方法論記事

フローサイトメトリーによるHoechst側集団細胞の効果的な検出

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DOI：

10.3791/67012

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2024年8月23日

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1Institute of Hematology, Department of Hematology, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, 2The Lab of Aging Research, State Key Laboratory of Biotherapy, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 3Precision Medicine Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

この記事について

サマリー

ここでは、高出力の375 nmおよび405 nmレーザーがHoechst 33342を効果的に励起し、サイドポピュレーション(SP)細胞検出用の355 nmレーザーの実行可能な代替品として機能することを示し、それによりフローサイトメトリーアプリケーションで利用可能なレーザーの範囲が広がります。

要約

サイドポピュレーション(SP)細胞は、Hoechst 33342染色によって同定され、フローサイトメトリー(FCM)を使用して分析されます。Hoechst SP法は、ATP結合カセット(ABC)トランスポーターの色素排出特性に基づく幹細胞の単離に利用されています。この方法は当初、造血幹細胞(HSC)の同定と単離に採用されましたが、現在では主にがん幹細胞(CSC)の同定と単離に焦点を当てるように進化しています。FCMの従来の検出法では、355 nmレーザーを使用して色素を励起し、SP細胞を検出します。この研究を通じて、355 nmレーザーを使用したSP細胞の検出を効果的に置き換えることができる色素励起の代替アプローチを特定することに成功しました。これは、高出力の375nmまたは405nmレーザーを利用することで実現されます。これにより、355 nmレーザーフローサイトメトリーのみに限定されるのではなく、SP細胞の検出において選択性を高めることができます。

概要

サイドポピュレーション(SP)細胞は、Hoechst 33342染色によって同定され、フローサイトメトリー(FCM)を使用して分析されます。SP細胞は、それらのATP結合カセット(ABC)トランスポーター1,2を介して、蛍光DNA色素を細胞からポンピングすることを特徴としている。この方法はもともと、マウスの骨髄造血幹細胞(HSC)を単離するために確立されました1。骨髄SP細胞は、CD117+Sca-1+Lin-Thy1低発現3,4を特徴とするHSCの集団で濃縮されました。その後、この方法は、心筋5、肝臓6、肺7、腎臓8、および前脳9などの他の組織から幹細胞を単離し、濃縮するために広く使用されました。特に、この方法は過去10年間でがん幹細胞(CSC)の単離に適用されてきました。CSCは、腫瘍の開始、自己再生、化学療法に対する耐性、および転移性の特性を持つ細胞の小さな集団を表しています10。CSCは、最初に造血悪性腫瘍11で同定され、その後、前立腺12、卵巣13、胃14、乳房15、および肺16癌などのさまざまな固形腫瘍で観察されました。CSCの同定にはさまざまな技術がありますが、SP技術は、多様な組織や細胞株に幅広く適用できるため、依然として好まれる選択肢です。さらに、これは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)16,17,18を用いてCSCを単離する貴重な技術である。実験結果は、SP細胞が顕著な腫瘍原性を示し、幹細胞関連遺伝子の発現レベルが高いことを示しています19,20。私たちの以前の研究21では、多発性骨髄腫で単離されたSP細胞のトランスクリプトーム分析により、ヘッジホッグ経路などの幹細胞に関連するシグナル伝達経路の濃縮が明らかになることも示されました。一方、急性骨髄性白血病のSP細胞で差次的に発現する遺伝子のパスウェイエンリッチメント解析を行った22。改変された遺伝子は、幹細胞関連経路(Wnt/β-カテニン、TGF-β、ヘッジホッグ、ノッチ)に富んでいました。その結果、BALB/c欠損マウス22では1×105 SP細胞が腫瘍を形成できるのに対し、非SP細胞は腫瘍を形成できないことがわかったことから、SP細胞は白血病幹細胞の特徴を持っていることが示された。CSCの同定におけるHoechst SP法の有効性は明らかです。

Hoechst SPのプロトコールは、研究の進展を通じて洗練され、強化されてきました。このプロトコルでは、色素濃度、細胞密度、インキュベーション温度とインキュベーション時間、緩衝液組成、およびpH値を厳密に制御する必要があります。このプロトコルに従って調製した細胞サンプルをフローサイトメトリー分析に供した。355 nmのUVレーザーによるHoechst色素の励起と、690/50 nmフィルター(Hoechst Red)と450/50 nmフィルター(Hoechst Blue)の両方を使用してその蛍光発光を検出するため、FCMには350 nmレーザーが必要です。ただし、350 nmレーザーはコストが高いため、ほとんどのFCMには一般的に装備されていません。したがって、フローサイトメトリーによるSP細胞の効果的な検出のための色素励起の代替アプローチを見つけることを試みました。この研究では、375 nmおよび405 nmレーザーのSP細胞検出能力を評価し、355 nmレーザーの能力と比較しました。私たちの発見は、355 nm、375 nm、および405 nmのレーザーによって検出されたSP細胞間の顕著な類似性を示しています。これらの結果は、高出力の375nmおよび405nmレーザーが、SP細胞検出のための355nmレーザーの実行可能な代替手段として役立つことを示唆しています。Hoechst 33342 には励起光源を追加することで、より多くのフローサイトメトリーモデルの使用が容易になります。

プロトコル

この研究の実験では、8週齢から12週齢のC57BL/6マウスを合計10匹利用しました。実験的な操作は、四川大学の動物施設管理および使用委員会(#201609309)によって承認されたプロトコルに従って行われました。この記事で使用した実験材料とフローサイトメトリーのパラメータは、 材料の表に記載されています。

1. マウス骨髄細胞の単離と採取

  1. 施設のガイドラインに厳密に従ってマウスを安楽死させます。マウスに意識喪失を誘発するには、2%イソフルランから吸入麻酔薬を投与し、続いて呼吸が止まるまで5%イソフルランへの投与量を徐々に増やします。.
  2. 手術室またはヒューム食器棚でマウスを解剖します。マウスを70%エタノールで洗浄し、滅菌します。
  3. 鋭利なハサミで脚の皮膚と筋肉を完全に切り、大腿骨を解剖します。
  4. 乳鉢で大腿骨を砥石で優しく粉砕し、骨が白くなるまでDMEM培地で骨髄細胞を洗い流します。
  5. 得られた骨髄細胞を100μmフィルターで15mLチューブにろ過します。800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  6. 上清を捨て、残存赤血球を1 mLの赤血球溶解バッファーで4°Cで1分間溶解します。 800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 遠心分離後、再度DMEM培地で洗浄してください。
  7. 細胞を2 mLのインキュベーション溶液(DMEM培地+ 5% FBS)に再懸濁し、自動セルカウンターで細胞をカウントし、インキュベーション溶液で細胞濃度を1.0 x 106 細胞/mLに調整します。

2. 細胞染色

  1. 各マウスの骨髄細胞懸濁液2 mLに5 μg/mL Hoechst 33342を添加します。別の1 mLアリコートに、ネガティブコントロールとして100 μMベラパミルを追加します。
  2. 37°Cの水浴中で90分間インキュベートし、30分ごとに穏やかに攪拌します。
  3. インキュベーション後、細胞を氷上で5分間冷却し、次いで250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 細胞をコールドランニング溶液(HBSS + 2% FBS)に再懸濁します。4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
  4. 得られた細胞ペレットを、サンプルあたり500 μLの流溶液に再懸濁します。FCM分析に先立ち、細胞に2 μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)を添加し、氷上に約5分間置きます。

3. フローサイトメトリー

メモ: 使用されているさまざまなシステムと構成の概要については、 表 1 を参照してください。

  1. FCMの日常の品質管理(QC)フルオロスフィアを使用して、必要なチャンネルの変動係数(CV)値を校正し、品質管理が正常に完了した後にサンプルテストを実施します。
    1. ソフトウェアのデスクトップショートカットを選択し、ソフトウェアを起動します。
    2. QC/Standardizationメニューの Start QC/Standardization を選択して、QC実験にアクセスします。
    3. QCフルオロスフィアのサンプルチューブをチューブホルダーに挿入します。
    4. [ 開始 ]を選択してサンプルをロードし、QC 手順の実行を開始します。FCMは、QCパス後にすぐに使用できます。
  2. 同じサンプルのHoechst 33342色素をそれぞれ355 nm、375 nm、405 nmレーザーで励起し、690/50 nmチャネルのHoechst赤色と450/50 nmチャネルのHoechst青色を検出します。
    1. [ファイル] メニューの [新しい実験 ] を選択して新しい実験を作成し、ファイル パスを指定して実験を保存します。
    2. [設定] メニューの [ チャネルの設定 ] を選択します。チャンネル信号のチェックボックス(Y585、V450、V660、NUV450、NUV660、UV450、UV660)を選択し、ラベル列に試薬名を追加します(Y585:PI;V450:ヘキストブルー-405 nm;V660:ヘキスト赤-405 nm;NUV450: ヘキストブルー-375 nm;NUV660: ヘキストブルー-375 nm;UV450:ヘキストブルー-355nm;UV660: Hoechst Blue-355 nm)。
    3. プロット領域の 「疑似カラープロット 」アイコンをクリックして、プロットを作成します。軸名を選択して、表示するチャンネルを変更します。
    4. Test Tube画面でAdd Tube をクリックすると、新しいサンプルチューブが作成され、名前が変更されます。
    5. [実行] を選択してサンプルを読み込み、プロットを表示し、ゲートを確立します。ゲインとスレッショルドの設定を調整します。[レコード] を選択してデータを保存します。
  3. ゲート設定ロジックを設計します。
    1. 最初のプロットでは、 X軸 をクリックしてFSC-Wを選択し、 Y軸 をクリックしてFSC-Aを選択します。 [ポリゴン ゲート ] を選択して、ゲート A を描画し、個々のセルを円で囲み、接着セルを除外します (図 1A)。
    2. 2番目のプロットでは、 X軸 をクリックしてFSC-Aを選択し、 Y軸 をクリックしてSSC-Aを選択します。 Polygon Gate を選択してゲートBを描画し、非断片的な細胞を分離し、細胞破片を除外します(図1B)。
    3. 3番目のプロットでは、 X軸 をクリックしてPI-Aを選択し、 Y軸 をクリックしてSSC-Aを選択します。ゲートDを描画する ポリゴンゲート を選択し、PIが負の生 細胞を示す生細胞 (図1C)を選択し、ゲートCを描画して生細胞を取得します。
    4. 4番目の2次元プロットでは、 X軸 をクリックしてHoechst Redを選択し、 Y軸 をクリックしてHoechst Blueを選択します。 プロット を右クリックし、ドロップダウンメニューから プロパティ を選択します。 「リニアフォーマット」fを選択するか、X 軸と Y 軸の両方を選択します。 [Polygon Gate ]を選択してゲートSPを描画し、SPセルを取得します(図1D)。
  4. サンプルの適格性を評価するには、SP細胞の検出に355 nmの特異的フローサイトメーター23 を使用します。
  5. 355 nm(レーザー出力:20 mW)と405 nm(レーザー出力:80 mW)のレーザーを同時に使用して、コントロール細胞(ベラパミルを添加)と実験細胞の両方を検出します。
  6. 2つのレーザーに対応する690/50 nmおよび450/50 nmチャネルで蛍光シグナルを取得します。透明なSP細胞を用いて、355 nmおよび405 nmレーザーによるHoechst 33342色素の効果的な刺激を観察します(図2B-C)。
  7. 同じサンプルに対して、細胞検出には375 nm(レーザー出力:60 mW)および405 nm(レーザー出力:80 mW)のレーザーを使用します。

結果

図2では、対照群をベラパミルで処理し、幹細胞中のABCトランスポーターをブロックしてHoechst 33342の排除を防止しました。これにより、非ベラパミル基の幹細胞はヘキスト33342を排出し、SP細胞として知られる陰性細胞集団を形成します。355 nmレーザーはHoechst 33342色素を効果的に励起し、骨髄のSP細胞を鮮明に観察しました(図2A)。355 nmレーザーと405 nmレーザーで検出した同じサンプルのSP細胞は、基本的に同一であることがわかりました(図2D)。

図2と図3から、従来とは異なる流量計の他のモデルでもSPセルを識別できることがわかりました。この結果は、375 nmレーザーと405 nmレーザーの両方がHoechst 33342を効果的に励起してSP細胞を得たことを示しています(図3A-B)。CSCまたはHSCを検出または分離する必要がある場合は、355nmレーザーの代わりに375nmまたは405nmレーザーを選択できます。

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図1:SP細胞を検出するためのフローサイトメトリーベースのゲート設定ロジック(A)FSC-AおよびFSC-Wを使用して、接着細胞を除外しました。ゲート A は、シングルセル クラスターを表します。(B)FSC-AおよびSSC-Aのパラメータは、細胞破片の除去に採用されました。ゲートBは、非フラグメントセルクラスターを表します。(C)陰性のヨウ化プロピジウム(PI)を示す生細胞を選抜した。ゲート C はライブ セル クラスターを表します。(D)蛍光シグナルは、690/50 nm(Hoechst-red)および450/50 nm(Hoechst-blue)チャネルを通じて取得しました。ゲートSPは、SPセルクラスタを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:高出力405nmレーザーは、355nmレーザーと同等の効果でSP細胞を検出します。 (A)Hoechst 33342色素を、従来のフローサイトメーターからの355 nmレーザーによって励起し、骨髄のSP細胞を検出しました。(B、C)骨髄のSP細胞は、同じFCMの355nmおよび405nmレーザーによって同定されました。(D)355 nmレーザーと405 nmレーザーで検出した同一試料のSP細胞は、基本的に同一であることがわかりました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:高出力375nmおよび405nmレーザーはSP細胞を検出できます。(B)骨髄のSP細胞も405nmレーザーを用いて検出することができる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

レーザータイプレーザー波長(nm)レーザー出力(mW)ヘキスト赤色フィルター (nm)ヘキストブルーフィルター(nm)
モフロアストリオスEQアルゴンガス355100692/75448/59
サイトフレックスLX半導体35520690/50450/50
40580690/50450/50
サイトフレックスS半導体37560690/50450/50
サイトフレックス SRT半導体40580690/50450/50

表1:フローサイトメーターの構成の概要。

ディスカッション

記載されているプロトコルを使用して3つの実験を行い、各試験には3〜4匹のマウスを使用し、合計10匹のマウスを作成しました。SP細胞の割合は0.05%から0.76%の範囲であった。マウス間で個々の変動が観察されたことに注意することが重要です。4つのフローサイトメーターを使用して、Hoechstサンプルを分析しました。新しいバージョンのフローサイトメトリーでの20 mW 355 nmレーザーによるHoechst色素の励起は、旧式のフローサイトメトリーでの100 mW 355 nmレーザーの励起と同等であることが観察されています。この現象は、両方のシステムで使用されるレーザーの種類の違いに起因する可能性があります。375 nmおよび405 nmレーザーで観察された効果の潜在的な理由は、アバランシェフォトダイオード(APD)検出器の利用と組み合わせた両方のレーザーの大幅な出力に起因する可能性があります。Hoechst Red-Aチャネルは、光電子増倍管(PMT)の光電変換効率が比較的低かった690nmの赤近傍長波長を捉えました。しかし、APDはPMT24の約10倍の光電変換効率を示しました。そのため、高出力の375 nmおよび405 nmレーザーと組み合わせることで、APD検出器はSP細胞を効率的に区別します。405 nmレーザーは、SP細胞を効果的に検出するだけでなく、355 nmレーザーと比較して、弱いヘキストレッド陽性集団のサブセットを区別する優れた能力も示します。

このプロトコールの重要なステップは、375 nmレーザーまたは455 nmレーザーによるフローサイトメトリーを使用して、690/50 nm(Hoechst-赤)および450/50 nm(Hoechst-青)チャネルの細胞を検出することです。この手法では、FCMで一般的な355 nmレーザー(従来のSP細胞分析用レーザー1)ではなく、375 nmおよび405 nmレーザーでSP細胞を検出しますが、高出力の375 nmおよび405 nmレーザーが必要です。これが、このテクノロジーの限界につながります。この方法の重要性は、Hoechst色素の検出に使用されるレーザーの範囲を拡大し、他のフローサイトメトリーモデルをSP細胞の検出に使用できるようにすることです。

開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(No.81800207)からJ.H.への助成金によって支援されました。Beckman Coulter, Inc.のフローサイトメトリーとパラメータキャリブレーションのサポートにご協力いただき、大変感謝しています。フローサイトメトリーデータ取得にご協力いただいた四川大学西中国口腔病病院口腔疾患国家重点研究所のJiao Chen氏と、四川大学華西病院再生医療研究センターのYu Qi氏に感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
自動セルカウンターCountstar1M1200
Cell Filter(100 & micro;m)BIOFILCSS-013-100
毎日の品質管理 fluorosphereベックマン・コールターB5230
4.5g/L グルコース (DMEM medium) によるイーグルス培地の Dulbecco の修正CORNING10-013-CVRC
シ胎児血清CORNING35-081-CV
HBSSHycloneSH30030.02
Hoechst33342Sigma-AldrichB2261
ヨウ化プロピジウム (PI)Sigma-AldrichP4170
赤血球溶解バッファーBeyotimeC3702
ベラパミルSigma-AldrichV4629
ウ

参考文献

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