分泌の不均衡を引き起こし、その後の自己破壊を引き起こします8。リポ多糖(LPS)は、病原体に関連する分子パターン分子として広く研究されており、腹腔内注射によりカエルレインと組み合わせることで、SAPの効果的なマウスモデルを確立することができます。この組み合わせは、かなりの数の炎症性サイトカインを急速に引き起こして放出し、過剰な局所的および全身的な炎症を引き起こします。いくつかの研究で、LPSと組み合わせたCaeruleinの腹腔内注射によるマウスでのSAPモデルの誘導が報告されています。これは、Caeruleinの腹腔内注射がマウスに膵臓浮腫と出血を引き起こす可能性があるという事実に起因する可能性がありますが、LPSの添加はすぐに膵臓壊死を誘発し、全身性炎症反応、敗血症、さらには臓器不全を悪化させる可能性があります。現在、腹腔内カエルレイン注射の投与量と頻度にはばらつきがあり、追加のLPS投与量にも一貫性がありません。.マウスのSAPモデルで一貫性を達成することは困難です9,10,11,12;したがって、理想的なモデルを得るためには、標準化されたプロトコルを確立する必要があります。この記事では、マウスの腹腔内注射のプロトコルについて説明し、LPSの最適な注射頻度と追加投与量を調査します。

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プロトコル

このプロトコルは、安徽科技大学 (中国、淮南) の第一付属病院の倫理委員会によって審査され、承認されました (倫理コード: 2023-KY-905-001)。この研究は、すべての動物処置における研究用げっ歯類のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに従っています。本研究では、体重20-30gのC57BL/6J成体マウスを用いた。マウスを動物実験室に1週間、制御された条件(約21°C、12時間の昼夜交互サイクル)で飼育しました。マウスは、全体を通して自由に餌と水にアクセスできました。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.動物の調理

  1. 健康なC57BL/6Jマウス84匹を、対照群、膵臓損傷(PI)I、PI II、PI III、PI IV、PI Vの6群に割り付けます。
  2. モデリング手順を開始する前に、マウスの各グループに耳のノッチをラベル付けし、12時間絶食させます。

2. 誘導薬物希釈剤の調製

  1. カエルレイン(1 mg)をPBS1 mLに溶解し、-20°Cで冷蔵します。
  2. 薬物の腹腔内注射の1時間前に実験マウスの体重を測定し、記録します。
  3. 必要なCaeruleinの総質量を、すべてのマウスの総重量に基づいて50μg / kgの比率で抽出します。
  4. 得られたカエルレイン薬を再びPBSで希釈します。
    注:PBS希釈の総量は、すべてのマウスの総重量値の5倍に等しい必要があります。LPS希釈液を得るためにも、同じ希釈法を使用しました。

3.腹腔内注射

注:腹腔内注射は、モデルを誘導するために 、補足表1 に概説されているプロトコルに従ってマウスの各グループに投与されました。さらに10匹のマウスをグループ化して治療し、7日間の生存率を観察しました。

  1. マウスの腹が上を向くようにマウスをつかんで保持し、シリンジを挿入するときに臓器が損傷しないように、頭を尾よりも低く配置します。
  2. マウスの腹部をアルコール75%のコットンボールで消毒します。
  3. 注射器を右手に持ち(≤0.5/≥0.3の針を使用)、腹部の白い線の左側のいずれかの皮下皮膚に針を挿入します。
    注:次の注入のために右側に変更してください。
  4. 針が皮下層に到達したら、針を約3〜5 mm前方に動かし、シリンジ針を45°の角度で腹腔に挿入します。この時点で、多少の抵抗を感じるはずです。
  5. 針を静止させ、物質をゆっくりと注入します。
    注:マウスの体重値の5倍を、1回の腹腔内注射の体積として超えないでください。.
  6. 注射後、針を引き出し、滅菌綿棒で注射部位を優しくマッサージして押し、薬物をマウスの腹腔内に完全に拡散させます。.
  7. 新しい注射器を使用して、次の実験マウスで繰り返します。

4. オープンフィールド行動能力テスト

注: 最後の腹腔内注射の 12 時間後、マウスの総活動距離と不動時間を評価するために、オープンフィールド行動能力テストを実施しました。

  1. カメラの真下に4つの同一の白いボックスを配置します。
  2. ビデオケーブルを使用してカメラをコンピューターに接続します。
  3. 実験を開始する前に、実験ボックスが清潔で臭いがないことを確認してください。
  4. 動物をグリッドの中央に配置し、実験者から背を向け、10分間環境に適応させます。
  5. ビデオトラッキングソフトウェアを起動し、[ ファイル ]メニューをクリックして新しい実験を作成します。
  6. 4 つの同時視野の監視を設定します。
  7. リアルタイムモニタリング画面でボックス内を移動できる実験物体の長さと幅(30cm×30cm)をマークします。
  8. セットアップが完了したら、ビデオ監視と録画を開始します。
  9. マウスの活動を15分間記録します。
  10. テスト後、動物をグリッドから取り出し、ケージに戻します。二酸化塩素を含む滅菌剤を使用してグリッドを徹底的に清掃します。

5. マウスの末梢血の採取と検査

  1. マウスを安楽死させます(制度的に承認されたプロトコルに従います)。
    1. 腹腔内注射の36時間後に実験マウスで安楽死を行います。安楽死前のマウスの体重を測定して記録します。
      注:0.18 mLの10%クロラール水和物を腹腔内に投与し、つま先や尾の刺激に反応しないようにします。.
    2. 左手でマウスを固定し、右手でハサミを持ってマウスの片側のひげをトリミングします。
    3. 目の周りの皮膚をやさしく押して、眼球のうっ血や突出を誘発します。
    4. 湾曲した鉗子を使用して眼球をつかみ、すばやく取り除き、末梢血を微量遠心チューブに集めます。
      注:2種類の微量遠心チューブが使用され、1つは抗凝固剤を含み、もう1つは含みませんでした。
    5. 同時に、左手の中指でマウスの心臓部分を軽く押して、心臓のポンピング速度を上げます。
  2. 末梢血を抗凝固剤なしで室温で30分間放置します。
  3. 自動生化学分析装置を用いて、酵素速度法と酵素循環法(メーカーの指示に従って)により、血清アミラーゼ(Amy)とリパーゼ(Lip)の濃度を測定します。
  4. 血漿中のプロカルシトニン(PCT)などの炎症性指標のレベルを、市販の化学発光イメージャーを使用した化学発光法で測定します(製造元の指示に従ってください)。
  5. ELISAキットを使用して、マウス血清中のHMGB-1、IL-6、およびTNF-αレベルを測定します(製造元の指示に従ってください)。
  6. 全自動血球分析装置を使用して抗凝固剤で処理した末梢血を分析し、関連するパラメータを評価します。

6. 膵臓組織の採取とパラフィン切片の作製

  1. マウスを仰臥位に置き、発泡スチロールプレートに固定します。
  2. その領域を剃って消毒し、腹部の中央切開を行い、小腸管を右にひっくり返して膵臓を完全に露出させます。
  3. 十二指腸と幽門管を切断し、膵臓の下の小腸を見つけます。腸管に沿って膵臓組織を完全に解放します。
  4. 歯のない鉗子を使用して脾臓を固定し、ゆっくりと上に引っ張ります。
    注:膵臓組織に直接触れたり、解離プロセス全体で過度の力を加えたりしないでください。
  5. 膵臓の後部靭帯組織を膵臓の頭まで鋭く解剖し、胆管と血管を切断します。
  6. 膵臓組織を取り除き、吸収紙で表面の水分を軽くたたいて乾かし、体重を量って記録します。
  7. 膵臓組織の半分を4%パラホルムアルデヒドで固定し、残りの半分を-80°Cの冷蔵庫で保存します。
  8. 以下の手順に従って、膵臓パラフィン切片を準備します。
    1. 固定した膵臓組織を75%アルコールで洗浄し、約0.5cm×0.5cmのサイズにトリミングします。
    2. 組織を70%エタノールに20分間、80%エタノールにさらに20分間、90%エタノールに15分間浸します。
    3. 組織を95%エタノールで毎回15分間2回処理し、次に100%エタノールで毎回5分間2回処理します。
    4. 組織をキシレン溶液による12分と5分の2回の治療にさらし、透明性を確保します。
    5. 透明ティッシュをワックスタンクに65°Cで1時間浸します。
    6. 溶かしたパラフィンに組織を埋め込み、冷まします。スライサー(厚さ:5μm)で膵臓パラフィン切片を取得します。
    7. 得られたパラフィンスライスを45°Cの水で平らにし、マウントして乾燥させます(ベーキング条件:40°Cで14〜16時間)。

7. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色

  1. 膵臓パラフィン切片をキシレンIおよびIIに30分間置き、次に無水アルコール、95%、85%、75%アルコールにそれぞれ5分間、超純水に5分間置きます。
  2. 細胞核をヘマトキシリンで160秒間染色し、流水でゆっくりとすすいでください。
  3. 塩酸アルコール分化溶液を5〜10秒間塗布し、流水ですばやくすすいでください。
  4. 切片を無水アルコールで5分間処理します。
  5. 細胞質をエオシンで30秒間インキュベートし、流水ですすいでください。
  6. 切片を75%、85%、95%、100%のエタノールにそれぞれ10秒間浸漬し、キシレンで5分間処理して脱水します。
  7. 最後に、切片を中性樹脂で密封し、顕微鏡で観察します。
  8. 病理学的スコアリングと標準13.
    注:浮腫、腺房壊死、出血、出血および脂肪壊死、炎症性および血管周囲炎症などの指標に基づいて、膵炎の重症度を判断します。以前に公開された実装ガイドラインを使用して、13 を採点します。

8. 免疫組織化学染色

  1. 膵臓組織のパラフィン包埋切片をキシレンで脱ワックスし、続いてエタノール溶液の勾配でそれらを再水和します。.
  2. 30分間の膜破裂後、3%H2O2 を使用して20分間内因性酵素ブロッキングを実施する。
  3. 抗体を5%ウシ血清で室温で30分間ブロックした後、1:1500に希釈したウサギ抗HMGB1を用いて4°Cで一晩インキュベートします。
  4. 切片をPBSで洗い流し、対応する二次抗体で37°Cで30分間インキュベートします。 その後、DAB発色、ヘマトキシリン対比染色、中性ガムでのシールを行います。

9. 膵臓切片のアポトーシスを検出するためのTUNEL法

  1. キシレン中の膵臓パラフィン切片を5分間脱ろうし、2回繰り返し、勾配エタノール(100%で5分、90%で2分、70%で2分、蒸留水で2分)で洗浄します。
  2. パラフィン切片の周囲の余分な液体をPBSで洗い流します。各サンプルを100 μLのプロテイナーゼKで処理し、組織が完全にカバーされるようにします。サンプルを37°Cで20分間インキュベートします。その後、サンプルをPBSに3回、毎回5分間浸します。
    注:プロテイナーゼK溶液は、元のプロテイナーゼK(200μg/mL)溶液をPBSで1:9(容量)の比率で希釈することによって調製され、DNaseを除く最終濃度は20μg/mLになりました。プロテイナーゼKの徹底的な洗浄は、その後の標識反応への干渉を避けるために不可欠です。
  3. 組織に3%H2O2(PBSで希釈)を適量加えて完全に浸潤させ、20分間インキュベートします。ティッシュをPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。
    注:パラフィン切片は湿らせておく必要があります。組織内の内因性ペルオキシダーゼを不活性化するためには、3%H2O2によって引き起こされるDNA切断による偽陽性を防ぐために、インキュベーション時間が長すぎないようにする必要があります。
  4. 試験するサンプルの全領域を50 μLの平衡化バッファーで覆い、10分間インキュベートします。
  5. できるだけ多くの平衡化バッファーを削除します。次に、56 μLのTdTインキュベーションバッファーを各組織サンプルに加え、1時間(室温)インキュベートします。
    注意: スライドを乾燥させず、光にさらされないようにする必要があります。TdTインキュベーションバッファーは、製造元の指示に従って調製しました(組換えTdT酵素:ビオチン-dUTPラベリングミックス:平衡化バッファー= 1 μL:5 μL:50 μL)。
  6. 組織サンプルはすぐにPBSで洗浄してください。それらをそれぞれ5分間4回すすぎます。サンプルの周りの余分なPBS溶液を濾紙でやさしく取り除きます。
  7. Streptavidin-HRP反応のために、あらかじめ希釈したStreptavidin-HRP反応液(Streptavidin-HRP:TBST = 1:300)を各組織サンプルに100 μL加えてください。30分間インキュベートします。次に、サンプルをPBSで洗浄し、それぞれ5分間3回すすぎます。
  8. 各パラフィン切片に50 μLのDABを添加してDAB染色を行います。顕微鏡で染色をリアルタイムで観察します。陽性染色が現れたら、すぐにスライドを湿った箱に入れます。純水で洗って反応を止めます。
  9. スライドをヘマトキシリン染色溶液に3〜5分間浸し、純水ですすいでください。
  10. ヘマトキシリン分化溶液で約2秒間分化し、その後すぐに純水ですすいでください。
  11. ヘマトキシリン再ブルーイング溶液を使用して数秒間青色に着色し、スライドを純水できれいにすすいでください。
    注:核染色後は顕微鏡検査を実施してください。染色が濃すぎる場合は、スライドを分化溶液に戻します。染色が薄すぎる場合は、核染色ステップから染色プロセスを再開してください。
  12. サンプルを4ラウンドの新鮮な無水エタノールでそれぞれ5分間脱水します。次に、ブタノールに5分間、キシレンに5分間浸します。最後に、新鮮なキシレンをさらに5分間使用します。
  13. 中性ガムを使用してスライドを取り付けます。自然乾燥させるか、60°Cのオーブンで乾燥させます。
  14. 白色光顕微鏡を用いて組織学的検査を行います。アポトーシス核は茶色に見えます。
  15. 対応するアポトーシス指数(AI)を計算します。
    注意: スライドは二重盲検法で観察してください。TUNEL陽性スライドでは、高倍率(400倍)で5つの陽性領域をランダムに選択し、各領域に少なくとも100個の腺房細胞をカウントして、陽性細胞の割合を決定します。AI = (アポトーシス細胞の総数/細胞の総数) × 100%。

10. フローサイトメトリー

  1. 新鮮な膵臓組織を入手し、PBSで灌流した後、それらを徹底的に洗浄します。
  2. 0.5%コラゲナーゼIV消化溶液を調製し、滅菌組織ハサミを使用して膵臓組織を適切に消化します。.
  3. 膵臓の断片の状態と液体の濁りに応じて5% BSA消化終結液を添加し、混合物を低温で5分間(~300 x g、4°C)遠心分離します。
  4. 上清を捨てて消化を終了します。
  5. フェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)と2.5%ウシ胎児血清細胞懸濁液を含む細胞培養培地を調製して、膵臓細胞を再懸濁します。
  6. 200メッシュのナイロンメッシュを介して膵臓腺房細胞懸濁液をろ過し、細胞ろ過を通じて細胞懸濁液を取得します。
  7. 膵臓腺房細胞懸濁液を低温で遠心分離します(ステップ10.3で説明した条件に従ってください)。
  8. 上清を捨てます。
  9. 予め冷却したPBSで細胞を洗浄します。
  10. 遠心再懸濁により、事前に冷却した1x結合バッファーに細胞を穏やかに再懸濁します。
  11. 細胞濃度を調整した後、製造元の指示に従って、膵臓腺房細胞をAnnexin V-FITC/PIで標識します。
  12. 1時間以内にフローサイトメトリーを使用して、膵臓腺房細胞のアポトーシスを検出します。

11. カスパーゼ-3およびHMGB-1のウェスタンブロット検出

  1. 膵臓タンパク質を抽出します。
    1. 50mgの膵臓組織を抽出し、それを小さな断片に切ります。
    2. 1 mLのRIPA溶解バッファー(PMSFおよびリン酸化プロテアーゼ阻害剤を含む)を加えます。
    3. 膵臓組織を氷上で電動グラインダーを使用して5分間均質化します。
    4. 均質化した組織を氷上で2時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。
    5. ホモジネートを4°Cで10分間、4,500 x gで遠心分離します。
    6. 上清液を採取し、-80°Cで保存します。
  2. タンパク質の定量を行います。
    1. 一定量のBSA標準サンプル(25 mg/mL)を0.5 mg/mLの濃度に希釈します。
    2. 50容量のBCA溶液Aと1容量のBCA溶液Bを混合することにより、一定量のBCAワーキング溶液を調製し、完全かつ均一に混合します。
    3. BSA標準サンプルを96ウェルプレート上の標準サンプル穴に0、1、2、4、8、12、16、20 μLの順で入れます。各穴の容量を蒸留水とバランスさせ、合計容量を20 μLにします。
    4. サンプルホールに2 μLのサンプルを加え、次に18 μLの蒸留水を順次加えて希釈します(1:9)。
    5. 各ウェルに200 μLのBCAワーキング溶液を充填し、37°Cで約20〜30分間静置します。
    6. 562nmの波長で吸光度を測定します。サンプルのタンパク質濃度を標準曲線に基づいて計算します。
    7. 特定の容量のRIPAクラッキング溶液と希釈バッファーを添加して、濃度が適切と考えられる5〜10 μg/μLに達するまでサンプルを希釈します。
    8. タンパク質変性後(100°C、10分)にサンプルを-20°Cで保存します。
  3. ウェスタンブロッティングを行います。
    1. SDS-PAGEの準備をします。
      1. 糊製造型を取り付け、シール性能を点検します。
      2. 10%分離接着剤にTEMEDを添加し、均一に混合します。
      3. 気泡を避けながら、体積の約3分の2を占める混合物を金型に注入します。
      4. イソプロパノールを型に添加し、接着剤を約40分間押します。
      5. 同じプログラムを使用して、5%の濃縮接着剤を構成します。
      6. イソプロパノールを注ぎ、すぐに接着剤を追加します。
      7. 接着剤が完全に重合するまで、コームを垂直に置きます。
    2. 電気泳動操作を行います。
      1. 予想される実験制御順序で試験するサンプルを逆の順序で、SDS-PAGE接着剤のサンプリング穴に追加します。
      2. 同時にProtein Markを添加して、標的タンパク質と内部参照タンパク質の位置を決定します。
      3. サンプルの添加が完了したら、サンプルを電気泳動タンクに入れます。
      4. 最初に、80 Vで30分間泳動し、続いてゲルを泳動して100 Vで60分間タンパク質を分離します。
        注:過度の電気泳動を避けるために、ブロモフェノールブルーの位置に注意を払う必要があります。
    3. タンパク質の転写を行います。
      1. 右上隅のPVDFフィルムをマークとしてカットします。
      2. PVDFフィルムをメタノール溶液に5〜10秒間置いて活性化します。
      3. PVDFフィルムを電気泳動バッファーに約15分間浸します。
      4. 電気泳動後にゲルを慎重に除去し、余分なゲルをトリミングして、プロセス全体でゲルが濡れたままになるようにします。
      5. マイナスプレート→スポンジ→3層の濾紙→ゲル→PVDF→フィルム、3層の濾紙→スポンジ→ポジティブプレートの順にスプリントを組み立てます。
        注:ゲルとPVDFフィルムの間に気泡がないことを確認してください。
      6. 組み立てたclを置きますamp 濡れた回転溝(黒から黒)に、その周りに角氷を配置します。
      7. 電源を入れ、400mAで100分間フィルム移送を開始します。
    4. PVDFフィルムのシーリング、および一次抗体と二次抗体のインキュベーションを行います。
      1. 転写後、PVDFフィルムを静かに剥がし、TBSTで10分間すすぎ、このプロセスを3〜5回繰り返します。
      2. PVDFフィルムを5%スキムミルクで2時間密封します。
      3. PVDFフィルムをはがし、TBSTで10分間すすぎ、このプロセスを4回繰り返します。
      4. PVDFフィルムと希釈した一次抗体を一緒に4°Cの冷蔵庫に静かに振とうしながら置き、一晩インキュベートします。
      5. 翌日PVDFフィルムをはがし、TBSTで10分間すすぎ、このプロセスを4回繰り返します。
      6. PVDFフィルムをHRP標識二次抗体希釈液で約2時間インキュベートします。
      7. PVDFフィルムをTBSTで10分間すすぎ、このプロセスを4回繰り返します。
    5. フィルムを露光して分析します。
      1. 調製したECL溶液をフィルムに均一に塗布します。
      2. フィルムを露出計のある暗い部屋に約2〜3分間露光し、保管します。
      3. image Jソフトウェアを使用して解析を行います。

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結果

マウスモデリングの実験プロセスを図1に示します。注入完了の12時間後、オープンフィールドビデオレコーダーを使用して、マウスのさまざまな実験グループの移動距離と不動時間を5サイクルモニターしました(図2A)。5サイクルの間、PI V群のマウスは3分以内に低いレベルの移動距離を維持しましたが、3分以内の不動率はその後のサイクルごとに増加しました(図2B、C)。さらに、5サイクル間の異なる実験グループのマウスの総移動距離について統計解析を行いました。PI V群は、他の実験群と比較して総移動距離が最も小さく、その差は統計的に有意でした(p < 0.001)(図2D、E)。対照群とPI I群を除いて、他の実験群のマウスはD値の重みがマイナスに成長しました。その中で、PI V群は体重の変化...

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ディスカッション

現在、重度の急性膵炎患者の高い死亡率を改善するための効果的な手段が不足しています。免疫安定性メカニズムの強化における薬剤の有効性を調べることは非常に重要です。重症急性膵炎の理想的な動物モデルが急務となっています。C57BL/6Jの遺伝的背景を持つマウスは、SAPの病態生理学の研究を含む生物医学研究で広く使用されています。B6Jマウスにおける70年以上にわたる遺伝的分化により、いくつかのエクソンが自然に欠失し15、Caerulein誘発性膵臓損傷に対する感受性が低下している16。また、既存の急性膵炎動物モデルには、外科的外傷や大型動物への適用性などの限界があり、これらのモデルを用いた科学的な研究には支障をきたしています。したがって、この特定の遺伝子系統を用いて、安定的で効率的かつ簡便な動物モデルを確立することは非常に価値があります。

カエルレインは、コレシストキニンの類似体であり、マウスが絶食して十分な量の消化液を貯蔵した短時間内に、高周波注射を通じて膵臓消化液および酵素分泌の相対的閉塞を...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、淮南市の健康・医療科学研究プロジェクト(No.HNWJ2023005);淮南市市市指導科学技術計画プログラム(第2023151号)安徽省省大学の学生のイノベーションと起業家精神のトレーニングプログラム(第S202310361254号)。「50·Stars of Science and Technology」イノベーションチームは、淮南市と安徽省の主要な臨床専門建設プロジェクトにあります。安徽科技大学第一付属病院の検査部に、関連する検査データを提供してくださったことに感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
20&倍;クエン酸抗原修復液(pH 6.0)武漢サービスバイオテクノロジー有限公司、中国G1202-250 ml
アミラーゼMindray、中国
アネキシンV-FITC / PIWuhan servicebio Technology Co.、Ltd、中国 G1511  1:20 で希釈
抗 HMGB1 ウサギ pAB武漢 servicebio Technology Co.,Ltd、中国GB11103  1:1800 で希釈
BCA タンパク質定量検出キット武漢 servicebio Technology Co.,Ltd、中国G2026-200T
BD FACSCanto II フローサイトメーターBD Life Sciences、カリフォルニア州サンノゼ、95131、米国BD FACSCanto II
BSA武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国GC305010-100g
C57BL/6Jキャビオン実験動物有限公司、常州、中国ライセンス番号 SCXY (Su) 2011–0003
セルールタイド MCE、ニュージャージー州、米国17650-98-5 50 & マイクロ;g/kg
化学発光イメージャーCytiva CO.,LTD.;米国
クエン酸抗原修復液(乾燥粉末pH 6.0)武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国G1201-5 L
コラゲナーゼIV武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国&nbsp;GC3050140.5 mg/mL
DAB(SA-HRP)チューネル細胞アポトーシス検出キット漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国G1507-100 T
寸法 EXL、LM 統合化学システム付きシーメンスヘルスケア診断株式会社ブルックフィールド、米国YZB/米国 8311-2014
ECL 開発者漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国
エオシン色素(アルコール可溶性)武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国G1001-100 ml
EthoVision XT&nbsp;オランダ、
FITC 標識ヤギ抗ウサギ IgG武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国GB22303  1:50 で希釈
全自動血球分析装置Zybio Inc. 中国 Zybio-Z3 CRP
GapDH武漢サービスバイオテクノロジー有限公司、中国GB11103  1:1500 で希釈
ヘマトキシリン ブルー リターン ソリューション武漢 サービスバイオ テクノロジー 株式会社、中国G1040-500 ml
ヘマトキシリン分化ソリューション武漢 サービスバイオ テクノロジー 株式会社、中国G1039-500 ml
ヘマトキシリン染料武漢 サービスバイオTechnology Co.、Ltd、中国G1004-100 ml
HMGB-1 ELISAキットnjjcbio Co.、Ltd、中国
ホモジナイザー漢サービスbioテクノロジー株式会社、中国KZ-III-F;IC111150 100222
HRP標識ヤギ抗ウサギIgG武漢サービスバイオテクノロジー有限公司、中国GB23303 1:1500で希釈
IL-6 ELISAキット武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国GEM0001
パーゼ Mindray、中国
リポ多糖類 武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国GC20500915 mg/kg
低温高速遠心分離機沙平扇装置&Instrument Co.,Ltd.、中国TGL-20M
膜破壊液Wuhan servicebio Technology Co.、Ltd、中国G1204
ミクロトームJinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;中国CR-601ST
ナイロンメッシュ漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国200メッシュ
ステップTUNEL細胞アポトーシス検出キット(DAB染色法)武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国G1507-100T
パラフィン組織包埋機医療機器有限公司;中国常州PBM-A
病理学的組織乾燥装置PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;常州、中国PHY-III
リン酸緩衝生理食塩水武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国G4202-100ML
PMSF武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国G2008-1 ml
陽性蛍光顕微鏡オリンパス株式会社、東京、日本BX53
プロカルシトニンミンドレイ、中国
PVDFメンブレンリポア、米国0.22&マイクロ;m
RIPA武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国G2002-100 ml
SDS-PAGEBeyotime Biotechnology、中国P0012A
TNF-&α;ELISAキット武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国GEM0004
ウォーターバス莞KQAO超音波機器有限公司;中国KQ-200KDE
ウェスタンブロットBio-Rad Laboratories, Inc.、米国
ウェスタンブロットイメージングシステムグローバルライフサイエンスIP Holdco LLC、日本Amersham ImageQuant 800 
ルプールミキサーSCILOGEX;米国
武武ノルダス武リ長武ワン精密ミ超音波東ワー

参考文献

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