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方法論記事

高収率で低損傷の臍帯由来間葉系幹細胞の単離

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DOI:

10.3791/66835

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2024年7月5日

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1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

この記事について

サマリー

この研究は、ウォートンゼリー(WJ)の完全性を維持するための独自の鈍的解剖手順を提示し、その結果、損傷を受けたWJが少なくなり、収穫された間葉系幹細胞(MSC)の量と生存率が向上します。この方法は、従来のシャープな解剖法と比較して、優れた収率と増殖能力を示します。

要約

間葉系幹細胞(MSC)は、顕著な再生特性と免疫調節特性を持つ多能性細胞の集団です。臍帯(UC)由来のウォートンゼリー(WJ)は、MSCの優れた供給源として、生物医学分野でますます関心が高まっています。しかし、供給が限られていたり、既存の手法が標準化されていないなどの課題が生じています。この記事では、臍帯から無傷のWJを解剖することによりMSC収量を向上させる新しい方法を紹介します。この方法では、鈍的解剖を使用して上皮層を除去し、WJ全体の完全性を維持し、収穫されたMSCの量と生存率を増加させます。このアプローチにより、従来のシャープな解剖法と比較して、WJの無駄が大幅に削減されます。WJ-MSCsの純度を確保し、細胞外からの影響を最小限にするため、UCを反転させた後に内部張力を利用して内皮を剥がす手技を行いました。さらに、ペトリ皿は、外植片の培養中に短時間反転して、接着と細胞の伸長を改善しました。比較分析により、提案法の優位性が示され、従来の方法よりもWJおよびWJ-MSCの収率が高く、生存率が高いことが示されました。どちらの方法でも細胞表面マーカーの形態と発現パターンが類似していることから、さまざまなアプリケーションに対するそれらの特性評価と純度が確認されています。この方法は、WJ-MSC単離に高収量で高生存率のアプローチを提供し、MSCの臨床応用に大きな可能性を示しています。

概要

1991年にウォートンゼリー(WJ)から間葉系幹細胞(MSC)が初めて単離されて以来、これらの多能性幹細胞は、その再生特性と多系統分化能力1により、研究者から大きな注目を集めてきました。MSCは、骨髄、末梢血、歯髄、脂肪組織、胎児(ヒト中絶)、出生関連組織2など、さまざまな供給源から単離できます。臍帯(UC)は、その非侵襲性、豊富な細胞収量と分化能力、高い増殖率、分化能、および免疫調節特性を示すため、有望な貯蔵庫として浮上しています3。胎児MSCは、強力な幹細胞性と免疫特性を示すため、過去20年間に実施された臨床試験や基礎研究の主要な焦点となっています2,4,5。UC由来のMSCは、骨髄や脂肪組織などの他のMSC源と比較して優れた治療可能性を持っています6,7。

UCは、羊水上皮、3つの血管(2つの動脈と1つの静脈)、およびWJ3として知られるゼラチン状物質で構成されています。興味深いことに、UCは単純な血管系を構成し、内皮と中皮のみで構成され、外膜は構成されません。WJにはリンパ液や神経は含まれていません8.UCは、セグメント分離に最適な独自の構造を提供します。UC-MSCは主にWJにあります。MSCは、羊膜、亜羊膜(羊膜および亜羊膜はコード内層領域とも呼ばれる)、およびWJ8の血管周囲領域を含む、WJのさまざまなコンパートメントから分離できます。WJの各領域には、独自の構造、免疫組織化学的特性、および機能があります3,6。

UCのWJから単離されたMSCは、他の地域のMSCと比較して優れた臨床的有用性を有すると広く見なされています3。WJ-MSCは、その多系統分化能、免疫調節特性、パラクリン効果、抗炎症作用、および免疫特権特性により、さまざまな疾患の治療のための前臨床および臨床環境で広く研究されてきました2,3。WJ-MSCは、移植片対宿主病(GvHD)、移植片拒絶反応、クローン病、自己免疫疾患、心血管疾患など、さまざまな疾患の治療に有望であることが証明されています9,10,11,12,13,14。WJ-MSCsの臨床需要は増加し続けているため、臍帯の供給不足は、現在、その広範なアプリケーションに対する障害となっています。

WJ-MSCの収量は、細胞抽出15に使用される方法に依存する。WJ-MSCは、外植片培養または酵素消化によって単離することができるが、後者の方法は増殖時間が長いため、細胞損傷のリスクを高め、細胞生存率を低下させる可能性がある16。しかし、多くの研究により、外植片培養法は細胞収量と生存率を増加させ、外植片組織から放出されるパラクリン因子も細胞増殖の促進に役立つことが示されています17,18。

この研究では、WJ全体を取得するために独自の解剖アプローチを適用し、WJへの損傷を最小限に抑えながら、増殖能力、生存率、および量が向上したMSCを生成しました。この革新的な方法は、WJ-MSCを分離するための合理化された戦略を提供し、MSCアプリケーションの重要なニーズに対応します。

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プロトコル

サンプルは、中国広東省の深セン龍崗区産科小児医療病院の同意した健康なドナーから入手しました。この研究のためのヒトサンプルの使用は、深セン病院の倫理委員会、北京中医薬大学(SZLDH2020LSYM-095)、および深セン龍崗区産子医療病院の医療倫理委員会(LGFYYXLLS-2020-005)によって承認されました。すべての実験は、承認されたガイドラインに従って行われました。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.人間の臍帯の収集

  1. 無菌条件下で協力病院からヒト臍帯サンプルを採取します。
    注:35歳未満のドナー、できれば初産婦で、肝炎、性感染症、または遺伝性疾患の病歴がないものを選択してください。B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルスの入学試験結果は陰性であることが必要です。配送方法として帝王切開を選択します。
  2. 長さが約10〜15cmのまっすぐで無傷のUCピースを選択します。
  3. 止血鉗子で両端を閉じ、帝王切開による満期新生児の分娩直後に鉗子の間の内側の端に外科的結び目で結紮します。( 図 1 のステップ 1 に示すように収集された UC)。
    注:帝王切開の操作により、コレクションが無菌であることが保証されます。サイズ0または2-0縫合糸の外科用結び目を使用すると、引張強度が向上します。
  4. 手術用ハサミを使用して、鉗子と結び目の間に結ばれた臍帯を切断します(図1、ステップ1)。
  5. 生理食塩水ですすいで表面の汚染された血栓を取り除き、20 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)が入った滅菌50 mLプラスチックチューブに速やかに移します。
    注:移送中に抗生物質は使用されていません。
  6. チューブを密封します。ポリスチレン製の箱に入れて氷の上に置き、4°Cで保存してから実験室に輸送します。
    注意: 収集から4時間以内にコードを解剖します。

2.臍帯からのウォートンゼリーの分離

  1. 以下の手順に従って、臍帯を処理します。
    1. 手術器具、無菌包装された90 mmディッシュ、1000 μLピペット、滅菌PBS、75%エタノール溶液、およびゼノフリーヒトMSC培地を使用して滅菌トレイを準備します。
      注:歯付き鉗子と蚊クランプにより、滑りやすいコードを効率的に処理できます。
    2. 必要なアイテムと作業ゾーンを表面で除染してから、バイオセーフティキャビネット内にアイテムを配置します。
      注意: 作業を開始する前に、作業ゾーンの空気を数分間パージしてください。
    3. チューブの表面を消毒し、サンプルをバイオセーフティキャビネットのシャーレに移します。結び目のあるサンプルを75%エタノールに30秒間浸し、新しいペトリ皿で滅菌PBSで複数回すすぎます。
      注:コードは75%エタノールに浸す前に結紮する必要があり、浸漬時間は30秒から1分に制限して、コードを損傷せずに完全に消毒する必要があります。
    4. 結び目を切り取り、2つの結び目の間のコードを横方向に約2cmの長さの短い部分に切断します。
      注意: 結び目のあるコードの端は廃棄する必要があります。UCの長さは長すぎたり短すぎたりしてはいけません。どちらの条件も、操作の難易度を上げる可能性があります。
    5. 1000μLピペットを使用して、コードのもう一方の端から出てくる流体が完全に透明になるまで、静脈(より大きな血管)をPBSで灌流します19。
  2. へその緒を解剖します。
    1. すでにカットしたピースの1つを新しいシャーレに移します。
      注:2つの動脈と1つの静脈が断面8 に見えるように露出している必要があります(図2B)。
    2. 適切な量のPBSを追加して、操作中ずっとコードを濡らし続けます。
    3. 鉗子でコードをつかみ、蚊クランプを使用してその主軸に沿って動脈を引き抜きます。
      注意: 動脈壁は弾力性が高いため、動脈が引き裂かれている場合は、コードのもう一方の端から引っ張るようにしてください。
    4. 鉗子の1つのブレードを臍帯静脈に挿入し、しっかりとクランプして、厚い面を上にしてコードを水平に固定し、鉗子が厚い面でクランプされるようにします。
    5. メスを使用して、羊水上皮の層を一方の端からもう一方の端まで、鉗子のもう一方の刃の端に沿って直線的に切開します(図3)。
      注:ウォートンゼリーの完全性を保つために、WJをできるだけカットしないでください。
    6. カッティングギャップの1つのコーナーから開始します。歯付きクランプで羊膜上皮の角を持ち上げ、上皮の内面に沿って角膜ハサミでさらに水平に少し切り続けます。
      1. ウォートンゼリーと羊水上皮をクランプで分離し、UCの一方の端の円全体に徐々に拡大します。上皮層を縦方向に剥がします(図3)。
        注:ウォートンゼリーは、高密度の羊水上皮8に囲まれた粘液結合組織です。全体の操作はスムーズであるべきですが、蚊取りクランプは、剥離中に困難に遭遇した場合の鈍い解剖に使用できます。
    7. 鉗子の両方のブレードを静脈の内側に挿入し、WJの一部をクランプしてから、裏返しにして臍帯静脈の上皮を露出させます(図3)。
    8. 内部張力により静脈の上皮と血管周囲WJとの間に分離が生じるため、静脈の上皮を簡単に剥がすことができます(図3)。
  3. 比較のために従来の方法を使用してUCを解剖します20。
    1. 別のすでにカットされたサンプルを選択しますamp前のコードとほぼ同じ重量のファイルで、新しいペトリ皿に移します。
    2. 臍帯静脈に沿ってハサミで縦に切り、UCを広げて血管とWJを露出させます。
    3. 臍帯静脈と2本の動脈を切除し、はさみとメスでWJを内皮層から取り除きます。

3. UC-MSCの単離と培養

  1. 収集したWJを事前にラベル付けされた90mmのペトリ皿に入れ、はさみと鉗子で1〜3mmに切ります。
  2. キャップを底にして皿をひっくり返し、5% CO2 インキュベーターに37°Cで30分間置き、ピースとプラスチック表面との間の付着を強化します。
  3. 皿を裏返し、さらに培養するために適量のヒトMSC培地を静かに加えます。
    注意: 最低速度を使用して、ピースがまだ取り付けられていることを確認してください。
  4. ヒトMSC培地を3日ごとに交換します。培地の3分の2を交換し、最初の7日間は2日ごとに線維性細胞の伸長の出現を観察し、完全な培地を交換し、その後は毎日観察します。
    注意: 最初の7日間はペトリ皿を動かさないでください。線維芽細胞様細胞の顕著な成長は、約4日で観察されました。
  5. 合流点が80%に達するまでのサブカルチャー。
    注:この手順には7〜10日かかります。
    1. PBS、0.25%トリプシン、およびゼノフリーのヒトMSC培地を水浴中で37°Cに予温します。
    2. ピペットで上清を吸引した後、PBSですすぎ、予熱した0.25%トリプシンで細胞を剥離し、ペトリ皿を軽くたたいて細胞が剥がれるまで細胞を剥離します。
    3. 予熱したMSC培地を4:1の比率で混合してトリプシンを不活性化し、細胞懸濁液を回収し、300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
      注:これらのセルは継代0(P0)と見なされます。
    4. 上清をピペットで捨て、細胞をヒトMSC培養培地に再懸濁し、増殖のために1x104 細胞/ cm2 の播種密度で新しいペトリ皿に接種します。
  6. 血球計算盤を使用して、増幅後の 2 つの方法の 1 回目、2 回目、および 3 回目の継代で総細胞数をカウントします。顕微鏡下で、第1、第3、および第5継代の細胞形態を決定します。
    注:これらの細胞の形態は、P0細胞と類似している必要があります。
  7. 5番目の継代の細胞は、フローサイトメトリーやその他の実験に使用します。

4. フローサイトメトリーによる細胞表面マーカーの発現

  1. Passage 5(P5)細胞を0.25%トリプシンで分離し、細胞染色バッファーで細胞を洗浄し、300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ペレットを細胞染色バッファーでそれぞれ100μLに再懸濁します。
  2. 各チューブを標識し、アロフィコシアニン(APC)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはフィコエリトリン(PE)と結合した抗体を適切な量で添加します:CD44-APC、CD73-APC、CD90-FIFC、CD105-FIFC、CD11B-PE、CD19-PE、CD43-PE、HLA-DR-PEメーカーの指示に従って21。室温で暗所で15〜20分間インキュベートします。
  3. 染色した細胞を300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、ピペットで上清を吸引し、細胞染色バッファーで1回洗浄します。
  4. 300 μLの細胞染色バッファーで細胞の遠心分離と再懸濁を繰り返します。
  5. 細胞をフローサイトメーターに通し、製造元の指示に従って抗体染色細胞を解析します。

5. 細胞計数法による細胞増殖曲線の決定

  1. P5細胞をヒトMSC培養培地で希釈することにより、2つの方法を用いてP5細胞の単一細胞懸濁液を調製します。
  2. 24ウェルプレートでウェルあたり8,000個の細胞を播種し、各方法の合計21個のウェルを播種します。
    注:播種する前に、ピペットで吹き付けて吸引することにより、細胞を穏やかに混合します。
  3. 播種後24時間後に3つのウェルから細胞を採取します。血球計算盤を使用して細胞カウントを行い、平均値を計算します。
    注:セルカウントの前にプレートを振ってください。振とうの時間を長くして、細胞凝集体の形成を防ぐことができます。
  4. 合計7日間、24時間ごとに細胞カウントを繰り返します。X軸に時間(d)、Y軸に細胞数(x104/mL)を使用して成長曲線をプロットします。

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結果

UC-MSCの収集と培養の手順、およびその後の分析を 図1にまとめています。UCは、独自の方法を使用していくつかのセクションにきちんと分解されました。主な手順の具体的な動作図を 図2に示します。外植片培養物からの細胞の増殖は、定期的に監視され、記録されました。付着性紡錘形細胞は、外植片を培養してから約4日後に観察され、ますます渦状に這い上がっていきました。これらの細胞もP0として同定され、増殖および継代中に均一なサイズと形態を維持しながら、その後の継代のために増殖を続けました。従来の方法と現在の方法は、細胞サイズと形態の点でほとんど違いが見られませんでした(図3)。

従来の解剖法では、WJをUCの血管と内皮から削り取るというものでした。WJ収量は、重量調整により2つの方法間で有意な差を表しました。WJの収量は、2cmコード(2.4g±0.2g)のWJの重量パーセンテージを測定することで計算できます。現行の...

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ディスカッション

MSCは、再生医療に深い影響を与えるダイナミックな研究分野です22。そのユニークな特性により、科学的な調査の焦点となり、さまざまな病気や怪我の治療に革命を起こす可能性を秘めています7。WJ-MSCはMSCの別個のサブセットであり、血管間上皮と羊水上皮の間に位置するUC内のゼラチン状結合組織から得ることができる23。MSCの臨床応用は、十分な細胞数を達成することにある24。しかし、継代数が増えると、細胞はある程度の老化現象を示し始め、MSCの増殖能力はP524以降徐々に減少しました。したがって、MSCの収量を増やすための分析法の最適化は不可欠です。

WJ-MSCを単離する最も効率的な方法は、WJの完全性を維持しながらWJ全体を解剖することである6。研究によると、臍帯境界領域からのこれらの境界細胞は、血...

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開示事項

著者らは、利益相反を報告していません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(82172107)、中国広東省自然科学基金会(2021A1515011927、2021A1515010918、2020A1515110347)、深セン医学研究基金(SMRF.D2301015)、深セン市科学技術イノベーション委員会(JCYJ20210324135014040、JCYJ20220530172807016、JCYJ20230807150908018、JCYJ20230807150915031)、および龍崗区経済技術開発特別基金(LGKCYLWS2022007)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
APC抗ヒトCD44抗体 バイオレジェンド 
24ウェル細胞培養プレートThermo Scientific142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) 抗体 バイオレジェンド 
APCマウスIgG1、κ;アイソタイプ・コントロール(FC)抗体バイオレジェンド 
クレーブ平山HVE-50
自動セルカウンターカウントスターFL-CD
バンバンカー 凍結保存液和光302-14681
細胞染色バッファーバイオレジェンド 
遠心機エッペンドルフ5424R
クリーンベンチ上海 ZhiChengC1112B
CO2 インキュベーターThermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
電気サーモスタット ブラストオーブン上海 JingHongDHG-9423A
FITC抗ヒトCD105抗体 バイオレジェンド 
FITC抗ヒトCD90(Thy1)抗体 バイオレジェンド 
FITCマウスIgG1、&κ;アイソタイプ・コントロール(FC)抗体バイオレジェンド 400110
フローサイトメトリーBeckmanCytoFLEX
血球計算盤Superior Marienfeld640410
細胞内染色 透過化洗浄バッファー (10回;) バイオレジェンド 
立生物顕微鏡ZEISSAxio Vert. A1
液体窒素貯蔵タンクThermo ScientificCY50935-70
生理食塩水 (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE 抗ヒト CD11b 抗体バイオレジェンド 
PE抗ヒトCD19抗体 バイオレジェンド 
PE抗ヒトCD34抗体バイオレジェンド 
PE抗ヒトCD45抗体バイオレジェンド 368510
PE抗ヒトHLA-DR抗体 バイオレジェンド 
PEマウスIgG1、&κ;アイソタイプ・コントロール(FC)抗体バイオレジェンド 
PEマウスIgG2a、&κ;アイソタイプ・コントロール(FC)抗体バイオレジェンド 
精密電子天秤SatoriusPRACTUM313-1CN
スノーフレーク製氷機ZIEGRAZBE 30-10
滅菌済み 50 mL プラスチックチューブGreniner227270
サーモスタット ウォーターバス上海 YiHengHWS12
トリプシン 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios 
超純水精製装置Milli-QMilli-Q リファレンス
Xeno-Free Human MSC Culture MediumFUKOKU 
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