ヒト血液誘導性ミクログリア様細胞の改変による脳の逆翻訳研究

Summary

この研究は、脳の炎症の間接的な評価を可能にするヒト単球由来ミクログリア様(iMG)細胞の確立のための新しいアプローチを示しています。これは、脳の潜在的な炎症と関連する神経精神障害に焦点を当てた研究に有益である可能性のある細胞モデルを示しています。

Abstract

動物モデルを用いた最近の研究では、ミクログリアがさまざまな神経精神疾患や身体疾患における重要な免疫調節因子として重要であることが浮き彫りになっています。死後脳分析と陽電子放出断層撮影イメージングは、ヒト患者のミクログリア活性化を評価する代表的な研究方法です。その結果、さまざまな精神神経疾患や慢性疼痛を呈する患者の脳内でミクログリアが活性化されることが明らかになりました。それにもかかわらず、前述の技術は、ミクログリア活性化の限られた側面の評価を容易にするだけです。

脳生検や人工多能性幹細胞法の代わりに、新たに由来するヒト末梢血単球に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン34を2週間補給することで、直接誘導ミクログリア様(iMG)細胞を作製する技術を最初に考案しました。これらのiMG細胞は、細胞レベルのストレス刺激後の食作用能力とサイトカイン放出に関する動的な形態学的および分子レベルの解析に用いることができます。近年、ヒトiMG細胞と脳初代ミクログリアとの類似性を検証するために、包括的なトランスクリプトーム解析が行われています。

患者由来のiMG細胞は、ヒトの脳におけるミクログリアの活性化を予測するための主要な代理マーカーとして機能する可能性があり、那須ハコラ病、線維筋痛症、双極性障害、およびもやもや病の患者におけるミクログリアのこれまで知られていなかった動的病態の解明に役立っています。したがって、iMGベースの技術は、貴重な逆翻訳ツールとして機能し、さまざまな心身疾患におけるミクログリアの分子病態生理学を動的に解明するための新しい洞察を提供します。

Introduction

近年、脳の炎症は、さまざまな脳および神経精神疾患の病態生理学において極めて重要な役割を果たすことが示唆されています。ミクログリアは、ヒトの死後脳解析および陽電子放出断層撮影法(PET)ベースのバイオ^{イメージング技術}1,2,3,4によって、主要な免疫調節細胞として注目されています。死後の脳とPET画像解析により、重要な知見が明らかになりました。しかし、これらのアプローチは、ヒトミクログリアの動的な分子活性を脳内で完全に捉えるという点では非効率的です。したがって、ヒトのミクログリアの機能と機能障害を分子および細胞レベルで包括的に評価できるようにするための新しい戦略が必要です。

2014年には、直接誘導されたミクログリア様(iMG)細胞^5,6を作製する新しい技術を創製しましたが、2016年にヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のミクログリア様細胞が初めて発表されました^7。わずか2週間で、サイトカイン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン34(IL-34)を最適化することにより、ヒト末梢血単球をiMG細胞に変換することに成功しました。この技術を開発した当時、iPS細胞や線維芽細胞から神経細胞を誘導する革新的なリプログラミング法が世間に普及し始めたばかりでした8,9,10,11。しかし、当時はまだiPS細胞由来のミクログリア細胞を誘導する方法は報告されておらず、ヒト体細胞由来のミクログリアモデルの生成が望まれていました。GM-CSFやマクロファージコロニー刺激因子IL-34などのサイトカインがミクログリア^12,13,14,15の発生と維持に必要であると報告されていることから、これらのサイトカインの組み合わせを直接適用して、血液単球からミクログリア細胞モデルを作製できるという仮説を立てました。最後に、GM-CSFとIL-34を組み合わせることにより、単球由来のミクログリアのモデルを開発することに^{成功した5。}また、これらのサイトカインの組み合わせの一部は、iPS^細胞からミクログリアを誘導するためにも用いられており^7,16、ミクログリア特性を獲得する重要な因子であると考えられる。

iPS細胞法とは対照的に、iMG細胞は遺伝子改変を必要とせず、単純な化学的誘導によって非常に短時間で作製できるため、時間と費用が削減されます。また、iMG細胞は遺伝子のリプログラミングを必要としないため、ヒトのミクログリアの形質だけでなく状態を評価するための強力な代理細胞であると考えています。2014年のiMG技術に関する最初の論文では、iMG細胞が単球やマクロファージとは異なるヒトミクログリアの表現型を示すことを確認しました。例えば、iMG細胞は、単球や膜貫通タンパク質119(TMEM 119)やプリン作動性受容体P2RY12などの典型的なミクログリアマーカーよりも、CX3Cケモカイン受容体1(CX3CR1)およびC-Cケモカイン受容体2型(CCR2)の過剰発現比を示した^5,17。最近、末梢血由来のiMG細胞は、脳手術を受けた同じ患者において、よく知られたミクログリアマーカーの遺伝子発現プロファイルにおいて、脳ミクログリアに類似していることを検証した¹⁸。iMG細胞は、食作用やサイトカイン産生など、分子レベルでの動的機能を解析することができ、死後脳研究やPET研究の欠点を補うことが期待されています。

私たちは、那須ハコラ病⁵、線維筋痛症¹⁹、双極性障害^20,21、またはもやもや病²²と診断された患者において、ミクログリアが関与するこれまで知られていなかった動的病態生理学的メカニズムを発見しました。さらに、本研究所独自の方法論に基づき、様々な研究室が重要な逆翻訳研究ツールとしてiMG細胞(一部の研究室ではこれらの細胞の別名を指定している)を採用している23,24,25,26,27。Sellgrenらは、我々の推奨に従ってiMG細胞を作製することに成功し、マイクロアレイ解析を行ったところ、これらの細胞がヒトの脳ミクログリアによく似ていることが明らかになった²³。最近、RNAシーケンシング¹⁸を用いて、ヒトiMG細胞と脳初代ミクログリアとの類似性を確認しました。

本研究は、ヒト末梢血からiMG細胞を作製し、精神神経疾患に焦点を当てたリバーストランスレーショナル研究を促進する方法論を文書化することを目的としています。この技術は、遺伝子導入装置や熟練した人員が不足している設備の整った研究室でも、短期間でミクログリア細胞モデルを容易に作成できる合理的な分析ツールとしての可能性を示しています。

Protocol

この学習プロトコルは、九州大学の倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言のすべての規定に準拠していました。健康なボランティアや患者を含むすべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られ、血液を分析し、データを公開しました。材料および機器は 材料表に記載されており、溶液の組成は 表1に詳述されています。

1. 実験用培地・バッファーの調製

1. RPMI-1640に10%熱不活化ウシ胎児血清(56°C、30分)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加して、単離培地を調製します。
2. 塩基性緩衝液に0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)原液を添加して単離緩衝液を調製し、ろ過(0.22 μm)で滅菌します。

2. 全血からの単核細胞の単離

1. 15 mLの密度勾配培地を50 mLの密度勾配遠心チューブに移し、1,000 × g で20°Cで1分間遠心分離します。
   注:50 mL密度勾配遠心分離チューブあたり15 mLの血液を分離します。血液量が多い場合はチューブの数を増やします。
2. ヘパリンチューブに採取した血液を反転して均質化し、採血チューブから火除菌ピンセットで蓋を外します。
3. 等量(10〜15 mL)の血液を密度勾配遠心チューブ内の密度勾配培地に分注します。
4. 遠心分離機の減速レベルを4段階のうちの1段階に設定し、1,000 × g で室温(RT)で10分間遠心分離します。
   注:この減速率では、180 × g (1,000 rpm)の回転速度が3分で停止します。
5. 50 mL の遠心チューブを 50 mL の密度勾配遠心チューブと同数ずつ調製し、各チューブに 10 mL の PBS を充填します (−)。
6. 遠心分離後、バフィーコートの約1 cm上までプラズマの最上層を取り除きます。
   注意: 吸引ピペットをチューブに垂直に挿入し、液面の中心から慎重に吸引します。バフィーコートを乱さないように、過度に吸引しないでください。
7. 50 mLの密度勾配遠心分離チューブから残りのすべての上清を、10 mLのPBSを含む遠心分離チューブにデカントします(-)。
8. 遠心分離機の減速レベルを3段階のうち4段階にリセットし、250 × g でRTで10分間遠心分離します。このステップでは、50 mL の遠心分離チューブ 1 本と 15 mL の遠心チューブ 2 本、および 100 μm のセルストレーナーを調製します。
9. 遠心分離後、遠心分離機の温度を4°Cに設定します。 遠心分離管の底に赤い外周がある白いペレットを探します。上清を吸引して取り除き、軽くたたいてペレットを緩めます。
10. 火で滅菌したピンセットを使用して、50 mLの円錐形チューブに100 μmのセルストレーナーを配置します。
11. 遠心分離したチューブの1つに13 mLの分離培地を組み込み、内壁を洗浄して細胞を適切に収集します。細胞懸濁液を取り、残りの遠心分離チューブを連続して洗浄します。すべてのチューブから細胞を採取した後、細胞懸濁液を細胞ストレーナーでろ過し、50 mLの円錐管に入れます。
    注:分離媒体は、分離プロセス全体(ステップ2.11-2.16)で冷却する必要があります。
12. ステップ 2.11 で説明したように、各チューブを 13 mL の分離培地で再度洗浄します。合計26 mLの細胞懸濁液を回収します。
13. 2 本の 15 mL コニカルチューブに等量を分注し、細胞を列挙し、ステップ 2.16 の単離バッファーの適切な濃度(合計⁷ 細胞 10 個あたり 60 μL のバッファー)を計算します。
    注:15 mLコニカルチューブは、ステップ2.16でピペッティングするときに液体の量が少なく、液体が泡立ちやすいため、作業に適しています。
14. 250 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
15. 遠心分離中は、マグネティックスタンド(特にカラムと接触している部分)を70%エタノールで十分に消毒し、ベンチに置いて風乾させます。アイソレーションバッファーを氷上に保ちます。
16. 吸引して上清を取り除き(この段階では、赤血球が存在するため、厚さ~1mmの赤いペレットを探します)、適切な量の分離バッファーを追加し、~20倍ピペッティングしてペレットを穏やかに緩めます。

3. CD11bマイクロビーズを用いた単球の単離

1. Vortex Human FcR ブロッキング試薬を塗布前に 10 秒間保存してください。必要量の試薬^(全細胞 7個あたり20 μLのFcR Blocking Reagent)を添加し、チャンバー内で4°Cで5分間インキュベートします。
2. 塗布前にCD11bマイクロビーズを10秒間ボルテックスします。必要量の試薬^(7細胞 あたり20 μLのCD11bマイクロビーズ)を組み込み、5分ごとに手で撹拌しながら、4°Cチャンバーで20分間インキュベートします。
3. インキュベーション後、10 mLのアイソレーションバッファーを加え、穏やかなピペットで懸濁し、300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
4. 遠心分離中は、磁気カラムを磁気スタンドに置き、3 mLのアイソレーションバッファーですすいでください。
   注意: カラムの磁気部分に触れたり、カラムを正しく配置したりしないでください。気泡がカラムに入った場合は、ピペットで取り除きます。分離バッファーは、分離プロセス全体で冷却することが義務付けられています (手順 3.4 から 3.9)。
5. 遠心分離後の上清を吸引して取り除き、1 mLのアイソレーションバッファーを組み込み、ピペッティングで穏やかに混合し、懸濁液をカラムに塗布します。
6. カラムリザーバーが空になるたびに、3 mLのアイソレーションバッファーを追加して、カラムを3回洗浄します。
7. カラムを磁気部分に触れないように 15 mL の円錐チューブに入れます。5 mLのアイソレーションバッファーをカラムに組み込み、プランジャーをチューブに挿入して液体をカラムから押し出します。
8. チューブに回収した細胞懸濁液を300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
9. 上清を吸引し、細胞を分離培地に再懸濁します。ステップ2.13でカウントした細胞数の~5〜10%が回収されるため、細胞数に応じて懸濁液量を調整します。
   注:アイソレーションメディウムは、4°Cからの急激な温度変化を避けるために、RTで使用し、温めないでください。
10. 細胞を列挙し、500 μLの細胞懸濁液を40 × 10⁴ 細胞/mLの濃度で24ウェルプレートの各ウェルに分注し、一晩インキュベートします。
    注:細胞懸濁液は、さまざまなプレートに必要な調整された播種量に従って適切にピペットで移動する必要があります。例えば、12ウェルプレートの1ウェルに1 mL、8ウェルチャンバースライドの1ウェルに250 μLです。
11. 最後に、汚染された機器は、施設が定めた感染性廃棄物の取り扱い方針に従って廃棄または消毒してください。

4. 単球からのiMG細胞の誘導

1. 基礎誘導培地に1%抗生物質-抗真菌溶液、10 ng/mL組換えヒトGM-CSF、および100 ng/mL組換えヒトIL-34を添加して、誘導培地を調製します。
2. 前日の播種からの分離培地を誘導培地と交換します。プレートを前方に傾け、パスツールピペットでウェル底の前端から枯渇した培地を迅速に吸引します。一度に最大1プレート(=24ウェル)の割合で培地を交換し、すぐに500μLの誘導培地を穏やかに混ぜます。
   注:このステップでは、接着した単球を選択する必要があります。
3. 細胞を14日間インキュベートして、インダクションを完了します。
4. 14日後に、培地を再び500μLの誘導培地と交換します。その後、細胞の誘導後のメンテナンスのために、誘導培地を毎週500μLの新鮮な誘導培地と交換します。

5. 免疫細胞化学

1. ステップ3.10で細胞を播種した8ウェルチャンバースライドから培地を吸引して取り出し、PBS(−)ですすいでください。
2. 細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で20分間固定します。
3. 固定試薬を取り出し、PBS(−)で細胞を3 x 5分間すすぎます。
4. 0.1% Triton X-100 を含む PBS (-) で細胞を RT で透過処理します。
5. 透過処理した細胞をブロッキング溶液(3% BSA/PBS(-))でRTで1時間インキュベートします。
6. 細胞を一次抗体(Table of Materials)と4°Cで一晩インキュベートします。
   注:すべての抗体はブロッキング溶液で希釈されます。
7. 細胞をPBS(−)で3 x 5分間、それぞれ5分間すすぎます。
8. すすぎた細胞を、適切な蛍光標識二次抗体と室温で1時間インキュベートします(Table of Materials)。
9. 細胞をPBS(−)で3×5分間すすぎ、二次抗体を除去します。
10. 細胞をPBS(-)で希釈したDAPI(1:10,000)溶液でRTで5分間インキュベートします。
11. 細胞をPBS(−)で3 x 5分間すすぎます。
12. 封入剤を使用してウェルをマウントし、蛍光顕微鏡で細胞を可視化します。

Results

重要なことは、iMG細胞の特徴には、形態や遺伝子発現など、人レベルおよびタイミングレベルの不均一性が大量にあることです。特定の個体のiMG細胞は多数の分岐外観を呈しますが(図1A)、他の個体では球形のままです(図1B)。iMGの特性は、1人の個人内でも異なる場合があり、iMG細胞は疾患状態のバイオマーカーを検出するための重要なツールとなっています。逆に、このような個人差の調査は、技術的なエラーの削減を保証するものである。iMG細胞は、GM-CSFおよびIL-34で最低14日間誘導された単球として定義されます。技術的なエラーを最小限に抑えるために、導入時間を標準化し、同じ量の試薬を使用し、期限切れの試薬の使用を控えることをお勧めします。

免疫染色の検証により、iMG細胞がP2RY12やTMEM119などのミクログリアマーカーを発現することも確認されています(図2)。先行研究では、iMG細胞の形態学的および遺伝子発現特性が双極性障害の病態生理学と関連していることが実証されている^20,21。最も初期の分岐細胞は、GM-CSFおよびIL-34処理後の3日目に観察され、最適な状態のiMG細胞は、培地交換が週に1回行われると1か月以上生存できます。iMG細胞は遺伝子発現解析に用いることができます。例えば、インターフェロンガンマまたはIL-4による刺激下で、iMG細胞は遺伝子発現パターンを変化させ、これはM1およびM2分極ミクログリアの機能評価に用いることができる^5,22。さらに、FITCビーズはアメーバ様の形態学的修飾を引き起こし、TNFαや他の遺伝子の発現をアップレギュレートします⁵。さらに、食作用は、ビーズ^5,22の蛍光強度を測定することによって評価することができる。また、iMG細胞は生細胞であるため、細胞写真を撮ったり(図3)、タイムラプス撮影(動画1)することで、実際の動きや形態変化を観察することができます。

図1:iMG細胞の形態 (A)典型的な枝分かれしたiMGは、微細な体細胞体と多数の分岐した側副体を示した。(B)アメーバ型など、外観が異なるサンプルがあります。スケールバー、50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:iMG細胞の免疫細胞染色 iMG細胞は、典型的なミクログリアマーカーを発現します:(A)TMEM 119、(B)P2RY12。核をDAPI(青)で染色しました。スケールバー =10 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:iMG細胞の形態学的修飾 iMGは誘導プロセス中にその形態を変化させます。細胞の突起は(A)3日目頃に現れ、誘導が進むにつれて(B)7日目と(C)14日目に伸長します。スケールバー = 50 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

動画1:iMG細胞のタイムラプス撮影。 中央の分岐したiMG細胞は、周囲の細胞との接触を確立し、そのプロセスを伸縮させているように見えました。さらに、細胞は損傷した細胞の食作用を行った。撮影間隔は46秒、撮影時間は約14時間でしたので、 こちらからダウンロードしてください。

表1:ソリューションの構成 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

iMG細胞を用いた分析技術は、強力な逆翻訳研究ツールとして役立つ可能性があります^5,6。十分な量のヒトiMG細胞を作製するためには、実験者は特定の問題を考慮して研究を設計する必要があります。人間に由来する血液サンプルは非常に敏感です。その結果、得られたサンプルは、迅速な処理と、汚染を避けるための細心の注意を払った取り扱いを保証します。具体的には、血液サンプルは採取後すぐに分離し、長期間放置しないでください。実験は、通常、採血後3時間以内に開始され、その有効性を確認します。ただし、血液サンプルを4°Cで3時間以上保存し、分離プロトコルを開始する前に室温に戻すことは可能です。

安定した結果を得るために、培地などの試薬は開封後1ヶ月以内に使用し、有効期限が切れたら廃棄することをお勧めします。密度勾配遠心分離法を用いて末梢血単核細胞を分離すると、特定の標本で細胞凝集が観察される場合があります。このような場合、凝集を防ぐために、全血サンプルをPBS(−)で希釈する必要があります。ミクログリアへの分化誘導中、細胞への不必要な刺激を避けるために、培養培地は14日間交換されません。分化誘導の完了後、培地を新しい培地に置き換えると、弱った細胞が回復し、しばらく生存能力が維持される可能性があります。

この研究で確立されたiMG技術には限界があります。実験的に誘導された「ミクログリア様細胞」は、ヒトの脳内の実際のミクログリア細胞と同等ですが、完全に同一ではありません。さらに、先行研究は、ヒト単球由来のミクログリア様細胞の誘導のための方法論を文書化しており、異なる研究グループは、元のiMG法を条件として、独自のプロトコルと名前を提案している²⁸。例えば、特定のプロトコルは、M-CSF 29,30,31,32またはTGF-β ³³を使用し、これらはiPS細胞由来のミクログリア培養またはGeltrex^24,34などのコーティングにおいてミクログリア様表現型を促進することが報告されています。これらの因子は、ミクログリア様細胞の誘導に有効であることが証明される可能性があります。

独自のiMG技術は、サイトカインを2個しか使用せず、コーティングを一切使用しないシンプルで再現しやすいプロトコールにより、ヒトの血液を用いた様々な逆翻訳実験が可能になるという利点があります。逆に、技術の進歩により、多くの製品の開発が容易になりました。磁気分離法には、当社のプロトコールと同様のカラムベースのポジティブセレクション、ネガティブセレクション法、カラムフリー法があります。さらに、磁気分離の代わりに、プラスチック接着を使用した分離の代替方法が考えられます。カラムベースの正選択は純度を保証するが、この技術は時間がかかり、磁気ビーズによる刺激は細胞³⁵に大きく影響を及ぼす。逆に、ネガティブセレクションとプラスチック接着は、細胞への悪影響が少ない可能性があります。それにもかかわらず、これらのアプローチは純度が低いかもしれません^35,36。将来的には、他のプロトコルに基づいてさらに変更が必要になる可能性があります。

前述の調査結果は、このiMGテクノロジーの主な利点は、その短い期間、費用対効果の高い方法論、およびハイスループット研究のための多数のサンプルを処理する能力であることを示しています。したがって、この技術を使用して、人間のサンプルから知識を取得し、さまざまな動物モデルを使用してさらに検証研究を行うことができます。さらに、iMG技術を適用して細胞モデルや動物モデルで行われた研究から得られた知見は有益である可能性があります。このように、私たちのiMG技術は、ベッドサイドからベンチへ、ベンチからベッドサイドへの双方向のトランスレーショナルリサーチに応用することができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% パラホルムアルデヒド	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	「antibiotic-antimycotic solution」
autoMACS リンス液	Miltenyi Biotec	130-091-222	「塩基性緩衝液」と記載され、「分離緩衝液」
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130&ndashに使用されます。049-601
DAPI溶液	同人堂	28718-90-3
ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水	ナカライテスク	14249-24	「PBS(−)「
ウシ胎児血清	バイオウエスト	S1760-500
ヒトFcRブロッキング試薬	Miltenyi Biotec	130」;059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	「密度勾配遠心分離チューブ」と記載
MACS LS カラム	Miltenyi Biotec	130-042-401	「磁気カラム」
MACS BSA ストックソリューション	Miltenyi Biotec	130-091-376	「ウシ血清アルブミン(BSA)ストック溶液」
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	は「磁気スタンド」ペ
ニシリン-ストレプトマイシン	Nacalai Tesque	26253&ndashとして説明されています。84
ProLong Gold 退色防止マウンタント	Invitrogen	P10144	は「マウンティングメディア」と記載
されています。組換えヒト GM-CSF	R&D Systems	215-GM
組換えヒト IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "基礎誘導培地"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	一次抗体、ウサギ、1:100
抗TMEM119抗体	Sigma-Aldrich	HPA051870	一次抗体, ウサギ, 1:100
ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	二次抗体, ウサギ, 1:1000