進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

サマリー

ここでは、テトラサイクリン制御ベースの誘導合成回路を設計、構築、および提供するためのプロトコルが提示されます。寄生虫の除去とサイトカイン発現に対する合成回路の影響は、提示されたパイプラインをチャネリングすることで研究できます。このプロトコルは、感染症における合成回路ベースの治療薬を研究する研究者に関連しています。

要約

免疫代謝は、リーシュマニア症の進行における極めて重要な決定要因です。合成生物学に基づくアプローチは、リーシュマニア症を引き起こす宿主関連因子を標的とした治療介入への一歩として、大きな注目を集めています。合成生物学では、遺伝子構成要素を直交的かつモジュール的に操作して、生物学的システムを正確に調節し、細胞に新たな機能を付与します。本研究では、細胞内 リーシュマニア 原虫の排除を促進する治療薬としてコハク酸デヒドロゲナーゼを送達することを目的とした、誘導性テトラサイクリン制御(TetON)ベースの合成回路開発のための系統的パイプラインの解明を目指した。概説されているプロトコルは、合成回路の設計とその後の検証を説明しています。提案された戦略は、送達ビヒクルとしてプラスミドバックボーンに合成回路を組み込むことにも焦点を当てています。さらに、合成回路の送達にポリプレックスベースのナノ粒子を用いた送達装置をマウスマクロファージ細胞株に用い、細胞形態を損なうことなく使用しました。トランスフェクションした細胞を選抜し、合成回路発現に最適な誘導濃度を決定するための方法の標準化が行われました。観察により、トランスフェクションされた細胞では、感染した細胞と比較して、細胞内寄生虫の負荷が明らかに減少していることが明らかになりました。炎症誘発性サイトカインは、寄生虫の排除を促進するメカニズムとして、トランスフェクションおよび誘導された合成回路細胞で感染後に発現されました。このことは、合成生物学に基づく方法が、疾患の進行に関連する宿主因子を標的とすることにより、リーシュマニア症における強力なアプローチであることを強調しています。

概要

ホリスティックで統合的な医療の進歩は、免疫細胞の代謝変化と感染症における免疫細胞の表現型を調節する能力との間に特定された重要な関連性です。免疫代謝は、ヒトに蔓延する感染症の病因を解明するための新たな視点を提供します。さらに、介入のための新規標的を特定することにより、ワクチンや医薬品の開発に有望な技術を提供します¹。免疫細胞の代謝リプログラミングは、リーシュマニア症を含むさまざまな感染症で同定されています。 リーシュマニア属 リーシュマニア症の原因であり、そのうち リーシュマニアメジャー (L.メジャー)は皮膚リーシュマニア症(CL)を引き起こします。 L. major 寄生虫は、細胞内寄生虫として増殖と生存のために、宿主細胞、特にマクロファージの代謝に大きな影響を与えます²。マクロファージは通常、古典的に活性化された(M1)サブセットまたは代替的に活性化された(M2)サブセットのいずれかに分極することができ、M1細胞は高い炎症誘発性サイトカイン分泌と窒素種の代謝による一酸化窒素(NO)の産生を持っています。M2細胞は、抗炎症性サイトカインのレベルが上昇し、窒素代謝を通じて高いアルギナーゼ活性を示します³。したがって、両方の表現型は、免疫応答だけでなく、代謝経路でも異なります。

リーシュマニア症のシステムバイオロジーは、創薬・創薬を通じて新規治療法を創製するための分子標的を同定することを目的としています。シグナル伝達ネットワークと代謝経路の再構築は、リーシュマニア症を全体論的モデルとして理解するのに役立ち、疾患状態を引き起こす主要な要素の特定のための洞察を引き出します。数理モデリングは、リーシュマ^ニア症4の複雑さを理解するための最も好まれる応用分析アプローチの1つです。免疫代謝ネットワークと数理モデルにより、寄生虫⁵を排除するために発現されるM1表現型の主要成分として、コハク酸デヒドロゲナーゼ(SDHA)の同定が可能になりました。合成生物学は、リーシュマニア症の診断、ワクチン開発、治療薬に応用されています。免疫応答調節を標的とする代謝は、合成生物学ツールによって達成できる可能性があります。スフィンゴ脂質代謝を制御し、宿主の免疫シグナル伝達を変化させるイノシトールホスホリルセラミド合成酵素の調節には、双安定な振る舞いを持つ遺伝回路を用いて、L. major感染モデル^6,7の内因性頑健性を合成的に調整した。したがって、システムと合成生物学は、リーシュマニアモデルシステムにおける精密医療の開発のためのモデルベースの遺伝子工学プラットフォームを提供することができます。

M1表現型は、免疫代謝シグナル伝達ネットワークの発現によって特徴付けられ、炎症性サイトカインと代謝経路の産生が相乗的に寄生虫の排除を促進します。M1分極は、インターロイキン-12(IL-12)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)などの炎症誘発性サイトカインの産生を意味します。M1表現型に高度に組み込まれている代謝経路には、解糖系、ペントースリン酸経路、および切断型トリカルボン酸サイクル(TCAサイクル)⁵が含まれます。切り捨てられたTCAサイクルは、コハク酸とクエン酸のレベルを上げることで寄生虫除去機構を指示し、NO³の生成を導きます。SDHAによるコハク酸の蓄積は、転写因子低酸素誘導因子1-α(HIF-1α)の活性化につながり、IL-1β8の産生を誘導します。M2表現型では、脂肪酸の酸化、グルタミン利用の増加、グルコースの酸化的リン酸化の増強が観察され、インターロイキン-10(IL-10)、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-13(IL-13)³などの抗炎症性サイトカインの産生が観察されます。M2は細長いミトコンドリアを特徴としており、エネルギー生成の効率を高めます。それらは、脂肪酸、グルコース、およびグルタミンを基質としてTCAサイクルに燃料を供給するため、より高い速度で酸化的リン酸化を通じてATPを生成し、寄生虫の成長と増殖を促進します⁹。切断されたTCAを介したコハク酸の蓄積に関与するSDHA酵素は、NO産生を促進するだけでなく、電子輸送¹⁰を通じてコハク酸依存性の酸素消費を開始することもできます。リーシュマニアに感染したマクロファージでは、SDHAは2.17倍ダウンレギュレーションされ、好気性呼吸もダウンレギュレーションされる可能性があることを示しています¹¹。コハク酸の消費量を増やして炎症誘発性サイトカイン媒介性NO産生を誘導し、寄生虫の排除を促進するためには、SDHAの発現が不可欠です。

この合成回路は、精密に標的を絞った治療法を提供し、疾患系を変化させて双安定振動を達成し、時空間レベルで健康な表現型を回復させる可能性があります。合成回路の送達と表現により、システムは動的で堅牢になります。合成生物学の進歩に貢献する重要な要因の一つは、複雑なアーキテクチャとカスタマイズされた機能の生成を可能にするために、遺伝的部分と要素をモジュール方式で組み立てる能力にある¹²。従来の発現技術に関連する制約が、テトラサイクリンオペロンベースの誘導性プラスミド合成回路の出現に拍車をかけ、プラスミドの迅速な評価とさまざまな細胞タイプへの容易な送達を可能にしました¹³。テトラサイクリン応答性リプレッサー(TetR)タンパク質は、二量体として存在する場合、テトオペロン(TetO)に対して強い結合親和性を示し、転写を効果的に抑制します。しかし、そのリガンドであるドキシサイクリン(dox)の相互作用により、TetRは構造変化を起こし、TetOから解離し、その結果、転写が妨げられることなく進行します。この回路は、タンパク質翻訳制御¹⁴を示すことができる。したがって、定義された方法論を通じて、設計されたテトラサイクリンオペロンベースの誘導プラスミド合成回路は、pEGFP-N1ベクターでSDHAを発現することを可能にしました。回路の変換効率とその歩留まりの評価により、送達の能力に関する洞察が得られました。ベクターの制限酵素消化により、クローニング効率の決定を確認しました。さらに、Balb/cマウスの腹膜マクロファージに由来するトランスフェクトRAW264.7マウスマクロファージ細胞株が、トランスフェクトされた細胞におけるドキシサイクリン用量依存的な緑色蛍光タンパク質(GFP)発現について観察されました。さらに、トランスフェクションされた細胞における寄生虫除去効果は、合成回路の発現によって裏付けられました。さらに、炎症誘発性サイトカインの誘導および発現が観察され、これは、合成回路の機能が直接関連していた合成回路トランスフェクションおよび誘導細胞における感染時点の増加を通じて指示されました。

プロトコル

1. RAW264.7細胞の細胞培養

注:実験には低いパッセージ番号を使用してください。RAW264.7細胞株は、プネーのBiotechnology Research Innovation Council-National Centre for cell Sciences(BRIC-NCCS)のNational Cell repositoryから調達しました。RAW264.7細胞株はマクロファージ細胞株であるため、継代が増えると分化が始まる可能性があります。細胞を蘇生した後、2継代後に細胞株をトランスフェクションに使用します。

1. RAW264.7細胞株の5 x 10 5細胞を25 cm²フラスコに播種し、5 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を添加し、10%ウシ胎児血清(FBS)および100 I.U./mLペニシリンを完全な培地として添加します。
2. 増殖と増殖のために、5% CO₂ のインキュベーターで 90% のコンフルエントが達成されるまで 37 °C で細胞を保管します。
3. メディアを廃棄し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄します。フラスコにPBS1 mLを加え、スクレーパーで細胞を掻き取り、1.5 mLチューブに細胞を回収します。
4. 細胞を300 x g で5分間、24°Cで遠心分離し、1 mLのピペットを使用して1 mLのDMEM完全培地にペレットを再懸濁します。
5. 0.5%トリパンブルーを使用してセルカウンティングチャンバー内の細胞をカウントし、生細胞の割合を特定します。

2. L. major 寄生虫の細胞培養

注: L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) は BRIC-NCCS からの寄贈でした。Promastigotesの通過番号は10未満である必要があります。通過数が小さいほど、寄生虫は健康であり、マクロファージに感染する能力が高くなります。

1. ロズウェルパークメモリアルインスティテュートミディアム(RPMI)で L.メジャー プロマスタゴテス(MHOM / Su73 / 5ASKH)を栽培し、完全な培地として20%FBSを補充します。
2. 1 x 10⁶ 個の前胸炎を、5 mLの完全培地を含む通気孔のない25 cm² フラスコに播種します。フラスコを27°Cで5日間インキュベートし、明視野顕微鏡で20xの固定期プロマスティゴート L.メジャー 寄生虫を観察します。
   注:固定期前胸茎は、培養後4〜7日で達成できます。それらは、細長い鞭毛状態と運動性の低下によって特徴付けられます。

3. プラスミドをデリバリーベクターとする合成回路の設計

1. 合成回路の部品の設計
   1. Tinker Cellソフトウェアを開き、[パーツ]タブに進みます。ライブラリから プロモーター コンポーネントを選択し、キャンバスに配置して、合成回路内のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを象徴します。TetOに類似したリプレッサー結合部位を[パーツ]タブから取得し、キャンバス上のプロモーターに隣接して配置し、CMVプロモーターとシームレスに統合します。
   2. テトラサイクリンオペレーター(TetO)、内部リボソームエントリーサイト(IRES)、およびコーディング領域をキャンバスにドラッグアンドドロップして、リプレッサー結合部位、リボソーム結合部位(RBS)、およびコーディング領域を組み込み、それらを既存の遺伝的要素と統合します。
   3. コード領域の名前をTetRに変更し、合成回路内で推定される負の調節因子として機能するテトラサイクリン応答性リプレッサーを示します。これらの遺伝的要素をマージして、合成部品の構築を容易にします。
   4. スペーサー領域(sd1)をキャンバスに組み込み、ブタテスコウイルス-1 2A(P2A)などの細胞プロテアーゼによって切断できるように設計されています。目的の遺伝子を表す追加のコード領域を導入し、それをSDHAとして標識し、合成コンストラクトに組み込み、他の要素と統合します。
   5. SDHAコード領域に隣接して、細胞プロテアーゼP2Aによって切断可能な別のプロテアーゼ切断可能スペーサー領域(sd2)を統合します。レポーター遺伝子を表すコード領域を導入し、それをコンストラクトにGFPとして標識します。
      注:GFP式は、SDHAの生成の見積もりを提供し、合成回路が論理的に機能していることを確認^{できる場合があります13}。
   6. GFPの隣にターミネータ(ter1)を追加し、すべての部品が接続されているかどうかを確認して、組み立てられた部品を確認します。回路は、任意の部品をクリックすると赤く表示される必要があります。これは、機能的な遺伝的回路の形成を確認するものです。
   7. 「Reaction」タブで、タンパク質産生のパラメータと初期値を含む調節速度をTetR、SDHA、およびGFPに割り当てて、合成回路内の翻訳反応を描き出します。
   8. 「パーツ」タブから小分子を追加し、「ドキシサイクリン」(dox)と名付け、「パーツと接続」タブから 「入力 」を選択し、「 ウェーブ入力」をクリックして、波動関数を割り当てます。
   9. 「Regulation」タブから、「Repression Reaction」をクリックします。Reaction Rateをキャンバス上のdoxとTetRの間にドラッグアンドドロップします。dox と TetR の間の反応速度論を設定するには、dox の Wave Function アイコンをダブルクリックし、Doxyxycline.sin.amplitude を 10 に調整します。
   10. TetRタンパク質とリプレッサー結合部位との間の転写制御反応を実施するには、 Regulation タブから反応を選択し、TetRとTetOの間のキャンバスに配置します。
   11. 各ComponentとReactionをダブルクリックし、シミュレーションの初期濃度とパラメータを設定します。[Simulation] をクリックし、[Determinic] を選択して、回路を 100 時間単位でシミュレートします。グラフとともにポップアップ表示されるコントロールパネルからシミュレーショングラフを調整し、SDHAタンパク質とTetRタンパク質のグラフパターンを観察します。
2. iGEMパーツレジストリからの遺伝子成分の同定
   1. Registry of Standard Biological parts (Table of Materials)を開き、 Searchをクリックします。遺伝的要素の名前(例:CMV promoter)を入力します。
      注:iGEM IDの検索プロセスは、合成回路のすべての遺伝的コンポーネントに対して実行する必要があります。CMVプロモーターのiGEM IDを特定するための手順がリストされています。その後、他のコンポーネントに対して手順を繰り返す必要があります。
   2. CMVプロモーターのヌクレオチド配列を取得するには、「 Get Part Sequence 」オプションをクリックし、ファイルをテキストファイルとして保存します。
      注:すべての遺伝子部分の在庫が利用可能であることに注意することが重要です。
   3. SDHAを除くすべての遺伝子部分(テトラサイクリンオペレーター、コザック配列、TetR、P2A、GFP)について、ステップ3.2.1とステップ3.2.2を繰り返します。
   4. SDHAのタンパク質コード配列を取得するには、NCBIを開き、検索ウィンドウの横にあるドロップダウンから ヌクレオチド を選択します。Sucocinate dehydrogenase と Mus musculus と入力し、塩基配列を検索します。
   5. CDSオプションをクリックして、SDHAのコーディングシーケンスを取得し、シーケンスをテキストファイルに保存します。
   6. すべての遺伝的調節部分のヌクレオチド配列を1つのファイルに順次マージします。Kozak配列の直後に開始コドン(ATG)を添加し、内部の終止コドンを除去して、新生ポリペプチドの形成を回避します。
   7. ExPASy Web^{サイト 15} を開き、塩基配列を貼り付けます。 「Translate the Sequence 」オプションをクリックします。 5'3' Frame 1 を選択し、結果セクションで赤で強調表示されているストップ コドンを削除します。
      注:ヌクレオチド配列が目的のポリペプチド配列に効果的に翻訳されているかどうかを同定するために、ExPASyなどの翻訳ツールを使用することができます。これにより、望ましくない新生ポリペプチドの防止が保証されます。合成回路を発現するためのpEGFP-N1ベクターの選択は、CMVプロモーターとGFP遺伝子がベクター内にすでに存在していたことを考えると、最適です。すべての遺伝子部分は、クローニングプロトコル(外部委託)を使用して組み立てられました。インサートのクローニングに使用される制限酵素は、NotIおよびXhoIです。これらの制限酵素部位は、pEGFP-N1ベクターのマルチクローニング部位内に位置しています。

4. 大腸菌 (E.coli)DH5α細胞における合成回路の形質転換

1. 大腸菌DH5αコンピテントセルの調製
   注:試薬のオートクレーブ滅菌をお勧めします。試薬は使用時まで4°Cで保存できます。
   1. 1 mLの新鮮な接種物を50 mLのLuria Broth(LB)で37°C、180 rpmで培養します。600nmで0.4〜0.6の光学密度(OD)が達成されるまで、細胞を約2時間成長させます。
   2. 細胞を4,696 x g 、4°Cで15分間遠心分離します。50 mLの遠心分離チューブを反転させ、細胞ペレットを回収することにより、上清を廃棄フラスコに手動で廃棄します。
   3. 1 mLピペットを使用して、ペレットを氷冷した2 mLの0.1 M塩化マグネシウム(MgCl2)に穏やかに再懸濁します。氷冷したMgCl 2で最大20mLの容量を補います_。
   4. チューブを4,696 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てます。1 mLのピペットを使用して、氷冷した0.1 M塩化カルシウム(CaCl₂)1 mLに細胞を穏やかに再懸濁し、氷上で2時間インキュベートします。作りたてのコンピテントセルを形質転換に使用します。
2. 合成回路コンストラクトによるコンピテントセルの形質転換
   1. 50 μLのコンピテントセルを測定し、1.5 mLチューブに細胞を加えます。チューブを氷の上に置きます。10 ngの合成回路コンストラクトをアリコートに加え、氷上に3分間保持します。
   2. ドライヒーティングブロックで42°Cのヒートショックセルを3分間加熱します。乾式加熱ブロックでのインキュベーションが完了したら、細胞を氷上に3分間戻し、1 mLのLBを細胞に加え、37°Cで1時間、250rpmでインキュベートします。
   3. インキュベーションが完了したら、細胞を室温(RT)で4,696 x g で5分間遠心分離し、1 mLピペットを使用して上清を廃棄します。細胞を100 μLのLBに再懸濁し、50 μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天上にプレートします。プレートを反転させ、37°Cで24時間インキュベートします。

5. 合成回路構造の分離

1. 50 mLの遠心チューブに10 mLのLB培地を取り、50 μg/mLのカナマイシンを選択ブロスとしてプラスミド単離用の形質転換細胞を培養します。200 μLチップを使用して形質転換コロニーをピックアップし、選択ブロスに加えます。
2. 接種ループを使用して、別の単一コロニーを選択し、五角形の手法を使用してプレートにスリークし、単一コロニー分離株を維持するために37°Cで24時間インキュベートします。
3. 細胞を180rpm、37°Cで一晩増殖させます。 翌日、培養物を4,696 x g で20分間、24°Cで遠心分離します。 遠心分離後、チューブを反転させて上清を捨て、1 mLの再懸濁バッファー(50 mM Tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl)、10 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、100 μg/mL RNase A(pH-8.0))をペレットに加え、穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁します。
   注:再懸濁バッファーには、混合物を細胞ペレットに加える5分前にRNase Aを添加します。
4. 1 mLの溶解バッファー(0.2 N水酸化ナトリウム(NaOH)、1 %ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))を細胞に加え、チューブを反転させて2分間混合します。チューブを室温で5分間インキュベートします。
5. 1 mLの中和バッファー(3 M Potassium Acetate (CH₃CO₂K))を細胞に加え、チューブを複数回反転させて混合します。細胞を4,696 x g で室温で20分間遠心分離し、上清を1.5 mLチューブに回収します。
6. 上清に500μLのイソプロパノールを加え、反転させてよく混ぜ合わせます。上清を氷上で15分間インキュベートした後、12,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
   注:インキュベーションは5分から1時間の範囲です。この間、5分ごとに反転させて内容物を穏やかに混ぜることをお勧めします。
7. 上清を捨て、1 mLの70%エタノール(冷やしたもの)をペレットに加え、12000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 この手順をもう一度繰り返します。
8. ペレットを風乾し、得られたプラスミドを20 μLの滅菌ヌクレアーゼフリー水(NFW)に再懸濁します。分光光度計でプラスミドの濃度を260/280 nmの波長で測定します。
   注:プラスミド濃度が非常に高い場合は、ナノドロップで推定するためにNFWを追加します。プラスミド希釈のプロセスは、層流フードで実行する必要があります。

6. 合成回路のアガロースゲル電気泳動(AGE)

1. AGE用プラスミドサンプルの調製
   1. 1.5 mLチューブで、1x Tris-acetate-EDTA(TAE)20 μLを測定します。4 μLの6倍ローディングバッファーを加え、ピペッティングでよく混合します。
   2. チューブに素早く遠心させ、合成回路プラスミドベクター1 μgを加え、混合物をピペッティングしてよく混合します。この反応混合物は、アガロースゲルにロードできます。
      注:厳密なピペッティングは、プラスミド構造を損傷する可能性があるため、避けてください。代わりに、試薬を混合するためのクイックスピンを与えてください。
2. 合成回路の消化制限
   1. 1.5 mLのチューブに、2 μLの10x制限バッファー、1 μLのNotI、および1 μLのXhoI制限酵素を加え、内容物を素早く遠心させてよく混合します。1 μgの合成回路プラスミドベクターを添加し、内容物を素早く回転させます。
   2. 内容物にNFWを加え、チューブを素早く回転させることにより、チューブの容量を20μLにします。チューブを37°Cで1時間インキュベートします。
   3. インキュベーション後、チューブを70°Cに15分間乾燥加熱ブロックに置き、制限酵素を不活性化します。チューブの内容物を冷却し、反応混合物に6μLのローディングバッファーを加えます。チューブを素早く回転させて内容物を混ぜます。この反応混合物は、アガロースゲルにロードできます。
   4. アガロースゲルをセットし、前述のプロトコール¹⁶を用いてゲルを泳動する。簡単に説明すると、20 μLのサンプルを各ウェルにロードし、5 μLの1 Kb DNAラダーをロードし、ゲルを100 Vで泳動します。電気泳動が完了したら電源を切断し、ゲルイメージャーでゲルを取得し、蛍光オプションをオンにしてバンドを表示します。

7. RAW264.7細胞株における合成回路コンストラクトのトランスフェクション

1. サンプルの調製
   1. 誘導合成回路による寄生虫除去効果を決定するためのサンプルを準備します。第1のサンプルはトランスフェクションされていないRAW264.7細胞(対照)、第2のサンプルは L. major プロマスタゴテスに6時間感染したRAW264.7細胞(6h Infected)、第3のサンプルはRAW264.7細胞に合成回路をトランスフェクションしdox(IMT)で誘導、感染時点のサンプルはRAW264.7細胞に合成回路をトランスフェクションし、 L. major に感染したdoxで誘導した異なる時点のプロマスタゴテス(IMTI)は、6時間(6時間IMTI)、12時間(12時間IMTI)、18時間(18時間IMTI)、および24時間(24時間IMTI)。
   2. すべてのサンプルを調製するには、25 cm² フラスコからRAW264.7細胞を掻き取り、300 x g でRTで5分間遠心分離します。
   3. ペレットを1 mLのDMEM完全培地に再懸濁します。100 μLチューブに再懸濁した細胞10 μLを取り、0.5%トリパンブルー10 μLを細胞に加えてよく混合します。
   4. 細胞計数チャンバースライドに10 μLの細胞とトリパンブルーミックスをロードし、4つのチャンバーから細胞計数を行います。
   5. カバースリップ底部のプレートセルを96ウェルに2 x 10⁴ セル/ウェルでプレートし、細胞を24時間インキュベートします。このサンプルはコントロールサンプルです。このステップは、他のサンプルの調製でも一定です。
      注意: 使用する前に、メディアをウォーターバスで37°Cに予温してください。
   6. 6時間の感染サンプルを調製するには、1 mLの固定相 L.メジャー プロマスティゴテスを7,273 x g で10分間遠心分離します。ペレットを500 μLのDMEM完全培地に再懸濁し、ステップ7.1.3-7.1.4に従って細胞計数チャンバーで細胞カウントを行います。
   7. 2 x 10⁵L. major promastigotesをウェルに加え、5% CO₂ と37°Cで6時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄します。
   8. IMTサンプルを調製するには、ステップ(7.1.2-7.1.5)に従って細胞をシードし、トランスフェクションステップ7.2.1-7.2.6を実行します。
   9. IMTIの時点のサンプルを準備するには、ステップ7.1.2〜7.1.5に従い、トランスフェクションステップ7.2.1〜7.2.6を実行します。500 μg/mL Geneticin(G418)と 1 μg/μL dox を含む DMEM 完全培地を廃棄し、細胞を 1x PBS で 3 回洗浄します。
   10. 2 x 10⁵L. major promastigotesをウェルに加え、6時間、12時間、18時間、24時間インキュベートします。感染後、DMEM完全培地を含む前胸炎を廃棄し、ウェルを1x PBSで3回洗浄します。500 μg/mL Geneticin(G418)と1 μg/μL DOXを含むDMEM完全培地200 μLを細胞に加え、24時間インキュベートします。
2. 合成回路のトランスフェクション
   1. 1.5 mLのチューブに、改良されたMinimal Essential MediumであるReduced-Serum培地24 μLを加えます。培地に、合成回路プラスミドでクローニングしたpEGFP-N1ベクター1 μgを添加します。
   2. 新鮮な1.5 mLチューブに、24 μLのMinimal Essential Mediumを加え、1 μLのポリエチレンイミン(PEI;1 μg /μL)を加えます。混合物を少なくとも10回ピペッティングしてよく混合し、室温で5分間インキュベートします。
   3. PEIミックスをDNAミックスが入った1.5mLチューブに移します。ピペッティングでドロップワイズに10回以上してよく混ぜます。DNAをインキュベートします:PEIミックスを室温で10分間。
   4. 96ウェルカバースリップの底板にウェルから培地を捨て、細胞をPBSで3回洗浄します。ピペットを使用して、DNA:PEIを細胞に滴下し、プレートを静かに振とうします。細胞を5% CO₂ と共溶かし、37°Cで3時間インキュベートします。
   5. インキュベーション後、200 μLの新鮮なMinimal Essential Mediumを細胞に加え、プレートを静かに振とうし、5% CO₂ で37°Cで24時間インキュベートします。
      注:PEIは細胞毒性があります。したがって、トランスフェクション後の細胞を24時間以上インキュベートしないことが推奨されます。
   6. 翌日、培地を廃棄し、PBSで細胞を2回洗浄します。500 μg/mL Geneticin(G418)と 1 μg/μL dox を含む DMEM 完全培地を細胞に加え、24 時間インキュベートします。
3. 共焦点顕微鏡用のサンプルの固定
   1. すべてのサンプルを固定するには、細胞を1x PBS 3xで洗浄し、細胞に4%パラホルムアルデヒド100 μLを加え、室温で10分間インキュベートします。
   2. 細胞をPBS 3xで洗浄します。洗浄完了後、1 μg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を細胞に加え、室温で15分間暗所でインキュベートします。
   3. インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄します。共焦点顕微鏡で細胞を観察し、GFP発現とDAPI染色を行います。

8. 共焦点顕微鏡法によるトランスフェクション細胞の獲得と定量

1. ウェルのカバースリップ底部を吸収性組織を使用して清掃します。共焦点レーザー走査型顕微鏡のコントロールをオンにします。次に、コンプレッサーと水銀ランプをオンにします。
2. 機械を操作するには、顕微鏡制御、スキャンヘッド制御、レーザーキー、レーザーモジュール、ランプ、顕微鏡コントローラー、およびCPUを順番にオンにする必要があります。
3. コンピュータでソフトウェア(Table of Materials)を開き、[ XYステージコントロールを有効にする]をクリックします。ポップアップが開き、7S3のクリーニングを実行するように求められます。 「いいえ」をクリックします。ライブグラフを閉じて、設定画面を調整します。
4. 60x対物レンズに液浸油を一滴加え、96ウェルプレートカバースリップボトムプレートをステージに置き、ステージをX-Y平面で動かしてウェル上の対物レンズの位置を調整します。 接眼レンズ をクリックし、[ Alexa-488チャンネル]を選択します。 シャッターオフ をクリックして、セルを接眼レンズに焦点を合わせます。接眼レンズを芯と微調整で調整します。
5. 顕微鏡コントロールボックスにある 「シャッターオン 」をクリックし、対物レンズを動かして位置を調整し、微分干渉コントラスト(DIC)で細胞を観察するために対象領域に焦点を合わせます。顕微鏡コントロールボックスで EPIモード に切り替えて、GFP発現用のAlexa-488波長フィルター内の細胞を観察します。セルは緑色で表示されます。
6. シャッターオフをクリックし、LSMイメージングに移動して、画像の解像度を1,024 x 1,024として選択します。[フェーズの追加]をクリックしてドラッグし、フェーズとして緑色のチャネルを追加します。
7. オリンパスのプログラムでは、 LSM をクリックし、さらに Live Button をクリックして、位相コントラストとAlexa 488nmチャネルで細胞を観察します。 Control キーを押しながらスクロールして、画像をキャプチャするためのソフトウェアからセルにフォーカスを合わせます。
8. ゲインとオフセットを調整して、検出器によって捕捉される蛍光強度を調整します。 [キャプチャ]をクリックし、画像に名前を付けて、[ 保存]をクリックします。
9. イメージングソフトウェアで、[ ファイル]をクリックし、拡張子が.oirのすべての画像を選択して、[ 開く]をクリックします。
10. [Tile View] をクリックして、すべてのチャネルの画像を視覚化します。画像にスケールバーを追加するには、[表示]をクリックしてから、[スケールバー]オプションを選択します。
11. 単一チャンネルの画像を16ビットグレースケールとして保存するには、[ ファイル ]をクリックして[ 画像のエクスポート]を選択します。画像を選択し、すべてのチャンネルの 目盛り を確認します。分割ビュー オプションのフレーム選択タブで、[ はい] を選択します。[出力]タブで、焼き込み情報オプション付きの 24ビットRGB カラーを選択し、画像のファイルタイプとして tiff を選択します。エクスポート先のフォルダで、画像を保存する適切なファイルの場所を選択し、[ OK]をクリックします。
12. マージされた画像を保存するには、分割ビューオプションで[いいえ]を選択し、[出力]タブで[ 焼き込み情報付きのマージされたチャネル]を選択する点を除いて、同じ手順に従います。
13. 細胞内のGFPの発現を解析するには、WindowsでFijiを開き、tiffファイルをエクスポートします。GFP発現を分析するには、緑色を選択します。
14. フリーハンドツールオプションを使用して細胞領域を選択し、 Analyse をクリックして蛍光強度を測定します。3つの画像に対してこのプロセスを繰り返します。
15. データを分析ソフトウェアにエクスポートし、定量化されたデータに対して統計テストを実行します。

9. 寄生虫負荷アッセイ

1. 共焦点顕微鏡で細胞を視覚化しながら、個々のマクロファージに存在する寄生虫の総数を数えます。
2. 100種類のマクロファージを無作為に調べ、細胞内寄生虫の数を記録します。IMTIサンプルの感染した時点と時点との間の統計的テストを実行して、寄生虫数に対するSDHA発現の影響を調べます。

10. 酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISA)によるIL-10およびIL-12の定量

1. ステップ 7.1 および 7.2 に従ってサンプルを調製し、1.5 mL チューブに培地を回収します。メディアは氷の上に置くか、さらに使用するまで-20°Cで保管してください。ユーザーキットのマニュアルに従って、IL-10およびIL-12のELISAを実行します。

11. 定量的リアルタイム逆転写PCR(qRT-PCR)を用いたサイトカインプロファイリング

1. 手順 7.1 と 7.2 に従ってサンプルを準備します。ピペットで上清を捨て、500 μLのTRIzol試薬を加え、細胞を室温で2分間インキュベートします。
   注:RNA単離ステップは、RNase汚染に対する安全対策として、層流キャビネットで実行する必要があります。
2. サンプルを1.5mLのチューブに集め、100μLのクロロホルムを加え、チューブを5〜8倍反転させて混合します。サンプルを室温で15分間インキュベートし、サンプルを12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
3. 3つの層が観察され、透明な水性最上層を新鮮な1.5mLチューブに集めます。水層に500 μLのイソプロパノールを加え、10倍反転させてよく混合し、サンプルを室温で15分間インキュベートします。5分ごとに、チューブを反転させてサンプルを再度混合します。
4. サンプルを12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清を捨て、ペレットを水を含む0.1%ジエチルピロカーボネート(DEPC)で作った75%エタノールで5分間洗浄し、4°Cで8,000 x g で遠心分離します。
   注:水を含むDEPCはRNaseを分解するため、RNA単離に使用することをお勧めします。
5. 最後に、ペレットをRTで5分間風乾し、水を含むDEPCの20μLに溶解し、分光光度計を使用して単離RNAの濃度を260/280および260/230の比率で測定します。
   注:260/280の比率は、一般に純粋なRNAの形態を示す約2.0である必要があり、260/230の比率は、単離されたRNAがトリゾールなどの不要な化合物を含まないことを考慮するために2.0〜2.2である必要があります。
6. 各cDNAサンプルを20 μL調製するには、試薬を氷上で解凍し、RTで15秒間短時間スピンします。使用前に、すべての試薬、さらにはRNAサンプルに短時間スピンを加えます。
7. オートクレーブ処理した100 μLチューブで、0.8 μLの25x dNTP、2 μLの10x Primer、2 μLの10xバッファーを取ります。1 μg/μL の濃度の RNA を添加し、0.5 μL の逆転写酵素を添加します。水を含むDEPCを使用して容量を20μLにします。
8. cDNAサンプルをRTで1分間短時間回転させ、サンプルを氷上に保ちます。
9. サーマルサイクラーをオンにし、トップパネルのネジを緩めてホルダーを緩め、サンプルをブロックに置きます。サンプルを置いた後、蓋をしっかりとねじ込みます。
10. システムの電源が入ったら、[ 実行]をクリックします。 メイン オプションを選択し、次にプログラムメニューに入り、 CDNA オプションを選択します。サンプル容量を20 μLと定義し、[ RUN]をクリックします。サーマルサイクラーは、プログラムを4つのステップで実行します。最初のステップは25°Cで10分間、2番目は37°Cで2時間、3番目は85°Cで5分間、最後のステップは永久に4°Cです。
11. サイクルが4番目のステップに入ったら、 Enter をクリックしてサイクルを終了します。サンプルを採取し、qRT-PCRに進みます。RNAサンプルは-80°Cで、cDNAサンプルは-20°Cで保存してください。
12. サイトカインを検出するには、必要な試薬2x PCR Masterミックス、cDNA、およびTNF-α、IFN-γ、TGF-β、およびNFW用のプローブを氷上で解凍します。
    注:すべての試薬、反応混合物、およびサンプルは氷上に保管する必要があります。
13. 100 μLのチューブに、1 μLのcDNAと3.5 μLのNFWを加えてcDNAサンプルを調製します。マスターミックスを調製するには、5 μLのマスターミックスを取り、100 μLのチューブに0.5 μLのプローブを加えます。中身を少し回して混ぜます。サンプル数と標的遺伝子の数を計算し、それに応じて反応ミックスを調製します。
    注:NFWとマスターミックスを100μLチューブの底に加えます。cDNAとプローブを遠心分離管の壁に追加して、容量が追加されることを確認し、試薬のクロスミキシングを避けるための予防措置として。
14. 8ウェルストリップをPCRクーラーに入れます。5.5 μLのマスターミックスとプローブ含有バイアルを8ウェルストリップの各ウェルの底に移します。したがって、すべての標的遺伝子についてこの手順を繰り返します。
15. 4.5 μLのcDNAとNFWの混合物を8ウェルストリップでウェルの壁に移します。したがって、すべてのサンプルに対してこの手順を繰り返します。
16. ストリップを蓋で密封し、10秒間の短い回転を与えて、ウェル内の遺伝子とサンプルを混合します。ストリップをqRT-PCRサンプルスロットにセットし、スロットを閉じます。
17. デスクトップでソフトウェアを起動し、ゲストとしてログインします。画面にポップアップが表示されます。[ 接続せずに続行]をクリックします。
18. [セットアップ]メニューで、[ 詳細設定]をクリックします。[実験のプロパティ] で、実験 の名前を [実験名] タブに記入します。「どのタイプの実験を設定しますか」オプションで、「 定量-比較CT(ΔΔ CT)」を選択します。
19. インストゥルメントでどのランプ速度を使用しますか?タブで、[高速] をクリックします (実行を完了するには ~ 40 分)。プレートセットアップメニューのDefine Targetsオプションで遺伝子名を定義し、Define Samplesにサンプル名を入力します。
20. 「Run Method」タブで、「Reaction Volume Per Well」に10 μLと入力します。ステージを開催する直前に、「 ステージを追加 」をクリックし、「 ステージを保持」を選択します。温度を50°Cに、時間を2分に変更します。2番目の保持段階では、1秒間95°Cになるため、変更を加えないでください。
21. サイクリングステージのステップ1で、温度を95°Cに、時間を3秒に変更します。ステップ2では、温度を60°Cに、時間を30秒に変更します。 Run をクリックして、qRT-PCRサイクルを開始します。

12. 統計分析

注:すべてのデータについて、平均は棒グラフで表され、標準偏差は棒グラフのエラーバーを表します(p値<0.05は有意と見なされます)。

1. データ解析ソフトウェアを開き、共焦点実験から取得したデータを挿入します。
2. 共焦点顕微鏡分析では、GFP発現の多重グループ比較のために、通常の一元配置ANOVAとテューキーの補正テストを適用します。p < 0.05 のデータを統計的に有意であると考えます。平均をバーで表し、標準偏差をエラーバーとして表したデータのグラフィカル表現を準備します。
3. 寄生虫負荷アッセイの場合は、新しいシートを作成し、100個のマクロファージの寄生虫カウントデータを入力します。すべてのサンプル間でテューキー補正を伴う通常の一元配置ANOVAを適用します。p値<0.05のデータを統計的に有意であると考えます。
4. ELISAの場合、Tukeyの多重比較検定で二元配置分散分析を実行します。qRT-PCRの場合、Tukeyの補正検定を使用して一元配置ANOVAを実行します。

結果

合成回路を発現するための合成回路を形成する遺伝子部分の配置を図1Aに示す(図1A)。対応するパーツは、pEGFP-N1ベクターに直交的かつモジュール的にクローニングされました( 図1B)。合成回路のシミュレーションにより、SDHAとテトラサイクリンリプレッサーの両方で振動ダイナミクスが明らかになりました。この観察結果は、周期的な波動関数によって特徴付けられる相互表現パターンを示唆しています。SDHA濃度の増加はドキシサイクリンの誘導に起因する可能性がありますが、TetRの発現はドキシサイクリンのレベルの低下に起因する可能性があります(図1C)。SDHAとTetRの誘導性振動発現がin silicoで観察されたことを踏まえて、pEGFP-N1プラスミドベクターを介した合成回路の送達戦略が設計され、実施されました。

この研究で同定されたiGEMのパーツには、TetOのBBa_K1493803、Kozak配列のBBa_K4344028、TetRのBBa_C0040、P2AのBBa_K1537016がそれぞれ含まれています。SDHAのNCBIアクセッションIDはNM_025848です。これらの部品を組み立てて、合計1317塩基対に及ぶドキシサイクリン誘導性TetON合成回路を構築しました(補足ファイル1)。TetOはDNA調節因子として機能するため、その配列は翻訳されませんでした。SDHAの下流に位置する、5' TetRからP2Aの3'末端まで伸びるKozak配列の下流の配列を、翻訳の in silico 検証のために選択しました。観察の結果、内部終止コドンが存在しないことが明らかになり、配列全長にわたって翻訳が途切れることがなかった(補足ファイル2)。1317 bpからなる合成回路の制御部分は、EGFPの5'上流にあるNotI制限部位とXhoI制限部位の間に挿入されました(図1B)。シーケンシングの結果は、インサート配列がプラスミドにクローニングされたことを強調しています(補足ファイル3)。

大腸菌DH5α株への免疫代謝回路の導入により、細菌の形質転換中に選択的マーカーとして使用される抗生物質であるカナマイシンに対する耐性を示す形質転換コロニーが増殖しました。選択プレート上の形質転換コロニーの豊富な存在は高かったため、コンピテントセルは形質転換の可能性が高いことを示し、利用された形質転換プロトコルの効率を示しています(図1D)。

プラスミドの単離のために、単一のコロニーを単離し、カナマイシンを添加した10mLのLBに播種しました。10 mLの培養から得られるプラスミド収量を 表1に詳述します。この手順では、プラスミド単離の標準的な方法を採用しました。緩衝液はプラスミド単離の前日に新たに調製し、インキュベーション条件を最適化してプラスミド収量を最大化しました。得られたプラスミド濃度は1μg/μLを超え、260/280および260/230の比率はそれぞれ1.8および2.0を超えました。これらの知見は、単離されたプラスミドが高純度であり、タンパク質、EDTA、炭水化物、フェノールなどの汚染物質がなかったことを示しています。

分離された合成回路の電気泳動移動度シフトを評価しました。制限酵素は、合成回路が挿入された制限部位であるNotIおよびXhoI制限酵素を使用して行われました。1%アガロースゲルでは2つのバンドが観察され、1つは1500 bp付近で、もう1つは4 kbから5 kbの間で観察されました。チップサイズが1317 bpであることを考えると、1500 bpのバンドはインサートに対応している可能性があります。pEGFP-N1ベクターのサイズは4.7kbです。したがって、5kb付近のバンドはpEGFP-N1ベクターと推定されます。その結果、完全で無傷の合成回路が送達ベクトル内に存在していたという推論が導き出されました。さらに、未消化のインタクト合成回路について約 6 kb のバンドが検出され、pEGFP-N1 ベクターがプラスミドベクター内に約 1.3 kb のインサートを保持していることが示されました(図 1E)。

図1:合成回路の設計と検証 (A)遺伝子部品と制御コンポーネントの組み立てによる合成回路の表現。(B) SDHAとTetRの周期的発現を100時間単位で示した決定論的シミュレーショングラフ。(C)カナマイシンに耐性のある 大腸菌 DH5αの合成回路形質転換コロニー。単位は決定論的シミュレーションであるため、100 倍単位です。(D)NotIおよびXhoI制限酵素を使用したインタクトおよび制限消化合成回路のアガロースゲル電気泳動。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プラスミドの濃度(μg/mL)	260/280	260/230
1248.5	1.95	2.45
1123.1	1.89	2.43
1155.8	1.87	2.41
1056.8	1.94	2.47

表1:プラスミド単離後に得られた合成回路コンストラクトの収率。 この表は、プラスミドの濃度をμg/mLで示し、その比率を260/280および260/230に示しています。

対照細胞および感染細胞では、観察された蛍光強度はGFPに対して低かった。しかし、プラスミドとPEIを1:1の比率で500 μg/mL G418でトランスフェクションし、1 μg/μL DOXで誘導した合成回路のトランスフェクションでは、IMT細胞で高いGFP発現が誘導されることが観察されました。6時間IMTI細胞では、GFP発現も有意に高かったが、GFP発現はIMTサンプルよりも低かった(図2A、B)。さらに、12時間IMTI、18時間IMTI、および24時間IMTIサンプルでGFP発現の増加が観察されました。この増加は、感染時間の増加によるものかもしれないが、これは、居住型寄生虫¹⁷によるマクロファージの代謝変化の増加を誘発した可能性がある。細胞内SDHAレベルは、感染時間の増加により影響を受ける可能性がある¹⁸。これらのIMTIサンプルにdoxを添加すると、合成回路を介したSDHAレベルが上昇し、SDHAの発現が増加した可能性があります。

DAPI染色は、マクロファージ中の居住性寄生虫の数を同定するために行われました。6時間 L.メジャー 感染マクロファージでは、観察された細胞内寄生虫の数はマクロファージあたり6細胞であり、マクロファージあたり1〜2個の細胞内寄生虫を持っていた6時間IMTIサンプルと比較して高かった。トランスフェクションおよびドックス導入後、感染の異なる時点で細胞内寄生虫負荷の有意な減少が観察されました(図2C)。観察結果は、合成回路がSDHA発現を刺激することにより寄生虫除去効果を誘発した可能性があることを示唆しました。

図2:共焦点レーザー走査型顕微鏡。 コントロール、感染、IMT、および IMTI サンプルの画像。(A)コントロール、6時間感染およびIMT、6時間IMTIの場合は20μm、12時間IMTIの場合は10μm、18時間IMTI、24時間IMTIの場合はそれぞれ50μmのスケールバーを使用したすべての実験サンプルでのGFPの発現分析。使用されたチャネルは、DIC、DAPI、GFP、およびすべてのチャネルのマージされたイメージでした。(B)GFP発現のすべての実験サンプル（n = 3）（p<0.05は有意とみなされる）のテューキー補正検定による一元配置ANOVAエラーバーは標準偏差を表します。(C)Tukeyの補正試験による一元配置ANOVAは、(A)(n = 3)のサンプルについて、100個のマクロファージ細胞における寄生虫負荷の分析を行いました(p < 0.05は有意であると考えられます)。エラーバーは標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

すべてのサンプルの培地中のIL-10およびIL-12レベルを検出したところ、IL-10およびIL-12の濃度は感染後6時間で最も高く、感染後24時間後にサイトカインレベルがダウンレギュレーションされることが明らかになりました。IL-10 と IL-12 のレベルには、合成回路のトランスフェクションと誘導による有意差はありませんでした。また、IMTI時点サンプルでは、IL-10レベルとIL-12レベルに有意差はありませんでした(図3)。6時間感染したサンプルは、IL-10とIL-12の発現を示すことがすでに報告されています^19,20、IL-10とIL-12の有意でない違いを観察したことから、合成回路が他のサイトカインに及ぼす影響を調査することになりました。

図3:IL-10およびIL-12のELISAにより、異なるサンプルの培地中の分泌レベルを同定。 サンプル(n = 2)には、コントロール、6時間感染、24時間感染、IMT、6時間IMTI、12時間IMTI、18時間IMTI、24時間IMTIが含まれます。Tukeyの補正テスト分析による二元配置ANOVAを実行しました(p <.05は有意であると考えられます)。エラーバーは標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

感染した6時間、IMT、および24時間のIMTIサンプルでTNF-α、IFN-γ、およびTGF-βの転写レベルを検出したところ、感染およびIMTサンプルと比較して、24時間IMTIサンプルでTNF-αが2.5倍に有意に増加したことが明らかになりました(図4)。24時間のIMTIサンプルでは、感染サンプルやIMTサンプルと比較して、IFN-γレベルが35倍に増加したことが観察されました。TGF-βレベルは、24時間IMTIサンプルで1.5倍まで有意なアップレギュレーションを示したものの、TNF-αおよびIFN-γと比較して相対的な倍率変化は低く、24時間IMTIサンプルでは炎症誘発性サイトカインが有意にアップレギュレーションされていることを示唆しています。

図4:サイトカインのqRT-PCR解析(A)TNF-α、(B)IFN-γ、(C)TGF-βの6時間感染、IMTおよび24時間IMTIサンプル(n = 2)。テューキーの補正検定による一元配置ANOVAを実施しました(p < 0.05は有意であると考えられます)。エラーバーは標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:遺伝子部分の塩基配列が組み立てられて合成回路を形成した。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:TetR、P2A、SDHAを発現する合成回路の翻訳配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:pEGFP-N1プラスミドにおけるクローニング合成回路のシーケンシング結果。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

得られた結果は、合成回路の設計と実装にチャネル化されたパイプラインの効率を強調しています。この合成回路の構築は、リーシュマニア症のような感染症に対する精密医療の開発に向けた一歩でした。遺伝的部分の in silico アセンブリと決定論的シミュレーションを通じて、TetONシステムの特徴的な調節効果をモニターしました。特に、この回路の影響により、TetRとSDHA/GFPの相互双安定発現につながった可能性があります。SDHAの発現は周期的であり、これはドキシサイクリンの存在下でのみその発現が増加したことを示している可能性があります。.一定期間にわたる発現パターンの潜在的な変化を観察するために、時間単位 100 が選択されました。結果は、合成回路がTetRおよびSDHA/GFPに対して周期的な挙動を示したことを同定し、これはおそらくその直交的な性質に起因する²¹。iGEM部品登録からの遺伝子部品の組み立ては、合成回路²²の構築に必要な遺伝的要素を提供したため、極めて重要な役割を果たした。遺伝子部分のモジュール化は、回路の翻訳および機能が影響を受ける可能性があり、細胞における非効率的な発現および調節効果につながる可能性があるため、不可欠^である23。

合成回路の挿入サイズは、ベクトルのサイズが大きすぎないように約1.3kbであり、これは潜在的に変換効率を低下させる可能性がある²⁴。適切なベクターを選択することは、細菌系でのコピー数を増やし、高いプラスミドコピーを生成するために不可欠な遺伝的部分を持っていなければならず、その発現機構は哺乳動物系にうまく適応しなければならないため、重要なステップである²⁵。pEGFP-N1ベクターは、RAW264.7細胞株で十分に特徴付けられており、複数のクローニング部位を持つコンパクトなプラスミド構造を持っています²⁶。プラスミドの単離には、ラボで標準化されたバッファー溶液を使用して、高濃度で純粋なプラスミドの生成を確保し、分光光度推定とAGEによって検証しました。pEGFP-N1ベクターへの合成回路の挿入は、制限酵素処理によって検証され、サンプルはAGEおよびシーケンシングで分析されました。AGEの結果は、インサートのバンドが1.3 kb、pEGFP-N1ベクターのバンドが4.7 kb、合成回路全体のバンドが6 kbでした。

DNAの1:1、1:2、および2:1の比率を使用したトランスフェクション:PEI比が行われ、観察された1:1の比率が細胞形態を乱すことなく最も効果的に機能しました(データは示されていません)。トランスフェクション細胞の選択には、400μg/mL〜1000μg/mLのG418濃度を使用することが推奨される²⁷。500 μg/mLのG418は、トランスフェクションされた細胞の細胞増殖やトランスフェクションされた細胞の形態を損なうことなく、トランスフェクションされていない細胞の増殖を効果的に抑制するため、トランスフェクションされた細胞の選択に使用されました(データは示されていません)。トランスフェクション効率における細胞表現型の重要性、特に分化を受けてトランスフェクションが困難になる可能性のあるマクロファージ細胞株では、RAW264.7細胞株の継代数が少ないことを形質転換に使用しました²⁸。細胞継代数もトランスフェクション効率の重要な要素となる可能性があります。通過数が高いと、非効率的なトランスフェクション²⁹につながる可能性がある。Doxは、TetRへの高い結合効率、良好な組織分布、低毒性、および24時間³⁰の半減期により、Tet-ON誘導システムの好ましい誘導剤です。トランスフェクション後、細胞をdoxで24時間誘導し、GFP発現を観察しました。RAW264.7細胞の場合、合成回路誘導に使用されたDOXの濃度は1μg/mLであり、これは1-2μg/mLの推奨範囲に収まりました³¹ （データは示さず。しかし、導入後のSDHA濃度の調節は未定でした。全体として、細胞継代数、DNA:PEI濃度、哺乳類トランスフェクション選択マーカー濃度、およびドキシサイクリン誘導濃度の決定と標準化は、トランスフェクションプロセスにおける重要な要素です。

感染後の合成回路を異なる時点で誘導した後、細胞内寄生虫の負荷の大幅な減少が観察されました。感染したサンプルとIMTIサンプルの寄生虫負荷を比較したところ、合成回路で誘導された細胞の負荷が低いことが明らかになりました。これは、おそらくSDHAの発現によるものと思われます。SDHAの発現はNO産生と関連しているため、IMTI細胞は不規則で粗い形態をとることが観察され、これはRAW264.7細胞株でNOが産生されるときに発生する³²。IL-10 と IL-12 のレベルは 6 時間感染後に最も高かったのは、両方のサイトカインがこの時点でアップレギュレーションされていることが報告されているため、IL-10 は IL-12 よりも多く生成されます¹⁹。IL-10およびIL-12レベルはトランスフェクション後およびIMTIサンプルで有意に変化しなかったため、サイトカインプロファイリングを実施して炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン応答を検出しました。

TNF-α、IFN-γ、TGF-βの発現レベルは、6時間感染、IMT、および24時間IMTIサンプルで同定されました。細胞内寄生虫を排除するためには、TNF-αとIFN-γは、NO産生を通じて酸化バーストを誘導するため、主に不可欠です。M2分極マクロファージはTGF-βを発現し、炎症誘発性サイトカインをダウンレギュレートする³³。24時間のIMTIサンプルは、TGF-βよりもTNF-αおよびIFN-γの発現が増加したことを示し、これは、トランスフェクションおよび L.majorへの感染により、マクロファージが表現型を発現する炎症誘発性サイトカインに分極した可能性があることを示唆しています。したがって、この研究は、合成回路によるトランスフェクションによって誘発される表現型の変化に関する洞察を提供し、感染動態を強調しています。治療薬としての合成回路の影響は、それらの誘導が抗炎症性サイトカインと比較して炎症誘発性サイトカイン発現を有意に増加させたため、調査することができます。したがって、この研究は、合成回路の構築と送達パイプラインを確立しただけでなく、 リーシュマニアが挑戦した宿主細胞の炎症誘発性サイトカインのアップレギュレーションを通じて、リーシュマニア症モデルでその治療可能性を実証しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 μL tips	Tarson	521050
10X restriction buffer	BioLabs	R0146S	Restriction digestion
1mL tips	Tarson	521016
1mL tube	Eppendorf	30121023
200 μLチップ	ターソン	521010
25cm2 フラスコ	コーニング	430639	細胞培養用
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール	サーモフィッシャー サイエンティフィ	D1306	核染色
50mL チューブ	コーニング	352070
60mm プレート	ファルコン	353002
6X TrackIt シアン/オレンジ ローディングバッファー	ThermoFischer Scientific	Scientific 10488085	用サンプルのローディング
	ThermoFischer Scientific	160376	共焦点イメージングおよびトランスフェクション用
96ウェルマイクロテストプレートフラットボトムウェル	ターソン	941196
アガロース	シグマ	A9539	AGE用
アガロースゲル電気泳動アセンブリ	GeNei	93	AGE
細菌層流	ESCO ライフサイエンス 2120765		形質転換用
塩化カルシウム	メルク	C4901	緩衝液/試薬調製
細胞培養層流	サーモフィッシャー サイエンティフィ	1323TS	細胞培養用
細胞スクレーパー	Genetix	90020	細胞培養用
セルスプレッダー	フィッシャー1.5mLチューブ用サイエンティフィ	12822775
遠心分離機	エッペンドルフ	EP5404000537
50mLファルコン用遠心分離	サーモフィッシャーサイエンティフィ	75004210
ロフロム			RNA分離
用CO2インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	3110	細胞培養
用キュベット	Eppendorf	6138000018	プラスミド濃度の推定
CYTIVA IQ 500 ゲルイメージャー	Cytiva	29655893	AGE DEPC処理用
H2O 1000 ML	ThermoFischer Scientific	750023	RNA単離用
ドキシサイクリン	メルク	33429	トランスフェクション細胞の誘導用
ドライヒーティングブロック	Labnet		制限酵素の形質転換と不活性化のために
ダルベッコの改変イーグル培地	細胞科学		細胞培養用
エタノール	Sigma-Aldrich	1.00983	緩衝液/試薬調製
臭化エチジウム	Sigma	E7637	AGE用
エチレンジアミン四酢酸	フィッシャーサイエンティフィ	12635	緩衝液 /試薬調製
Evos 明視野顕微鏡	ThermoFischer Scientific	AMEX1000
ExPasy	https://web.expasy.org/translate/		合成回路の構築用
ウシ胎児血清	Gibco	16000-044	細胞培養用
FV31S-SW ソフトウェア	Olypmus		画像取得
Geneticin	Gibco	トランスフェクション用	1563411
ギブソンアセンブリ法によるクローニング	BIOMATIK		合成回路の構築
Graphpad プリズム	グラフパッド		統計解析
大容量cDNA逆転写キット	ThermoFischer Scientific	4368814	for cDNA synthesis
イソプロパノール	フィッシャー サイエンティフィ	13825	緩衝液/試薬調製
カナマイシン	シグマ	60615	形質転換およびコロニー選択用
ルリア・ベルティーニブロス	ヒメディア	M1245	培養用 E.coli
塩化マグネシウム	フィッシャー・サイエンティフィ	BP214	緩衝液/試薬調製
マイクロフィルト 垂直層流	マイクロフィルト
MicroAmp Fast 8チューブストリップ、0.1 mL	ThermoFischer Scientific	4358293	qRT-PCR用
MicroAmp光学8キャップストリップ	ThermoFischer Scientific	4323032 Mula	for qRT-PCR
電子レンジ	LG	MC-7649DW	AGE
Mm00434228_m1用 (IFN-γ)	サーモフィッシャー・サイエンティフィ	4331182	タクマン・プローブ
Mm00443258_m1 (TNF)	サーモフィッシャー・サイエンティフィ	4331182	タクマン・プローブ
Mm01321739_m1(TGFB)	サーモフィッシャー・サイエンティフィ	4331182	タクマン・プローブ
マウス ELISA キット IL-10	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	BMS614	ELISA
マウス用 ELISAキット IL-12	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	BMS616	ELISA
Multiskan Sky (タッチ スクリーン付き) + μ	ELISA	ThermoFischerサイエンティフィック	51119600DP
96ウェル細胞培養プレートミキサー調整可能0-1500rpmラボシェーカー改拌機	DIAB
情報国立センター	回路の構築のための	https://www.ncbi.nlm.nih.gov
バウアーの部屋マリ	エンフェルドスーペリア	640010	セルカウントの場合
ノンベント 25cm2 フラスコ	コーニング	353014	寄生虫の培養用
NotI	BioLabs	R3189M	制限酵素
ヌクレアーゼフリー水	バイオデザイン	1QIA	試薬調製
オリンパス セル Sens Dimension デスクトップ 2.3 ソフトウェア	オリープマス		画像処理
オリンパス FV 3000	オリンパス		共焦点イメージング用
OPTI-MEM培地	Gibco	31985070	トランスフェクション用培地
pEGFP-N1ベクター 合成回路でクローニング	Biomatik
ペニシリン	サーモフィッシャー サイエンティフィック	15070063	細胞培養用
ポリエチレンイミン	MERCK	764965	フェクション用
酢酸カリウム	フィッシャー科学	YBP364500	緩衝液/試薬調製
塩化カリウム	フィッシャー Scientific	BP366	緩衝液 /試薬調製
リン酸カリウム モノベーシック	Sigma	P5655	緩衝液 /試薬調製
電源パック	BIORAD	1645070	標準
生物部品のAGE登録	https://parts.igem.org/Main_Page		合成回路の構築用
RNAiso Plus	宝	38220090	RNA単離
用 RNase A	サーモフィッシャー サイエンティフィ	12091021	バッファー/試薬調製
ロズウェルパーク記念研究所 ミディアム	国立細胞科学		寄生虫の培養用
シェイカーインキュベーター	REMI	CIS 24 plus	培養用 E.coli
塩化ナトリウム	Qualigens	Q27605	緩衝液/試薬調製
ドデシル硫酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	L3771	緩衝液/試薬調製
水酸化ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	15895	緩衝液/試薬調製
リン酸二塩基性	シグマ	S5136	緩衝液/試薬準備
分光光度計	エッペンドルフ		プラスミド濃度の推定
スピンウィン	Trason	1020
StepOne plus リアルタイムPCRシステム	ライフテクノロジー	272006777	qRT-PCR
StepOneソフトウェアバージョン2.3	ライフテクノロジー		qRT-PCR用
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNG	ThermoFischer Scientific	4366072
Tinker 細胞			合成回路の構築とシミュレーション
TrackIt 1 Kb Plus DNA ラダー	ThermoFischer Scientific	10488085	For AGE
トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン塩酸塩	Himedia	MB029	バッファー/試薬調製
トリス-酢酸-EDTA	SERVA	42549.1	バッファー/試薬調製
トリパンブルー	Sigma	T8154	細胞数用
XhoI	BioLabs	R0146S	制限酵素