方法論記事

げっ歯類の下大静脈静脈形成術バルーンモデル

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DOI:

10.3791/66820

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2024年5月24日

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1Section of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Michigan, 2Surmodics, Inc.

この記事について

サマリー

このプロトコルは、非血栓性、血栓性、および血栓性後の深部静脈における静脈形成バルーン (VB) 介入をテストするための生存げっ歯類モデルを提示します。

要約

バルーン静脈形成術は、外傷、先天性解剖学的異常、急性深部静脈血栓症(DVT)、またはステント留置術の結果としての深部静脈狭窄症および閉塞を治療するために一般的に使用される臨床技術です。慢性深部静脈閉塞は、組織病理学的に血栓症、線維症、またはその両方によって特徴付けられます。現在、これらの病理学的プロセスを標的とする直接的な治療法はありません。したがって、新しい介入をテストするための信頼性の高い in vivo 動物モデルが必要です。げっ歯類生存率下大静脈 (IVC) 静脈形成術バルーン モデル (VBM) は、複数の時点にわたる非血栓性および血栓後の状態におけるバルーン静脈形成術の研究を可能にします。コーティングされた静脈形成術およびコーティングされていない静脈形成術バルーンの局所的および全身的な影響は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ザイモグラフィー、静脈壁および血栓細胞分析、全血および血漿アッセイ、組織学的分析などの組織、血栓、および血液アッセイによって定量化できます。VBMは再現性があり、外科的なヒト介入を再現し、局所静脈壁血栓タンパク質の変化を特定でき、同じサンプルからの複数の分析を可能にするため、グループごとに必要な動物の数が減少します。

概要

未解決の血栓による深部静脈閉塞は、深部静脈血栓症(DVT)の一般的な結果であり、血栓後症候群(PTS)の原因の1つであり、医療に数十億ドルの費用がかかり、生活の質に大きな影響を与えています1,2,3。PTSは、小動物のDVTモデル5,6,7では完全に捕捉されていない結果として生じる静脈壁線維症4を伴う独特の炎症性病理であり、さらに重要なことに、以前のモデルは治療介入に対する反応を評価できません。血栓性静脈閉塞は、ステント留置術やバルーン静脈形成術によって治療されることがよくあります8,9;このような介入は、再狭窄と閉塞による高い再介入率によって妨げられます 10,11,12。

動脈特異的な狭窄/閉塞に対処するための薬剤コーティングバルーンが利用可能であるにもかかわらず、深部静脈には存在しません。再狭窄の背後にある分子メカニズムは、静脈内ではよく理解されておらず、直接的な治療法はありません4。したがって、私たちの目標は、深部静脈の血栓後閉塞をシミュレートする静脈形成バルーンを介して局所的に送達される治療薬をテストできる動物モデルを提示することです。このモデルは、血栓形成後の状態を再現し、さまざまな種類の静脈形成バルーンが 生体内で静脈壁にどのように影響するかを評価します。

プロトコル

次のプロトコルは、ミシガン大学(UMICH)の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)のポリシーとガイドライン、試験、研究、および訓練で使用される脊椎動物の利用とケアに関する米国政府の原則、およびARRIVEガイドライン2.0に従います。UMICH動物福祉保証契約は、OLALおよびUSDAに準拠しており、AAALACインターナショナルによって完全に認定されています。このプロトコルは、ID番号PRO00010841で承認されました。Charles River Laboratoriesの雄の近交系スプレイグ・ドーリーラット(体重450g、生後15週齢)を用いた。

1.ラット麻酔

  1. 動物をケージから取り出し、5%イソフルランと100%酸素の麻酔術前導入ガスチャンバーに0.8〜1 L / minの流量(気化器制御)で入れ、全身麻酔を誘発します。
  2. 麻酔導入チャンバーでラットを鎮静させ、チャンバーから取り出し、体重を量り、滅菌眼軟膏で眼を滑らかにしてから、温水循環加熱装置で背側横臥に置きます。ペダル反射(つま先をしっかりとつまむ)を使用して、麻酔の適切な深さを確認します。
  3. 電動バリカンで腹側腹部を剃ります。全身麻酔を2.5%イソフルランと100%酸素で0.8〜1 L / minで維持し、ノーズコーンを介した非再呼吸回路を使用します。.

2.ラット超音波スキャン

  1. イメージング中に、呼吸数、心拍数、体温などの生理学的評価をモニタリングします。
  2. 下大静脈(IVC)の腹部イメージングでは、導電性ゲルを塗布し、トランスデューサーを横方向に向けます。末梢血管をプリセットしながら、2次元イメージングモードまたはBモードを使用し、腹部の中央にあるリニアプローブ(10MHz)を下げ、腹部血管が見えるまで圧力で深さを調整します。
  3. IVCと腹部大動脈を区別するには、圧縮性を評価し、高周波リニアプローブ(10mHz)によるカラードップラーモードとパルス波ドップラーモードの両方を使用して流量を評価します。
    1. 超音波プローブで圧縮を適用する場合は、IVCが圧縮性であるのに対し、大動脈はその形状と開存性を維持するため、2つを区別します。
  4. カラードップラーとパルス波ドップラーの両方を使用して、血流の方向と速度を評価します。カラー ドップラー ウィンドウは、プローブに向かう流れを赤で表し、プローブから離れる流れを青で表します。装置をパルス波ドップラーモード(デュプレックスモード)に切り替えて、血流の方向と速度を経時的に評価します。超音波装置の自動画像キャプチャツールを使用して、必要なフロー画像を取得します(画像取得の正確な仕様は超音波システムによって異なる場合があります)。
    1. 次の評価方法を使用します:大動脈にはプローブへの血流と三相性波形がありますが、IVCにはプローブから離れる自発的な流れがあり、振幅ははるかに低くなっています。
    2. 近位IVCが正常な波形を示しているにもかかわらず、遠位に非位相または存在しない(平坦な)波形が検出される場合は、これらの検査ポイント間の静脈閉塞の可能性を探ります。.
  5. IVCが特定されたら、中央の3分の1の部分にあり、腎静脈より下でIVC分岐部よりも優れている中央部(おそらく腰椎静脈が位置している場所)を特定します。
  6. IVCの中央部で、断面Bモード画像を使用して横方向の壁間直径を測定し、容器の最も広い直径を記録します。画像取得は、超音波装置によって異なる場合があります。コンパクト ディスク (CD) を使用して DICOM ファイルにデータを保存します。

3.ラットのマイクロサージェリーと回復

  1. ガーゼに浸したクロルヘキシジンスクラブとクロルヘキシジン溶液3xで腹部を洗浄し、無菌手術状態を確保します。.
  2. 滅菌したラップをサージカルラップとして置き、ラットの胸部と腹部、顕微鏡のノブ(倍率と焦点)、および接眼レンズを覆います。
  3. 剣状突起の約2cm下に腹側正中線切開(3cm)を虹彩ハサミで皮膚と腹壁に通し、腹部の内容物を露出させます。滅菌生理食塩水に浸した2インチx2インチのガーゼを使用して、腸を動物の右側に反射させます。
  4. IVC曝露の場合は、滅菌綿先端のアプリケーターを使用して鈍解剖を行います。.切開部にワイヤー鏡を配置し、IVCの可視化を可能にします。
  5. 腎臓静脈から腸骨分岐部まで、低温の細い先端の焼灼器を使用してすべてのIVC腰椎枝を焼灼し、7-0非吸収性ポリプロピレン縫合糸で結紮側枝を焼灼します。
  6. 大動脈から分離され、腎静脈のすぐ下にあるIVCに近位湾曲した血管マイクロクリップを配置します。大動脈から分離され、IVC分岐部よりも優れた遠位IVCにまっすぐなマイクロクリップを配置します。
  7. 8-0 で配置するナイロン U ステッチ縫合糸は、IVC の前面を中心に左腎静脈に尾側にあります。
  8. 静脈形成バルーンをバックロードし、逆行性の静脈形成バルーンを逆行させ、静脈内IVCへの血流に逆行させ、湾曲したマイクロクリップに尾側に、0.014mmの鋭利なガイドワイヤーを挿入します。
  9. セルディンガー法を使用して、バルーンをIVC中部まで進めます。鋭利なガイドワイヤーを取り外し、20mLのインフレーションシリンジを使用して10%から15%のIVCオーバーストレッチで静脈形成バルーンを3分間膨らませ、0-30 Atm.IVCカニューレーションの前に滅菌生理食塩水ですべてのシステムを洗い流し、空気塞栓症を回避します。
    注:2.8 mm IVCは、3.22 mm(15%オーバーストレッチ)までの静脈形成術を受けます。.目的のオーバーストレッチに到達するために必要な膨張圧力は、バルーンの特性によって決定され、メーカーのパッケージで入手できます。
  10. 静脈形成術のバルーンの収縮と取り外し時にUステッチを締めます。マイクロクリップを取り外します。
  11. 開腹部位を 2 層状に閉じます。5-0ポリグラクチン吸収性合成縫合糸を連続パターンで使用して、腹壁と皮膚の両方を閉じます。
  12. ブプレノルフィン徐放性注射剤懸濁液 0.65 mg/kg をラットの鎮痛薬として術後に投与します。これは、タンパク質分析のための炎症分子のバイオマーカー パネルに干渉しないためです。
  13. ラットを個々のケージで回収し、ヒーティングランプ(最小距離-ケージから24インチ離れている)で術後(30分)観察し、元のハウジングユニットに戻ります。
  14. 各実験群の偽動物については、IVC分岐の結紮、焼灼、およびカニューレ挿入を行わずに、解剖のみを行います。
  15. 血栓後の状態では、大動脈から分離された、腎静脈のすぐ下にあるIVCに近位のまっすぐな血管マイクロクリップを24時間配置します。.同じ解剖と閉鎖のテクニックを使用してください。
    1. IVC クリップの視覚化、流れのない遠位 IVC の確認、総腸骨静脈の膨張など、IVC 閉塞の超音波徴候を確認します。フォローアップの時点は、試験の仕様に合わせてカスタマイズできます。
    2. モデル化されている生理学的変化を観察するには、初期の血栓形成については最初の 72 時間の時点を選択し、後の血栓形成の場合は処置後 3 日から 7 日の時点を選択します。このモデルでテストされた後の時点には、7〜28日が含まれます5,13。
  16. 血栓後バルーン静脈形成術には、ステップ3.5-3.9の技術を使用しますが、次の注意事項があります:血栓後の状態ではIVCの直径が増加するため、望ましいオーバーストレッチを達成するためには、より高い吸入器圧力が必要になる場合があります。
  17. げっ歯類の安楽死に関する現在の米国獣医師会ガイドラインに定められた推奨事項に基づいて、動物が復活しないように2つの確認方法(血液除去と生命臓器除去)を実行することにより、安楽死を実行します。

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図1:横方向IVC(中部腎下切片)直径の経腹部二重測定の分布。 測定は動物の体重で行われました。重量とIVC直径との間に有意な相関は認められませんでした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. サンプル調製

  1. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)アッセイ技術を使用して、薬剤でコーティングされた静脈形成バルーンの確認組織移植を行います。
  2. IVCと大動脈を解剖し、ホルマリン固定パラフィン包埋および組織学的分析のために 一括 して除去します。
  3. タンパク質分析には、希釈濃度60,000 μg/gのサンプルでRIPAバッファーを使用し、4°Cの低温室内で組織ホモジナイザーで処理し、処理後は-80°Cで保存します。

結果

VBMは、完全な止血制御における静脈形成バルーンの効果を評価するモデルです。まず、 図1に示すように、正しいバルーンサイジングのためにIVC(中低腎部)の直径を定量化しました。次に、開発された段階的なマイクロサージュリー技術を 図2に示し、 図3に重要なステップの例も示しています。鋭利なガイドワイヤーを使用したIVCカニューレレーションに使用される逆行アプローチに注目してください。

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図2:ラットの静脈形成バルーンの試験のための顕微手術技術。 ここでは、使用される手法について説明します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:展開技術の in vivo 画像。 (A)止血コントロール。(B)腎下IVCのUステッチ。(C)3mmシロリムスコーティングバルーンによるUステッチによるワイヤー挿入。(D)バルーン静脈形成術の逆行性展開(シロリムスコーティング)。略語:IVC =下大静脈;AO =大動脈;CBV = コーティングされたバルーン静脈形成術。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

その他の正常な静脈血管の測定値とIVCと大動脈の区別は、 図4で強調表示されています。血栓性超音波所見は 図5に含まれています。最後に、術前の超音波測定と血栓形成後の測定値の直径の比較を 図6で観察できます。 図7に、容器のクリップ配置前後の下大静脈の平均パルス波ドップラー流速(mm/s)を示します。

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図4:代表的な経腹部二重画像と横方向IVC直径計算の例。 (A)近位IVC。(B) 中部下腎IVC.(C)遠位IVC。(D)中部腎下IVCおよび(E)腹部大動脈のカラードップラー解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 5.クリップ配置前とクリップ配置後の画像を示す画像。 (A) クリップ留置後の超音波所見でIVC閉塞を確認する。(B)近位および遠位大動脈の流れ。(C)近位IVCの流れ。(D)総腸骨静脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 6.超音波画像。 超音波は15分前、30分後、45分後に変化し、IVC閉塞を確認します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:パルス波ドップラーの平均流速。 クリップ配置前後の下大静脈の平均流速(mm/s)(**:P ≤ 0.01、マン・ホイットニー検定実施)エラーバーには標準エラーが表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

新しいコーティングによるさまざまな静脈形成術介入の結果を分析するには、目的の薬物のオンターゲット効果を実証できる効果的なタンパク質の測定をお勧めします。ここで使用したシロリムス被覆静脈形成バルーンでは、ラットIVC溶解物のリン酸化AKT(p-AKT)タンパク質レベルを測定し、p-AKTがシロリムスに応答して減少する下流タンパク質であることから、mTOR経路の阻害を確認しました14,15。図8では、コーティングバルーン静脈形成術(CBV)後、p-AKTが偽のグループと比較して大幅に減少している様子を観察できます。

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図8:タンパク質p-AKTレベル。 正常な状態での偽のラットIVC溶解物とコーティングバルーン静脈形成術(CBV)のタンパク質レベルは、シロリムス静脈形成術コーティングバルーンを使用したmTOR経路阻害による標的効果を確認します。(**: P ≤ 0.01、マン・ホイットニー検定実施)エラーバーには標準エラーが表示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

VBMは、2.5〜3.5mmの範囲のバルーンを使用して、250g≥ラットに対して実行できます。750 gを超えるラットの場合、この技術は、IVC直径の変化ではなく、腹腔内の脂肪組織の量と臓器のサイズが多いことによって制限されます。私たちの経験から、静脈壁タンパク質分析または活性アッセイと組織学のためにグループ間の統計的有意性を得るためには、グループごとに10匹以上の動物が必要であることがわかりました。外科的介入中の定期的な温度制御と呼吸数の監視は、手順の成功と入念な術後管理を保証するために非常に重要です。

VBMは安全で(生存率91.2%、83/91回の処置が実施)、平均処置時間は30分で再現性があります。手技関連の罹患率には、麻酔薬合併症(1%、1/91)、オピオイド有害作用(1%、1/91)、出血(2.1%、2/91)、血栓症(4.3%、4/91)などがあります。モデル開発では、挿入点を腎下IVCの隣に配置した逆行性IVCカニューレーションアプローチを使用することで、IVC出血を大幅に減少させました。これにより、腹部臓器による干渉が少なく、ワイヤー挿入角度が広くなりました。また、挿入期と送気期には、正しい投与圧力、膨張時間、シャープなガイドワイヤーの収縮を保証するために、外科助手をお勧めします。収縮時には、挿入点でIVC壁が引き裂かれるのを防ぐために、静脈形成バルーンの正しい回収を確保する必要があります。バルーンの過膨張と破裂を避けるために、メーカーからの圧力測定が行われます。これらの測定は、全体としてより安定したアプローチに貢献し、出血合併症を減らし、動物の生存率を向上させます。

IVC出血は、以下の予防策によっても軽減できます。まず、後枝の完全な焼灼と側枝の結紮を確認します。これにより、以前のげっ歯類のIVC結紮-停滞分析5,16,17に基づく所見の再現性も保証されます。次に、近位クリップと遠位クリップで正しい閉塞を確認して、完全な止血制御を保証します。最後に、IVCクリップを取り外す前に、バルーンを取り外すときにUステッチ縫合糸が完全に閉塞していることを確認します。出血がある場合は、止血制御が達成されるまで、綿の先端のアプリケーターでIVCに穏やかに圧力をかけると、通常は出血が止まります。.出血の場合には、吸収性ゼラチン粉末などの追加の止血制御剤を使用することができます。

バルーンの膨張、収縮、およびUステッチ縫合糸の閉鎖時間が5分未満の場合、血栓性合併症は最小限に抑える必要があります。必要に応じて抗凝固薬を投与することができます。今日まで、現在人間で行われている低侵襲バルーン静脈形成術を模倣する完全な経皮的処置はありません。アクセス血管(ラット大腿静脈)のサイズは、完全な血管内処置に必要な最小の市販の4Fシース(1.61mm)の外径よりも大幅に小さい(平均0.81mm)18 。制限には、熟練した顕微外科医の必要性と特殊な機器の必要性が含まれます。

結論として、VBM モデルは、DVT 後の深部静脈形成術の臨床シナリオを厳密にシミュレートしています。これは、静脈形成バルーンがIVCに及ぼす血管内効果を研究するための貴重なツールであり、複数の時点でさまざまな代替薬があります。この技術の将来の応用には、ステント、血栓摘出カテーテル、バルーンコーティング、新規薬理学的治療薬など、他の医療機器の前臨床試験が含まれます。

開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

この研究は、American Venous Forum (AVF) 2023 Basic Science research grant と Surmodics, Inc. の支援を受けています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3-0 DemeCRYLDemeTechG183019F4P12 個
5-0 DemeCRYLDemeTechG285017B0P12
7-0 DemeLENEDemeTechPM197011F13M12
8-0 DemeLONDemeTechNL868007C7P12個 12個
1個 ボックス アングル クリップ アプライヤーSCANLAN3795-01A7-1/4″(18.5センチ)
Baxter 0.9% 塩化ナトリウム灌漑ボトルBaxterSKU: 195-71241000mL ボトル
Bovie Cautery 低温ファインチップSurgical IncAA0010/bx
BuprenorphineFidelis アニマルヘルスSKU- 0991141.3mg/mL、3mL
CD (Sprague Dawley) ラットチャールズ リバーストレイン コード 001オス、400 gm
クリップイット トレーサブル タイマートレーサブル製品Cat.No. 5046
コットンチップアプリケーター 3インチDukal Corporation922-00037BX1001000/BOX
酵素手術器具 洗剤とプレソークメドラインMDS88000B91 ガロン
アイ ルーブオプティクスケアSKU-06544120gm 
Gaymar T /ポンプストライカー局所温暖化/冷却療法システムストライカーTP700
フェッツマイクロクリップ12mmx2.25mmSCANLAN3795-20ストレート
ハイフェッツマイクロクリップ12mmx2.25mmSCANLAN3795-28湾曲
ハイフェッツマイクロクリップ8mmx1.75mm SCANLAN3795-14ストレート
ハイフェッツ マイクロクリップ 8mmx1.75mm SCANLAN3795-18湾曲
膨張装置 メリットメディカルIN4130BasixCOMPAK アナログディスプレイ付き
イソフルランMFR VETONESKU-501017100mL、吸入用液体
ピンセットと鉗子を含む マイクロサージェリーキットカスタマイズされた
酸素、E タンクメドラインMDM1630
シャープなガイドワイヤーカスタマイズされた
滅菌 うれしいPress-n-SealうれしいSKU#PSS-140ETO露出
滅菌不織布ガーゼスポンジ2s 4ply 4x4 MedlineSKU PRM21444H100Ct
手術用顕微鏡 ツァイスS100 / OPMI ピコ
サージカル スクラブ &手洗いベトキノールNDC:17030-003-1616オン
超音波ジェルメドラインCTR0013058.5オンス、12 / CS
超音波システムシーメンACUSON Antares3-D、カラー、連続波(CW)、パルス波(PW)、パワーCW / CWスペクトル
静脈形成バルーンカスタマイズ
個個対称 ハイスス

参考文献

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