方法論記事

ラットの片側頸髄半切開後のユープネック横隔膜活動の機能回復の評価

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DOI：

10.3791/66828

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2024年6月14日

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1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Mayo Clinic

この記事について

サマリー

呼吸器合併症は、頸髄損傷 (cSCI) 患者の主な死因です。cSCIの動物モデルは、機構評価や前臨床研究に不可欠です。ここでは、ラットの片側C2 脊髄半切開(C2SH)後の横隔膜筋(DIAm)活動の機能回復を評価するための再現性のある方法を紹介します。

要約

cSCIの後、損傷の程度によっては、DIAmの活性化に影響を与える可能性があります。本稿では、ラットの呼吸中にユープネック同側横隔膜(iDIAm)筋電図(EMG)活動を妨害するcSCIの片側C2 半切片(C2SH)モデルについて説明しています。DIAmモータ制御の回復を評価するには、まずC2SHによる欠損の程度を明確に設定する必要があります。呼吸中にiDIAm EMGが完全に初期失われたことを確認することで、その後の回復を存在しないか存在するかに分類でき、EMG振幅を使用して回復の程度を推定できます。さらに、C2SH後の急性脊髄ショック期間後の呼吸中にiDIAm EMG活動が継続的に存在しないことを測定することにより、最初のC2SHの成功を検証できます。対側横隔膜(cDIAm)EMG活動を測定すると、神経可塑性も反映するC2SHの代償効果に関する情報を得ることができます。さらに、覚醒した動物からのDIAm EMG記録は、C2SH後のDIAmの運動制御に関する重要な生理学的情報を提供することができます。この記事では、呼吸器神経可塑性、代償性cDIAm活性、治療戦略および医薬品を研究するための優れたプラットフォームである、ラットにおける厳密で再現性があり、信頼性の高いcSCIのC2SHモデルの方法について説明します。

概要

米国には脊髄損傷(SCI)の個人が300,000万人以上おり、その約半数が頸部損傷を負っています1。これらの怪我は、健康の大幅な損失をもたらし、個人、その家族、および医療システムに財政的な負担をかけます。幸いなことに、SCIの大部分は不完全であり、予備の経路1を強化する可能性を提供しています。この神経可塑性により、換気および非換気行動に重要なDIAm活性を含む、少なくとも一部の機能の回復が可能になる可能性がある。したがって、神経可塑性の促進は、SCI2 の個人を支援するための有望な研究手段です。

SCIのげっ歯類モデルは、人間の健康を改善するための治療法の発見に大きく貢献する可能性を秘めています。神経可塑性の研究に使用されるSCIの古典的なモデルの1つは、C2(C2SH)での脊髄の片側切断(半切断)であり、これにより反対側は無傷のままになります3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。横隔膜分泌物に対するC2SHの影響と、温存された対側経路の重要性は、100年以上前にポーター12によって初めて明らかにされました。ポーター12は、呼吸器神経可塑性に関する現代の研究の基礎を築いた独創的な論文を発表しました。C2SHモデルは、呼吸リズム生成14の出力を伝達する役割を担う運動前ニューロンを含む髄質内の吻側腹側呼吸群(rVRG)からの下降入力を中断する。これらのrVRG運動前ニューロンは、興奮性神経ドライブを横隔膜運動ニューロンにも伝達します(図1)。何人かの研究者がC2SHモデル10,11,15,16に対して異なるアプローチを取っており、これが研究間の回復のばらつきの一部を部分的に説明している可能性がある。簡単に言えば、アプローチは、背側フニキュリを温存する、完全な半切開を実行する、または同側rVRGからの下降入力を完全に中断しない側方部分離断を実行するという点で異なります。一般に、C2SHモデルは、ユープニーのiDIAm筋電図(EMG)活動の経時的な自然回復率による呼吸器神経可塑性の研究に特に有用であり、これは神経栄養シグナル伝達17,18,19,20,21を含むいくつかの要因によって改善できます.ただし、初期の機能喪失(ユープネックiDIAm EMG活動のサイレンシングとして定義される)は、回復を明確に分類する前に最初に確立する必要があります。C2SHの時点での不活動のこの検証は、いくつかの研究3,4,6,7,11,22,23では行われていません。

切除された脊髄の組織学的評価は、脊髄の横隔運動ニューロンを神経支配する同側の興奮性球脊髄経路の適切な位置に対する損傷の証拠を提供するだけですが、組織学は生理学的証拠(例、DIAm EMG)に代わるものではありません。さらに、組織学的評価は、最終時点(多くの場合、損傷後数週間から数か月)でex vivoで実施されるため、「リアルタイム」な情報は提供されません。一部の研究者は、病変の大きさが機能障害またはその欠如の量に関連していると指摘しています5,24,25,26。このような主張の妥当性は、「機能」がどのように分類されるか(すなわち、機能的課題が何であるか、そしてそれらがどのように定量化されるか)に大きく依存する可能性が高く、研究間のばらつきは、動物間で機能的に同一の病変を生成することの難しさを浮き彫りにしていることに注意することが重要です。実際、研究者は、損傷の程度と四肢の筋肉運動機能との関係(Basso、Beattie、およびBresnahan(BBB)スコア24によって定量化)は線形ではないと強調しています27,28。以前の研究では、C2SHの範囲と損傷後のユープネックiDIAm EMG活動の回復の程度との間に関係は見られませんでした10,29,30,31、他の研究者は、換気機能と白質温存の程度との関係を報告しています5。したがって、C2SH モデルの場合、手術時、できれば慢性脊髄損傷実験の時間経過の早い段階で iDIAm の不活動性を機能的に検証するアプローチは、有益であり、必要でもあります。

本稿では、C2SH後の呼吸中のDIAm EMGの初期損失をリアルタイムで確認するためのDIAm EMGの使用と、損傷の3日後(3日目)の確認評価18,21,31,32,33を強調しています。C2SHモデルを使用した以前の研究では、DIAm EMG 10,13,30,34を記録するために繰り返し開腹術が行われました。しかし、より最近の研究では、麻酔をかけられたラットと覚醒したラットのEMGの記録を可能にする慢性EMG電極が使用されています。さらに、慢性電極は気胸のリスクを軽減し、DIAm35,36の阻害を引き起こす可能性のある開腹術を繰り返す必要がありません。C2SHモデルのバージョンは多くの研究者によって使用されてきましたが、手術3,4,6,7,11,22,23の時点では、iDIAm活性のサイレンシングの確認は行われていませんでした。このような不活動性の確認がなければ、その後の回復のどの部分が同側経路と対側経路の神経可塑性に起因するかを知ることは困難です。rVRGから横隔神経ニューロンへの吸気神経駆動は主に同側性であり、C2SH33以降に横隔運動ニューロンへの興奮性グルタミン酸作動性入力の約50%が失われるため、これは重要な考慮事項です。ただし、反対側の rVRG からの吸気興奮性入力が残っており、病変部位の下を咀嚼して同側横隔膜運動ニューロンを神経支配し、神経可塑性を介して強化して機能回復を促進することができます。横隔膜運動ニューロンへの主要な同側興奮性入力を取り除くことにより、ユープネック iDIAm EMG 活性は (少なくとも麻酔下では) 失われますが、cDIAm の活性は継続し、さらに強化されます。したがって、呼吸中のiDIAm EMG活動の喪失は、成功したC2SHの尺度です(図2)。

覚醒動物23,37では、C2SHの1〜4日後に、ある程度のiDIAm EMG活動が見られる。さらに、脱脳動物では、上部頸部半切除後数分から数時間以内にiDIAm活性が存在し、麻酔によって抑制される38。さらに、C2SHの成功は、損傷後3日目に麻酔をかけたラットの呼吸中(ユープネア)にiDIAm EMG活性がないことを確認することで検証されます。共焦点イメージング研究により、この損傷の初期段階で横隔膜運動ニューロン上のグルタミン酸作動性シナプス入力の喪失が確認された37。損傷後 3 日目に、嘲眠 iDIAm EMG 活動が残っている場合、これは rVRG からの同側下行吸気ドライブの不完全な除去の証拠と解釈されます。本稿は、(1)慢性DIAm EMG記録、(2)C2SH、(3)覚醒動物および麻酔動物におけるEMGデータ取得の3つのセクションに分かれています。このプロトコルは、ラットにおけるcSCIの厳密で再現性があり、信頼性の高いC2SHモデルについて説明しており、呼吸器神経可塑性、代償性cDIAm活性、治療戦略および医薬品を研究するための優れたプラットフォームです。

プロトコル

このプロトコルは、メイヨークリニックの施設内動物管理および使用委員会(プロトコル番号:A00003105-17-R23)によって承認されました。本研究の動物は、生後約3か月、体重200gから350gの雄と雌のSprague-Dawleyラットの混合でした。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 電極の埋め込み

  1. 電極の準備
    1. (1)マルチストランド、ステンレス鋼線、(2)#11ブレード付きメス、(3)はさみ、4)解剖顕微鏡、(5)定規、(6)鉗子、(7)25 g針、(8)2つのペンチ(少なくとも1つは圧着ゾーン付き)。
    2. 電極の作製工程の詳細を 図3に示します。ペアになった差動記録電極について、このプロセスを少なくとも2回繰り返します。
    3. まず、18cmのステンレス線を測り、切断します。
    4. 図3に示すように、ワイヤーの一方の端から4cmのところで基本的なオーバーハンドノットを結びます。これは、ワイヤーの短辺がDIAmに埋め込まれて縫合されるときにアンカーとして機能します。
    5. メスと外科的解剖スコープを使用して、ワイヤーの短辺の結び目に隣接する2mmの絶縁体を慎重に剥がします。マルチストランドワイヤーのストランドを切断しないように細心の注意を払ってください。
      注意: この非絶縁部分は、電極の導電面として機能します。一般に、信号品質は、3本以上のストランドが誤って切断された場合に低下し始め、その場合は電極を交換します。
    6. 次に、ワイヤーの短辺の端から ~5 mm を剥がし、25 G 針の内腔に挿入して、電極を DIAm に埋め込むために使用される縫合糸のようなツールを作成します。
      注意: 個人の好みに応じて、より高いゲージの針(最大28 G)も使用できます。高ゲージの針は直径が細いため、気胸のリスクが減少する可能性があります。ただし、マルチストランドワイヤを針の小さいルーメンに挿入するのがより困難になる場合もあります。
    7. これを行うには、25 G の針をパッケージから取り出し、両方のペンチを使用して、針が折れるまで鋭利な斜角の端から左右に ~1 cm で針を慎重に曲げます。
      注:このプロセスを急がないでください。そうしないと、せん断力によって針の内腔が閉じ、このプロセスを繰り返す必要があります。
    8. ワイヤーの剥がれた端を、折れた1cmの針の内腔に挿入し、針がワイヤーの残りの絶縁部分のすぐ隣にあることを確認します。
    9. 針とワイヤーの残りの短辺との間に絶縁されていない部分がないことを確認し、針を圧着してワイヤーに取り付けます。
    10. 次に、2本のペンチを使用して、取り付けられた針を慎重に曲げて、標準的な外科用縫合針と同様の湾曲を与えます。
    11. 最後に、ワイヤの長辺の端から~5mm剥がします(図3)。電極をDIAmに縫合した後、ワイヤーの長辺は外部アクセス用にトンネル化され、DIAm EMG記録が可能になります。
    12. このプロセスを繰り返して、差動記録用の2番目の電極を作成します。
  2. ダイヤフラムEMG電極の配置
    1. 手術の前に、(1)小動物のバリカン、(2)#11ブレード付きメス、(3)手術用ハサミ、(4)鉗子、(5)マイクロニードルホルダーを含むすべての手術器具を滅菌またはオートクレーブします。
    2. 清潔なケージを購入し、食料、水、寝具、環境強化を提供します。加熱パッドの上に置いておきます。このケージは、手術後に動物を収容するために使用されます。
    3. 適切な消毒剤で術野を滅菌し、個人用保護具(スクラブ、キャップ、マスク、手術用手袋)を着用します。以前に調製した電極を70%イソプロピルアルコールのプールに入れます。
    4. 麻酔や手術中にラットの体温を維持するために、手術部位に加熱パッドを置きます。加熱パッドを滅菌した手術用タオルで覆います。
    5. ラットの体重を量り、施設の動物の世話と使用のガイドラインに基づいて適切な麻酔薬の投与量を計算します。
    6. ケタミン (80 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) またはその他の適切な麻酔薬 (施設で承認されたプロトコルに従う) の後肢筋肉内注射でラットに麻酔をかけます。術前に徐放性ブプレノルフィン(1 mg / kg)とカルプロフェン(5 mg / kg)を注射します。.動物がつま先のつま先をつまむことに反応しなくなったら、続行します。
    7. バリカンを使用して、ラットを剣状突起から後肢の約半分まで剃ります。また、電極が動物の手の届かないところ(通常は肩甲骨の周り)に外部化されるラットの背中を剃ります。ガーゼで余分な髪をきれいに落とします。
    8. クロロヘキシジングルコン酸塩に浸した滅菌ガーゼ(体積で4%の重量)で皮膚を洗浄することにより、切開用の皮膚を準備します。
    9. 滅菌した加熱パッドの上で動物を仰臥位に置きます。剣状突起から始めて、メスときれいな#11ブレードを使用して、4〜5cmの吻尾部切開を行います。これにより、下にある腹部の筋肉層が露出するはずです。
    10. 筋肉層の正中線に沿って別の切開(3〜4 cm)を行い、腹部の内容物を露出させます。腹部の臓器に切り込まないように注意してください。
    11. DIAmの腹部(つまり、下)の表面が見えることを確認してくださいが、動物の右側は肝臓によって隠されます。
    12. メスの柄やその他の鈍器を使用して、肝臓やその他の臓器を押し下げて、DIAmの腹部を露出させます。
    13. 電極をイソプロピルアルコールのプールから取り出し、滅菌生理食塩水で洗浄して、電極を使用できるように準備します。次に、マイクロニードルホルダーを使用して、事前に準備した電極の1つをDIAmの中央肋骨領域の筋線維に対して垂直に向けます。
      注:DIAmは薄い(~2 mm)ため、穴を開けないでください。むしろ、電極ワイヤの非絶縁部分(図3)をDIAm内に埋め込むことが目標です。
    14. 手術用顕微鏡を使用して、電極縫合線(針先)をDIAmに慎重に挿入します。針の湾曲が電極をDIAmの腹面に導き、その後DIAmの腹面から電極を導き出し、ワイヤーの非絶縁部分全体が筋肉に完全に埋め込まれるようにします。
    15. ワイヤーの結び目がDIAmに固定されるまで、針を慎重に引き抜きます。電極ワイヤーの非絶縁部分(2 mm)がDIAm内に完全に収まり、針が最初にDIAmに入ったポイントに結び目があることを確認します。
    16. 次に、電極線から針を切り取り、鋭利物容器に廃棄します。
    17. 2つの鉗子を使用して、縫合糸(3-0)針がDIAmを出たポイントで結び目を作ります。これを行うには、ワイヤーの短辺にループを結び、ループをDIAmの腹部表面までスライドさせ、ループを慎重に結び目に締めます。電極(絶縁されていない部分)は、入口と出口の両方のポイントに固定する必要があります。
    18. ワイヤーの短辺の余分な部分を切り取ります。
    19. 手順1.2.14-1.2.18に従って、DIAmの同じ側、最初の電極から~3mm離れた別の電極を縫合します。
    20. 反対側の半横隔膜に電極ペアを同じように埋め込みます。
    21. 次に、電極ワイヤーの長い辺がすべて腹腔の外側にあることを確認し、筋肉層を縫合(3-0)して腹部を閉じます。電極の各ペアについて、ループを作成して固定します。
      注意: ラットがDIAmに張力をかけずに伸ばせるように、腹腔内に2〜3cmのワイヤーが残っていることを確認してください。
    22. 生理食塩水で余分な血液を洗い流し、筋肉層を連続的に縫合(3-0)して腹膜を閉じます。
    23. ラットの内側背側皮膚から開いた腹部の皮膚まで 16 G のカテーテルをトンネルし、一対の電極ワイヤーをラットの背中まで引っ張ります。
    24. 反対側に2本目のカテーテルを取り付け、2本目の電極ワイヤーを引っ張ります。
    25. 腹部の皮膚を3-0縫合糸で縫合し、中断された縫合パターンで縫合します。
    26. 次に、各ペアについて、電極線を結び目に結び、所定の位置に縫合します。
    27. 動物に生理食塩水皮下注射を行います(動物の体重50 gあたり~1 ml)。動物を温熱パッドの上の清潔なケージに入れて回復させます。
      注:開腹術はDIAm活性の阻害を引き起こす可能性があります35,36。EMG測定値の定量分析の前に、少なくとも72時間かかります。

2.頸椎半肉片

  1. 以前と同様に滅菌手術エリアを準備します。
  2. 手術の前に、すべての手術器具をオートクレーブまたは滅菌してください。必要な装備:(1)小動物のバリカン、(2)#11刃付きメス、(3)手術用ハサミ、(4)鉗子、(5)ロンジャー、(6)リトラクター、(7)角度付き解剖ナイフ。
  3. DIAm EMG電極の埋め込みから約72時間後に、ラットの体重を量り、施設の動物の世話と使用ガイドラインに基づいて適切な麻酔薬の投与量を計算します。
  4. ラットに麻酔をかける前に、ラットをボウマンスタイルのケージに入れ、ステップ3.2で概説したように両側のDIAmEMGを記録します。
  5. ケタミン (80 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の腹腔内注射、または地元の施設動物管理および使用委員会のプロトコルに従って、他の適切な麻酔薬でラットに麻酔をかけます。術前に徐放性ブプレノルフィン(1 mg / kg)を皮下に、カルプロフェン(5 mg / kg)を腹腔内に注射します。.
  6. 動物がつま先のつま先をつまむことに反応しなくなったら、続行します。約15分ごとにつま先をつまんで麻酔の深さを確認します。
  7. 手術を開始する前に、ラットを腹臥位に置き、ステップ3.3で概説したように麻酔をかけたラットのEMGを記録します。.
    注意: すべての録音がラットを同じ位置に置いて実行されていることを確認してください。
  8. 首から耳の高さから肩甲骨までの髪を剃り、濡れたガーゼで取り除きます。
  9. グルコン酸クロロヘキシジン(体積比4%)で皮膚をきれいにし、動物を滅菌手術カバーで覆います(上部背部を除く)。
  10. メスを使用して、4cmの吻尾側切開を行います。皮膚を引っ込め、肩峰僧筋を切断します。次に、菱形筋を解剖して脊椎筋を露出させます。
    注:肩峰僧帽筋は中僧帽筋であり、その筋線維は脊椎とほぼ平行に走っています。菱形筋は肩峰峰の下の平面に露出しており、その筋線維は斜めに走っています。
  11. 脊椎筋をC1 からC3に引っ込めます。
    注:脊椎筋は脊椎のすぐ隣を走っています。
  12. C2で椎弓切除術をロンジャーを使用して慎重に行い、手術用顕微鏡を覗きながら、主要な動脈や神経が損傷していないことを確認します。
  13. C2で硬膜を切断して引っ込めます。
  14. ラットの背中から露出した電極線をアンプに接続し、脊椎半肉片を行います。詳細については、ステップ 3 を参照してください。
  15. DIAm EMGをモニタリングしながら、 図2Aに示すように、背根が脊髄に入る点のすぐ下に角度付き解剖ナイフを挿入し、腹面の中点まで切片を挿入します。
    注意: 電子ヒートパッドを使用している場合は、ノイズを避けるためにEMGを監視しながら電子ヒートパッドをオフにする必要がある場合があります。
  16. この切片化後数秒以内に、損傷と同側のユープネックDIAm EMG活動が停止し、cDIAm EMG活動の代償的な増加が明らかであることを確認します(図2C)。
  17. ユープニーのiDIAm EMG活動が続く場合は、 図2Cで強調表示されているように、解剖ナイフで別の切断を行います。ただし、正中線を横切らないでください。反対側に切断すると、動物の死につながる可能性が高くなります。
  18. 筋肉を縫合し、次に滅菌縫合糸(3-0)で皮膚を縫合します。
  19. 水分補給を維持するために、動物の体重50 gあたり1 mLの生理食塩水を皮下に注入し、回復のために動物を加熱パッド付きの清潔なケージに入れます。.手術から回復する動物を監視します。
  20. 約 72 時間後 (3 日目 Post-C2SH) に、プロトコル ステップ 3.2 に従って、覚醒しているラットの EMG 活動を記録します。ラットの背側のステッチを傷つけないように注意してください。
  21. 次に、手術用飛行機に必要な用量よりも軽い用量の麻酔薬を使用して、ラットにもう一度麻酔をかけます(施設で承認されたプロトコルに従って)(通常の用量の1/3から1/2の間)。ラットが無傷の角膜反射を示し、つま先のつま先つまみに反応する限り、追加の用量を投与できます。.
  22. プロトコルステップ3に従ってDIAm EMGアクティビティを監視します。
    注:ラットをiDIAm EMG活動の初期評価に使用した位置と同じ位置に置きます。
  23. ユープニック iDIAm EMG 活性 (すなわち、吸気性 cDIAm EMG 活性と同相の活動) が 3 日目に存在しない場合は、最初の C2SH が成功したと結論付け、さらなる分析のために同じ動物を含めます。

3. データの取得と分析

  1. 一般設定とデータ抽出
    1. プリアンプのバンドパスフィルターを100Hz(ハイパス)と1000Hz(ローパス)に設定します。
      注:これらのフィルター設定は、動きのアーチファクトを排除し、筋肉内DIAm EMG信号の周波数含有量の大部分を保持しながら、60HzのノイズとECG汚染(~75Hzにピークパワーを持つ)を大幅に低減します。ナイキスト理論に基づいて、2000Hzのサンプリング周波数でデジタル化してエイリアシングを回避し、化合物EMGの運動単位活動を記録するための適切な分解能を確保します。100 Hz未満の周波数範囲の特殊な周波数成分解析を実行する場合は、対象の周波数がフィルタリングされないようにプリアンプフィルター設定を設定することが重要です。
    2. コンピュータ上の視覚化ソフトウェアで2つのチャンネル(左右の半横隔膜筋電図)をモニターし、データを適切な形式で保存して、さらなる分析を可能にします。
    3. 分析に十分なデータを得るために、少なくとも1〜2分のユープネック録音を収集します。
    4. データが 3 つ以上の時点で収集されていることを確認します。
      1. C2SHの前に、覚醒状態および麻酔状態でのベースラインのユープネック記録を確立します。
      2. 麻酔状態での eupneic iDIAm EMG 活動のサイレンシングを確立するための C2SH 手術中。
      3. 3日目に、ポストC2SHで、ユープネックiDIAm EMG活動の欠如が持続することを確認し、脊髄ショック2,39またはブプレノルフィンのような呼吸抑制剤の投与によってそれほど影響を受けない覚醒動物の欠損の程度の初期点を確立します。
    5. デジタル化された信号に対して計算を実行できるソフトウェア(Matlab、Python、Rなど)を使用して、DIAm EMG記録を解析します。基本的なプロセスは次のとおりです。
      1. 生のEMGファイルをロードします。フィルタリング設定によっては、信号のDCオフセットを考慮する必要がある場合があります。
        注:簡単な修正は、生のEMG信号の平均をそれ自体から差し引くことです。
      2. 50ミリ秒の移動ウィンドウでEMG信号の二乗平均平方根を計算します。これは、信号の終わりに達するまで、50 ミリ秒の計算ウィンドウを一度に 1 サンプル ポイントずつ進めることで実行できます。
        注:個々のDIAm EMGイベントの解析は、最も統計的な検出力を提供し、ユープネックおよび非ユープネック活動のクラスタリングを可能にします。したがって、DIAm EMGにおける個々の呼吸の開始とオフセットの検出は、以前のレポート40で強調されているように、最も重要です。
    6. 前のレポート41に示したように、瞬間的な呼吸数とバースト時間のヒストグラムを視覚化することにより、ユープネック活動のフィルタリングを実行する。
  2. 覚醒した録音。
    1. ネズミをボウマンスタイルのげっ歯類のケージに入れて、覚まし録音を行います。円筒形のボウマンスタイルのケージは、最大750 gの成体ラットを収容できます。
    2. ボウマンスタイルのケージの片側にある金属棒を緩め、ネズミを中にそっとなだめます。金属棒をねじ込み、ネズミを円筒形のケージに閉じ込めます。
      注:録音を進める前に、ラットをケージに少なくとも30分間順応させます。可能であれば、測定の前に数日間、ラットをボーマンスタイルのケージに順応させるのが最善です。この順応期には、ラットがケージにいる間におやつを提供することをお勧めします。
    3. 外部からの視覚刺激を最小限に抑えるには、ペーパータオルなどを使って、ネズミの頭があるケージの前面の周りにテントを作ります。さらに、大きな音を最小限に抑え、すべてのポイントでラットの身体的快適さを確保します。
      注:不快感の明らかな兆候には、そわそわする、急速な呼吸、ケージに抵抗するのもがきなどがあります。これらの兆候のいずれかが観察された場合は、ラットをホームケージに戻し、ラットが落ち着いたときに録音を試みる必要があるかもしれません。
    4. 小型のラット(<300 g)の場合は、ネズミが180度回転するのを防ぐために、ケージ内の余分なスペースに充填材(ペーパータオル、綿球など)を挿入します。
    5. ラットが順応した後、ラットの背から出るワイヤーをプリアンプに慎重に接続し、プリアンプはアナログ信号をアナログ-デジタルコンバーターに供給し、ステップ3.1で概説した手順に従います。
  3. 麻酔録音
    1. ラットを毎回同じ位置に置く、できれば覚めているラットの姿勢をより忠実に模倣する傾向がある。
    2. ラット背部から出るワイヤーをプリアンプに接続し、プリアンプはアナログ信号をアナログ-デジタルコンバーターに供給し、手順3.1で概説した手順に従います。
  4. 動物の回復
    1. ネズミを、回復のための寝具のない空の清潔なネズミのケージの中に置きます。
    2. ケージを加熱パッドの上に置きます。
    3. 最初の3時間またはラットが動き始めるまで、一定の間隔(<15分)でラットを監視します。.動物が再び目を覚ますまで、より少ない間隔(30分)で監視します。
    4. ラットが歩行可能になったら、寝具、餌と水へのアクセス、環境強化を備えた清潔なケージに入れます。
    5. 実験の時間経過全体を通じて、少なくとも1日1回ラットを監視し続けます。.体重/栄養摂取能力の変化、および切開部位と縫合糸の完全性に特に注意してください。

結果

本稿で紹介するアプローチは、C2SHのラットモデルでDIAm EMGを評価するための明確な基準を設定することにより、オペレーター間のばらつきを最小限に抑えます。まず、図 2 に示すように、C2SH の直後にユープネック iDIAm EMG 活動の停止が観察される必要があります。そうでない場合は、ユープネック iDIAm アクティビティが消えるまで二次切断を実行できます。次に、C2SH 後の 3 日目に、動物が麻酔をかけられている間、ユープネック iDIAm EMG が継続的に存在しないことを確認する必要があります。図4Aは、損傷後3日目の麻酔下でのユープニードiDIAm EMG活動の継続的な欠如によって決定される成功したC2SHの例を示しています。図4Bは、麻酔をかけていない覚醒状態での同じ動物におけるDIAm EMG活動を示しており、損傷前のベースラインと比較して、iDIAm活動の減少(ただし、欠如ではない)を強調しています。特に、cDIAm EMG活性は、覚醒状態と麻酔状態の両方で増加します。3日目の麻酔記録は、最初のC2SHが成功したことを検証しますが、定量分析は覚醒している動物で実行する必要があります。覚醒状態の動物では、C2SH後の3日目のDIAm EMG活性が回復の出発点となります。図4Bは、覚醒状態のラットにおいて、3日目にiDIAm EMG活性が低下しているが、存在しないわけではないことを示しています。

場合によっては、C2SHは、ユープネックiDIAm EMG活動の完全な停止を伴わない(図5A)。不適切なC2SHは、本稿で概説されているアプローチを使用して、全症例の5%未満で発生します。しかし、C2SHの成功を検証するためには、C2SH後3日目のDIAm EMG活性の評価を各ラットで実施することが不可欠である。図5Aは、損傷後3日目のラットからのDIAm EMG活性の例を示しており、C2SHは3日目までにユープネックiDIAm EMG活性を排除するのに不十分であった。C2SHの有効性の検証は、動物が麻酔されている間に行われたことに留意することが重要である。ユープネの筋電図活動が継続していることから、下行する同側の球根脊髄経路の少なくとも一部が助かったことが示唆されており、これが結果の解釈を複雑にしている可能性がある。図5Bは、覚醒状態のラットにおいて、iDIAm EMG活性が3日目に減少したが、存在しないわけではないことを示しています。ただし、同側の下降入力を控えめにすると、初期の赤字が減少する可能性があります。

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図 1: 概念フレームワーク。 吻側腹側呼吸群(rVRG)は、頸髄の横隔運動ニューロンに下降入力を送ります(C3-C 5)。これらの下行軸索の大部分は、同側横隔運動ニューロンプールを神経支配しますが、ごく一部は正中線を横切って対側運動ニューロンプールを活性化します。C2SHの直後に、rVRGから同側横隔膜運動ニューロンプールへの下降入力が破壊されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:代表的なC2SHおよびDIAmのEMG活動。 (A)重要な構造がラベル付けされたラット脊髄およびトラン部位(赤の網掛け)の横方向図が示されている。脊椎病変は、背根が入る点の真下に解剖ナイフを挿入し、ほぼ正中線(影付きの半透明の赤い領域)まで切り込むことによって行われます。外側および腹側腟骨の主要な運動路が切断されているが、背側舟骨は温存されていることに注意してください。(B)同側の運動ニューロン活動のサイレンシングを描いた縦方向のビューは、満足のいく病変のリアルタイム確認に使用される生のEMGトレースを補完します(C)。脊髄が損傷すると、ユープニーのiDIAm EMG活動が停止し、横隔運動ニューロンへの同側入力が切断されたことが示唆されます。一方、cDIAm EMGは、図に示すようにすぐにその活性を高めます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:電極製造。 DIAm EMG電極の製造プロセスを示しています。基本的なプロセスには、適切な長さのワイヤーを測定して切断する(ステップ1)、アンカー結び目とストリッピングウェイの絶縁体を結んで電極を露出させる(ステップ2)、ワイヤーに25ゲージの針を取り付ける(ステップ3および4)、針を曲げて外科用縫合針に似た曲率を与える(ステップ5)、 絶縁体を剥がして、EMGを記録するためにアンプに接続されるワイヤーの一部を露出させます(ステップ6)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:脊椎半肉切除の成功 (A) DIAm EMG活性は、麻酔をかけたラットにおいてC2SH前および損傷後3日目に示された。損傷後3日目のこのラットにおけるユープネックiDIAm EMG活性の証拠はなく、最初のC2SHが成功したことを示しています。損傷前の状態と比較して、cDIAm EMG活動の代償性の増加と呼吸数の増加に注意してください。(B)DIAm EMG活性は、C2SH後の3日目に麻酔をかけていない覚醒条件下で同じラットで示されています。完全に沈黙しているわけではないが、iDIAm EMG活動が減少したという明確な証拠があります。損傷前の状態と比較して、cDIAm EMG活動の代償性の増加と呼吸数の増加に注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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(A) DIAm EMG活性は、C2SH前と損傷後3日目に麻酔をかけたラットで示されている。このラットでは、嘉上性iDIAm EMG活性が損傷後3日目に持続し、初期C2SHが不十分であったことが示されました。したがって、このラットは、機能回復のさらなる分析から除外されました。.C2SHが失敗したにもかかわらず、cDIAm EMG活性の代償的な増加は見られますが、呼吸数の増加は最小限に抑えられています。(B)DIAm EMG活動は、C2SH後の3日目に麻酔をかけていない覚醒状態で同じ実行で示されています。iDIAm EMG の減少、cDIAm EMG 活性の増加、および呼吸数のわずかな増加の証拠があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

C2 脊椎半解剖
この記事で説明する手順は、背側フニキュリーを温存しながら外側および腹側フニキュリを横断するC2脊椎病変の検証として機能するDIAm EMG活動の評価に重点を置いています(図2A)。提案された外科的アプローチには、2つの大きな利点があります。まず、ラットの歩行機能を維持する背側索を温存しながら、横隔運動ニューロンへの同側入力を切断します。次に、DIAm EMGをモニタリングすることにより、動物が麻酔されている間の手術中に最初にユープニードiDIAm EMG活性を排除するC2病変の有効性を検証できます。損傷後3日目に、動物に麻酔をかけている間、ユープニードiDIAmEMG活動のサイレンシングが実際に継続していることを確認します。腎運動ニューロンのrVRG興奮性入力と横隔膜運動ニューロンのNMDA受容体発現は、損傷後3〜7日で減少し、グルタミン酸作動性シナプス入力とNMDA受容体発現の両方が損傷後7日後に経時的に増加することが示されました33,42。これらのデータは、C2病変10,13,29,30,33の組織学的確認と組み合わされて、損傷後3日目の麻酔下での継続的な不活動が最初のC2SHの有効性に関する情報を提供することを示唆しています。複数年に実施された研究全体で、C2SH後14日目に30%〜40%の麻酔下での自然回復の比較的安定した率が見られました図18,19,20,29,31,43は、C2SHの成功を検証するこの方法が再現性があり、信頼性が高いことを示唆している。

C2SHの手順には、いくつかの重要なステップが含まれます。重要なことに、ここで提案されているC2SHモデルは背側腟骨を温存するため、四肢の運動障害につながらない。背側舟骨を含む完全なC2脊椎半解剖モデルでは、四肢の運動障害はかなり大きいです3,4,5,6,7,37。したがって、C2SHモデル(図2A)のさらなる利点は、麻酔をかけたC2損傷ラットにおけるユープニードiDIAm EMG活性のサイレンシングに加えて、ラットは歩行および他の機能の点で偽椎弓切除ラットと機能的に類似しているということである。したがって、彼らは一般的に自分で餌を与え、毛づくろいをすることができ、DIAmの神経運動制御と呼吸器神経可塑性の研究を可能にしながら、世話の負担を軽減します。C2モデルが適切に実装されるようにするには、過度の病変を避けるために細心の注意を払う必要があります。背根が脊髄に入る場所のすぐ下に解剖ナイフを挿入することと、腹側部分を控えめに切断することは、どちらも役立つ経験則です。目標は、ユープニックiDIAmEMG活動が停止するようにすることです。これは、必要に応じて複数の小さなカットで行うことができます。実際、C2SHの次の週に、動物が歩き回ったり、餌のペレットに手を伸ばしたりするのが難しい場合、脊髄に過度の損傷があったかどうかが明らかになります。

電極の配置とEMG記録
慢性型DIAm EMG電極には、他のアプローチに比べていくつかの明確な利点があります。電極は、C2SH手術の数日前に埋め込むことができ(また、そうすべきである)、回復に十分な時間を確保し、同じ手術セッション中に開腹術とC2SHを必要とせずます。開腹術がDIAm35,36の阻害を引き起こすことは広く受け入れられているため、これは重要です。慢性DIAm電極を埋め込むことにより、以前の研究10,13で行われていた開腹術を繰り返す必要もありません。また、各セッション中に電極がDIAmに挿入されないため、気胸のリスクも減少します。しかし、電極の配置の結果として、いくつかの潜在的に深刻な有害事象が発生する可能性があります。気胸のリスクは、電極の繰り返し挿入を避けることで減少しますが、完全に無効になるわけではなく、実際に気胸が発生し、即死または長期にわたる問題を引き起こす可能性があります。このリスクを軽減するには、DIAmに通す針がDIAmの上面に穴を開けないようにすることがベストプラクティスです。また、電極ワイヤの操作中にDIAmに損傷を与える可能性のある鋭利な鉗子の使用は避けてください。時折、ラットは腹部のステッチを噛むことがあり、自分のデバイスに任せると自分自身の内臓が剥がれる可能性があります。ラットは、電極留置後、これらのタイプの行動を早期に検出するために、一定の間隔で観察する必要があります。場合によっては、ネズミに麻酔をかけて縫合糸の損傷を修復することも可能かもしれません。ただし、手術中および手術後に適切な痛みの緩和を提供し、手術中に無菌野が壊れないようにすることで、そのような行動を軽減するのが最善です。極端な場合には、縫合糸を何度も抜くラットを安楽死させる必要があるかもしれません。

EMG信号の記録と分析は、本研究の主な焦点ではなく、各ラボで利用可能な特定の機器とソフトウェアに大きく依存しています。機器の情報は資料表に記載されていますが、EMG活動の増幅と記録にはさまざまなハードウェアオプションが存在し、その詳細は各ラボの機能、可用性、および手頃な価格の組み合わせによって異なります。ただし、EMGの記録には、言及することが重要ないくつかの一般原則があります。潜在的な問題の1つは、埋め込まれた電極の移動または破壊であり、DIAm EMGの定量的評価を制限する可能性があります。電極がDIAmから外れた場合、またはラットが外部化されたワイヤを消費または損傷した場合、EMG活動を記録できないか、ノイズレベルが変化する可能性があります。これは、電極がDIAmにしっかりと固定されていること、およびDIAm電極留置手術中に電極から高いS/N比(SNR)の信号を記録できることを確認することで回避できます。さらに、電極ワイヤーを背部の高い位置に外部化し、余分なワイヤーを切断してラットが電極ワイヤーにアクセスできないようにすることも、慢性電極の成功を助長します。外部化されたワイヤの代替として、ヘッドキャップ37またはテレメトリー44,45が合理的なオプションであり得る。どちらのアプローチも、覚醒している動物の記録をより簡単に取得できますが、マルチストランドワイヤを単に外部化するよりも実装がわずかに難しい場合があります。近くにあるすべての電子ソースがノイズの原因である可能性があります。すべての機器が適切に接地され、シールドケーブルが使用され、アクティブな録音が行われている間はネズミに触れないことが最も重要です。録音中に電子ヒートパッドをオフにするだけでなく、低ノイズ録音を実現するために、照明、近くの機器、電動手術台、およびその他のそのようなデバイスを一時的にオフにする必要がある場合があります。環境への影響を最小限に抑えるために、DIAm EMG記録のためにオンにする必要のない電子機器の電源を切る必要があります。可能であれば、録音は電気的にシールドされた部屋で行う必要があります。時間の経過とともに、DIAm EMG電極周辺の組織瘢痕化や線維化により、電極の導電率が低下し、SNRが低下することがあります。さらに、姿勢のわずかな変化でも、DIAm EMG信号に大きな影響を与える可能性があります。したがって、これらの複雑化の原因となる可能性のある問題を最小限に抑えるために、DIAm EMGは、記録セッション間で同じ姿勢のラットで記録する必要があります。

もう 1 つの重要な考慮事項は、フィルタリングとサンプリングの設定です。電極の種類(筋肉内電極と食道/表面電極)は、信号の周波数成分を決定し、その結果、信号に適切なハイパスフィルターとローパスフィルターを決定する際に非常に重要です。表面/食道DIAm EMG46に最適なフィルターを決定するために、かなりの努力が費やされてきました。ラットDIAmでの同様の研究は行われていませんが、以前に、ラットの慢性筋肉内電極を使用して記録されたDIAm EMGの周波数成分全体が1000Hz未満であり、重心周波数が約300Hzであることを効果的に示しました47。表面電極と筋肉内電極の両方を介して得られたヒトの上腕二頭筋電図のパワースペクトルの平均周波数と中央周波数の直接比較において、Christensen et al.48 は、平均周波数と中央値周波数の両方が、表面電極と比較して筋肉内電極の方が約 3 倍高いことを発見しました。DIAmでは、研究者は、バイポーラ食道電極49,50,51,52,53,54を使用した場合、約100Hzの重心周波数を報告しており、これは、以前に筋肉内電極について決定された300Hzが、Christensenらによって示されたのとほぼ同じ傾向と一致することを示唆しています。.それにもかかわらず、げっ歯類モデルで筋肉内DIAm EMGを利用した複数の公開された研究では、ハイパスフィルターを300 Hz 4,37,55,56に配置し、一部は500 Hz57まで高くなっています。このようなフィルタリングアプローチがDIAm EMG信号の振幅を少なくとも半分に大幅に減少させることは議論の余地がありません。我々は、はるかに破壊的でないアプローチを提案する:(1)ECGパワースペクトルの大部分が100Hz未満である一方で、DIAm EMGパワースペクトルの比較的少ないため、100Hzでのハイパスフィルタリング51,52、および(2)その後、波形マッチング58によって残りのECGを除去する。したがって、ほとんどの研究でDIAm EMGに適したフィルタは、100 Hz〜1000 Hzの間で設定でき、サンプリング周波数は少なくとも2000 Hzで、データ内のすべての関連特徴をキャプチャできます。DIAm EMGの詳細な分析は、その後、以前のレポート40,41,47,58で発表された技術を使用して実行できます。

覚醒して麻酔をかけた動物
特に、いくつかの研究では、cSCI の C2SH モデルが eupneic iDIAm EMG23,37 の完全な不活性につながらないことが強調されています。ある意味では、これは驚くべきことではなく、「ブレークスルー」活動は、より高いドライブを必要とする行動(例えば、深呼吸や気道閉塞への反応)中に起こることが以前に指摘されている4,7,29,42。これらのデータは、C2SHモデルを継続的な非活動の真のモデルと考えることはおそらく適切ではないことを示唆しています。実際、覚醒している動物では、完全なC2SH37の4日後には早くも活動が現れるほど、覚醒している動物では駆動力が十分に高いようですが、損傷後1日で一貫して存在するわけではありません23。いずれの場合も、麻酔は上部頸椎半解剖後のiDIAm活性を抑制します(これは、以前のレポート23,38で強調され、図4と図5に示されているように)。本稿で提案されているC2SHと背側索を温存した覚醒状態のラットにおけるDIAm EMG活性に関する公開データはありません(図2A)。今後の研究では、このC2SHモデルを用いて、覚醒状態の動物におけるDIAm EMG活性の時間経過の詳細な特性評価が提供されるはずです。そうは言っても、麻酔下での損傷後 3 日目に eupneic iDIAm の不活動状態が継続して存在しないことの検証を行うことは、脊髄が最初に損傷/切除された実験条件を模倣するために、依然として賢明です。受傷後3日目に覚醒している動物に嘆願的iDIAm EMG活性が見られる場合、麻酔薬の半分の用量でさえ、通常、嘉眠iDIAm EMG活性の完全な停止につながることに注意してください。これらの用量で、動物は落ち着いて落ち着いています。C2SH中および損傷後3日目のユープニードiDIAm EMG活動のサイレンシングを検証することに加えて、C2SHの部位と範囲の組織学的確認を行うために、最終実験後に脊髄を摘出することをお勧めします9,29,59 .損傷の組織学的確認は、サイレンシングされたユープネックiDIAm EMG活性の機能的確認と組み合わせると、C2SHが成功したという強力な証拠を提供します。

本稿では、ラットにおける C2SH の cSCI について、損傷後 3 日目に麻酔下でサイレンシングを続けることで、ユープニー iDIAm EMG 活動の即時サイレンシングにつながる cSCI を紹介します。本稿で提案されているC2SHモデルでは背側フニクルスが温存されているため、四肢の運動機能は維持され、それによってオフターゲット効果が回避されます。これにより、DIAm神経運動制御に対する高頸部病変の影響に関する縦断的研究を、それ以外は比較的健康なラットで実施することができ、研究者の介護負担を最小限に抑えることができます。損傷後 3 日目の麻酔下での非活動性の検証により、ユープニー iDIAm EMG のその後の回復範囲を評価するための明確なベースラインが確立されます。このアプローチは、ラットでC2SHを実施するための厳密で信頼性が高く、再現性のある方法を提供します。このモデルは、呼吸器神経可塑性の時間経過と潜在的な治療戦略との交差についての理解を大幅に向上させる可能性を秘めています。

開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

著者らは、NIHの資金源(NIH R01HL146114)を認めています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
25 G ニードルカーディナル ヘルス1188825100Covidien Monoject Hypdermic スタンダード 針: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet BraidedEthiconJ774D3-0 縫合
糸 Adson-Brown 鉗子ファイン サイエンス ツール11627-12先端形状: ストレート, 先端: サメの歯, 先端幅: 1.4mm, 先端寸法: 2 x 1.4 m, 合金/材質: ステンレス鋼, 長さ: 12 cm
ボウマンスタイルケージブレインツリーサイエンティフィックPOR-530重量範囲:250 750 gまで;最大長:9インチ(228 mm)。基本ユニットは.5インチ(123mm)の宝石付きアクリルで構成されています。
Castroviejoニードルホルダーファインサイエンスツール12565-14先端形状:ストレート、先端幅:1.5 mm、クランプ長さ:10 mm、ロック:はい、はさみ:いいえ、合金/材質:ステンレス鋼、長さ:14 cm、鋸歯状:
はい、特徴:タングステンカーバイ
クリップリード1m TPシールドバイオパックシステムズ株式会社LEAD110SEMG
データ収集ソフトウェアLabChart LabChart7.3.8用シールドリード線マルチチャンネル記録とリアルタイム評価のためのデータ記録、視覚化、および分析ソフトウェア
データ分析ソフトウェア - Matlab 2023bMathworks, Inc.バージョン23.2ホック分析用の汎用プログラミング言語
解剖ナイフファインサイエンスツール10056-12先:4 mm、厚さ:0.5 mm、合金/材質:ステンレス鋼、長さ:12.5 cm、ブレード形状:角度付き30°C;
デュモン#3鉗子ファインサイエンスツール11293-00スタイル:#3、先端形状:ストレート、先端:標準、先端寸法:0.17×0.1mm、長さ:12cm、合金/材質:デュモスター
筋電図増幅器Biopac Systems、IncEMG100CEMG増幅器
ドマンロンゲールファインサイエンスツール16000-14先端形状:湾曲、カップサイズ:2.5mm、合金/材質:ステンレス鋼、長さ:13cm、関節作用:シングル
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16021-14合金 / 材質:ステンレス鋼 長さ:14cm ジョイントアクション:シングル カップサイズ:1mm 先端形状:湾曲
絶縁電源モジュールBiopac Systems, IncIPS100CBiopac Systems, Inc.のMPシリーズデータ収集システム
リー止血サイエンスツールに依存しない100シリーズアンプモジュールを運用13019-14チップ:鋸歯状、チップ幅:1.5mm、クランプ長さ:22mm、合金/材質:ステンレス鋼、長さ:14cm、チップ形状:湾曲
ナイフ キュレットV.ミューラーVM101-4414チップ:シャープ、チップ径:2mm
マイクロ解剖はさみBiomedical Research Instruments, Inc.11-2420長さ:4インチ、角度:ストレート、ブレード長さ:23 mm
マルチストランドステンレス鋼線Cooner Wire, Inc.AS 631AWG 40;全体の直径:0.011 mm(断熱材あり)、0.008 mm(断熱材なし)。
PowerLab 8/35ADInstrumentsPL3508データ収集システム
メスブレード #11Fine Science Tools10011-00ブレード形状:角度付き、刃先:20 mm、厚さ:0.4 mm、合金/材質:炭素鋼
メスハンドル #3Fine Science Tools10003-12合金/材質:ステンレス鋼、長さ:12 cm
Sprague Dawley RatInotiv注文コード:002Sprague Dawley outbered rats (雌と雄)
手術顕微鏡OlympusSZ61手術顕微鏡 
縫合糸切断はさみGeorge Tiemann & Co.110-1250SB合金/材質:ステンレス鋼、先端形状:ストレート、先端:シャープ/鈍、長さ:4.5 "
Vannasスプリングはさみファインサイエンスツール15000-08:シャープ、刃先:2.5ミリメートル、先端径:0.05ミリメートル、長さ:8センチメートル、合金/材質:ステンレス鋼、鋸歯状:いいえ、先端形状:ストレート
ワイトラナーリトラクターマン50-5647ング:2×3鈍、長さ:4.5インチ
ドポスト刃フリー. ケファインチップコッドプロ

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