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方法論記事

ねじれた精巣の固定:精巣の虚血再灌流障害のラットモデル

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DOI:

10.3791/67181

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2025年11月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Ladoke Akintola University of Technology, 2Department of Anaesthesia, Afe Babalola University, 3Department of Pharmacology, Bowen University, 4Reproductive Biology and Toxicology Research Laboratory, Oasis of Grace Hospital

この記事について

サマリー

この記事では、精巣の虚血再灌流損傷の病理学的メカニズムの研究において、精巣捻転の再現可能なモデルを作成するための精巣虚血/再灌流のモデルを作成するための段階的な手順について説明します。

要約

虚血再灌流 (IR) 損傷は、精巣損傷を含むいくつかの病状に関連しています。精索をねじって虚血を達成する精巣IRの初期の動物モデルは、モデルを一貫して再現できない多くの技術的な問題をはらんでいます。したがって、簡単に再現できるラットモデルで精巣IRを誘導するための簡単な方法を提示します。

この方法には、精巣からガバナキュラムを分離し、陰嚢を作成し、精巣をその下極で時計回りに720°ひねり、精巣を陰嚢の基部に固定することが含まれます。このモデルは精巣血管を効果的に収縮させ、精巣虚血を誘発します。虚血の1時間後、アンカーステッチが取り除かれ、精巣がねじれません。コードとそれに付随する容器は、開通性を確認するために検査されます。IR の後、精巣が収集され、組織病理学的評価のために切片化されます。

精巣の組織学は、限局性出血性病変、血管うっ血、間質腔の拡大、および炎症細胞の浸潤について検査されました。さらに、酸化ストレス(マロンジアルデヒド、還元グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ)、炎症(MPO、TNF-α、IL-1β)、およびアポトーシス(カスパーゼ3発現)のマーカーがアッセイされました。この方法は、精巣IR損傷の病態生理学を研究するための、よりシンプルで再現性のあるモデルを提供します。さらに、このモデルは、精巣 IR 損傷の管理における潜在的な治療薬を探索するための窓を開きます。

概要

精巣捻転 (TT) は、精索とそれに付随する血管がねじれ、精巣の虚血を引き起こす急性泌尿器科の緊急事態です。激しい腹痛、吐き気、嘔吐が特徴です1.虚血は、タイムリーなねじれによって解決されない場合、壊死および関連する精巣の喪失をもたらします2.しかし、精巣への血流のねじれをほどいて回復させることによるタイムリーな外科的介入は、虚血再灌流障害 (IRI) を引き起こし、精巣とその機能の組織学的および生化学的破壊をもたらします 3,4。

TT の動物モデルは、IRI のメカニズムを調査するために広く使用されており、これは常に TT が壊死に進行するのを防ぐ試みから生じます 5,6。TTには、精索クランプと臍帯ツイストの2つのモデルがあります。どちらも無菌状態と適切な麻酔下で行われます。使用される一般的な麻酔薬には、ケタミン単独またはキシラジン7 との併用が含まれます。他一般的に使用される麻酔薬はウレタンとチオペンタールナトリウムであり、通常は腹腔内に投与されます7。それにもかかわらず、どちらのモデルにも限界があります。

微小血管クリップ8,9による精巣動脈の直接クランプは、クランプの取り外しによる再灌流の誘導前の所定の時間(通常は1時間)虚血を誘発する手段として使用されてきましたが、この方法は精巣の捻転の臨床的外観を正確に模倣していません10。さらに、虚血を達成するための精索の外科的ねじれ11,12 は臨床症状をより代表していますが、この主題に関する記事の方法セクションで遭遇した短い説明では対処されていない多くの技術的な問題をはらんでいます。

しばしば遭遇する明らかな技術的困難は、虚血期間中のねじれの緩みを防ぐために精巣を陰嚢の底に戻して固定することです。一部の研究者は、精巣の陰嚢壁への固定について言及していませんが13,14、他の研究者は、白膜を陰嚢壁に縫合することによって精巣を陰嚢壁に固定することを処方しています 15,16,17。精巣を陰嚢壁に固定するプロセスの説明は、概して非常に簡潔で明示的ではありません7,18。したがって、以前の記事の方法セクションで説明された手順を複製しようとする試みは、白膜に穿孔することによる精巣の損傷や、過度の圧力をかけずに精巣を陰嚢に戻すことができないなど、深刻な実際的な困難に直面しています。さらに、実際には、ねじれを誘発した後の精巣の陰嚢への復帰は、実験的 TT を外科的に誘発する試みにおける大きな課題でした。したがって、このような技術的な困難により、異なる研究者間でモデルを一貫して再現することができなくなりました。

したがって、ラットのTTモデルを作成するためのこの研究で説明されている手順は、以前のモデルで遭遇した技術的な問題を特定し、それらに対する解決策を提供します。このモデルは、簡単に再現でき、人間の経験を模倣するシンプルな手法を提供します。したがって、このモデルは、IRI から生じる病理学的メカニズムの研究における信頼性が高く再現性のある出発点です。

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プロトコル

この研究は、ナイジェリアのオヨ州オグボモソにあるラドケ・アキントラ工科大学基礎医学部の倫理審査委員会によって承認されました (ERCFBMSLAUTECH:033/05/2024)。この研究には、生後10〜12週、体重180〜10 gの20匹の雄アルビノWistarラット±使用しました。それらを2週間順応させた後、偽手術群(SO)またはねじれ/捻転群(T / D)のいずれかにランダムに割り当てました(グループあたりn = 10ラット)。SOラットは、T/Dラットと同様に同様の手術を受けましたが、精巣はT/Dを誘発するためにねじれたり固定されたりしませんでした。

1. 術前の準備と麻酔

  1. 動物(SOおよびT / Dグループ)を手術前に12時間絶食して一晩さらします。
  2. 手術当日、ケタミン50mg/kgとキシラジン10mg/kgの併用で動物(SO群、T/D群)を腹腔内麻酔し、肉足の圧迫やひげの軽刺激に対する動物の反応の欠如を観察し、麻酔の妥当性と深さを確認する。
  3. 動物の左陰嚢、会陰、鼠径部(SOおよびT / Dグループ)を剃り、メチル化スピリットとポビドン消毒液で洗浄します。

2.精巣の虚血の誘発

  1. 精巣の動員
    1. 腹部にゆっくりと下向きの圧力をかけて、左精巣(SO群とT / D群の両方)を陰嚢に押し込みます。
    2. 左精巣(SO群とT/D群の両方)をしっかりとつかみ、長さ~1.5cmの陰嚢を強く切開し、膣膜(TV)内の下にある精巣を露出させます。
    3. 精巣の下極(SOグループとT / Dグループの両方)、特に精巣上体尾を見つけ、小さな解剖はさみで上にあるテレビに傷をつけます。
    4. はさみをテレビの下に置き、少し広げてテレビの両端を見せてから、湾曲した蚊動脈鉗子で両側の端をつかみます。これは、SO グループと T/D グループの両方に適用されます。
      注:このステップは、捻転の誘導後に精巣を陰嚢に簡単に戻すことを可能にする組織面を確立するため、非常に重要です。
    5. テレビの切開部(SOグループとT / Dグループの両方)を近位に~0.5cm延長します。
    6. 下腹部に穏やかな圧力をかけて精巣を外側にします(SOグループとT / Dグループの両方)。
    7. T / Dグループの場合のみ、精巣を動員して精巣を識別し、それを切断して精巣を陰嚢の床から切り離します。
      注:このステップは精巣をねじることができるため、重要です。ガバナキュラムは、精巣の尾端から鼠径管まで伸び、つまみのような拡張で終わる靭帯として識別されます19,20。
    8. 精巣(T / D動物の)精巣をその下極(精巣上体が位置する場所)でつかみ、時計回りに720°ひねって時間を記録します(虚血の開始を示します)。
  2. 虚血性精巣の固定
    1. ねじれた精巣(T / D動物の)を所定の位置に保持し、長い解剖はさみをテレビの下の組織面に沿って陰嚢に押し下げて嚢を形成して陰嚢を作成します。
    2. T/D動物のみ、ハサミを所定の位置に保持し、先ほど作成した陰嚢嚢の最下点の外側からクロミック2-0縫合糸を使用してアンカーステッチを挿入してアンカーステッチを挿入します。ステッチを精巣の下極の結合組織に挿入し、ポーチの中に戻し、最初の侵入点の隣に戻します。
    3. ねじれた精巣(T / D動物の)を陰嚢に引き寄せ、縫合糸の両端に下向きの牽引力を穏やかに加えて精巣を陰嚢の基部に固定し、縫合糸の両端を陰嚢の皮膚にしっかりと結びます。
    4. クロム2-0を使用した連続巾着縫合糸で(SOおよびT / D動物の)陰嚢切開を閉じます。
      注:これは、再灌流を行うときに簡単に除去するために推奨されます。

3. 生化学的および組織病理学的調査

注: 生化学的アッセイおよび組織病理学的検査を実施する研究者が研究プロトコルを知らされていないことを確認してください。

  1. 実験期間の終わりに、動物を一晩12時間絶食させ、安楽死させます(50 mg / kgのケタミンおよび10 mg / kgのキシラジンip)。
  2. 左精巣を取り外し、付着構造から分離します。
  3. 各グループの精巣組織10個のうち5個を均質化バッファー(0.25 Mスクロース、0.5 mM EDTA、5 mMヒスチジン、およびPBSに溶解したPI、pH 7.4)で均質化し、残りの5つの精巣組織をBouinの溶液に固定して組織学的評価を行います。
  4. ホモジネートを10,000 × g で4°Cで15分間低温遠心分離機で回転させ、生化学分析用の上清を得る。
  5. 精巣キサンチンオキシダーゼ(XO)活性は、メーカーのガイドラインに従って、標準的なラボキットを使用した酵素比色アッセイによって測定されます。
  6. 比色法による精巣マロンジアルデヒド(MDA)含有量のアッセイ21.
    1. 脂質過酸化中に生成されるチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)を用いた脂質過酸化濃度測定
      注:この方法は、2-チオバルビツール酸(TBA)と脂質過酸化の最終生成物であるマロンジアルデヒドとの反応に基づいています。酸性pHで加熱すると、ピンク色の発色原複合体([TBS]2-マロンジアルデヒド付加物)が得られ、その532 nmでの吸光度が測定されます。
      1. サンプル200 μLを500 μLのトリクロロ酢酸(TCA)で脱タンパクし、3,000 rpmで10分間遠心分離します。
      2. 上清0.1mLに0.75%TBA1mLを加え、100°Cの水浴で20分間沸騰させ、氷水で冷却します。
      3. ブランクに対して分光光度計を使用して、532 nmでのサンプル/標準の吸光度を読み取ります。標準曲線から外挿して生成されたTBARSの濃度を決定します。
  7. 以前に報告されたように、確立されたプロトコルを使用して、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)22、カタラーゼ23、およびグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)24 の精巣活性をアッセイします。
    1. SODの決定
      1. サンプル1mLを9mLの蒸留水で希釈して、10分の1の希釈液にします。この希釈サンプル0.2 mLを2.5 mLの0.05 M炭酸塩緩衝液(pH 10.2)に加え、分光光度計の平衡化を行います。
      2. 0.3 mLの新たに調製した0.3 mMアドレナリンを混合物に添加して反応を開始し、反転によってすばやく混合します。
      3. 参照キュベットに、2.5 mLのバッファー、0.3 mLの基質(アドレナリン)、および0.2 mLの水を加えます。
      4. 480 nmで150秒間、30秒ごとに吸光度の増加を監視します。
    2. カタラーゼの測定
      1. 精巣ホモジネートの上清1mLを希釈水19mLと混合して、サンプルを1:29に希釈します。
      2. 4 mLのH2O2 溶液(800μmol)と5 mLのリン酸緩衝液を10 mLの平底フラスコに入れます。
      3. 1 mLの適切に希釈した酵素調製物(ステップ4.6.3.1)を反応混合物(ステップ4.6.3.2)と37°Cで穏やかに旋回させながら混合します。反応混合物1 mLを取り出し、2 mLの重クロム酸塩/酢酸試薬に60秒間隔で加えます。
      4. 653 nm での吸光度を認定されたカタラーゼ標準試料の吸光度と比較して、サンプル中のカタラーゼレベルを測定します。
    3. GPxアッセイ
      1. サンプルを含む反応混合物を37°Cで3分間インキュベートし、0.5 mLの10%トリクロロ酢酸(TCA)を加え、3,000 rpmで5分間遠心分離します。
      2. 上清1mLに、リン酸緩衝液2mLと5'-5'-ジチオビス-(2-ジニトロ安息香酸(DTNB)溶液1mLを加え、ブランクに対して412 nmの吸光度を読み取ります。
      3. 標準曲線をプロットし、曲線から残りのGSHの濃度を外挿することにより、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を決定します。
  8. MPOおよび腫瘍壊死因子-アルファ(TNFα)アッセイ
    注:このアッセイは、過酸化水素の存在下でグアイアコールを酸化して酸化したグアイアコールに含みます。酸化した形のグアイアコールは茶色をしており、470 nmで測光測定されます。
    1. 標準的なELISAキットを使用して、精巣ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性21,25および腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)レベルを測定します。
  9. ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色26,27を用いた病理組織学的検査とカスパーゼ3発現の免疫組織化学
    1. ブアンの体液中の精巣組織を保存します。組織をトルエンで洗浄し、パラフィンワックスに浸し、60°Cで一晩インキュベートします。
    2. ~5 μm厚の切片を採取し、脱パラフィン化して再水和し、予熱したクエン酸緩衝液を使用して抗原を回収し、30分間冷却します。
    3. 実験用ワイプでスライドを洗浄し、疎水性ペンで切片領域に印を付け、スライドを加湿チャンバーに配置します。
    4. 過酸化水素を使用して内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した後、スライドを10分間インキュベートします。スライドをPBSで一度すすぎ、タンパク質ブロックを塗布し、10分間インキュベートします。
    5. スライドをPBS 2回すすぎ、対応する一次抗体(カスパーゼ3)を塗布し、スライドを45分間インキュベートし、PBSで2回すすぎます。
    6. 二次抗体を塗布し、25分間インキュベートし、PBS 2xですすぎ、HRPポリマーを加えます。インキュベーションのサイクルを25分間繰り返し、PBSで2回すすぎます。
    7. ジアミノベンジジン(DAB)基質中で切片を5分間インキュベートし、PBSで2回すすぎ、ヘマトキシリンで対比染色し、蒸留水ですすいでください。
    8. 切片に青化液を塗布し、すすぎ、脱水、透明化、および定性的検査のためにマウントします。
    9. 光学顕微鏡で組織を検査し、顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラで100倍と400倍の倍率で顕微鏡写真を撮影します。

4. 統計分析

  1. 選択したソフトウェアで統計分析を実行します。Anderson-Darling検定、D'AgostinoとPearson検定、およびShapiro-Wilk検定を実行して、正規性を検定します。
  2. 対応のない t検定を実行して、両方のグループ間の有意差を検定します:SOとT / D。
  3. データを平均±平均の標準誤差として表示します。有意水準を p < 0.05、 p < 0.01、 p < 0.001 に設定します (図の凡例で報告されています)。

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結果

XO活性、MDAレベル、精巣内のSOD、カタラーゼ、GPxの活性を酸化ストレスのマーカーとして採用した。ねじれ/ねじれ(T / D)は、偽手術ラットと比較して、T / DラットのXO活性とMDAレベルを著しく増加させ、SOD、カタラーゼ、およびGPxの精巣活性を低下させました(図1)、T / D誘発性損傷における酸化ストレスの役割を示しています。

また、炎症のメディエーターであるTNF-αと好中球浸潤の指標であるMPOを炎症のマーカーとして使用しました。T / Dは、偽手術ラットと比較して、T / Dラットの精巣組織におけるTNF-α濃度の有意な増加を引き起こしました(図2A)。精巣のT / Dはまた、偽手術動物と比較して、ミエロペルオキシダーゼの精巣活性の有意な上昇をもたらしました(図2B<...

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ディスカッション

この論文と付属のビデオでは、アンカレッジ アプローチを使用した精巣 IRI の研究のための TT の外科的導入について、段階的に詳しく説明します。この方法は、クランプ技術7によって引き起こされる精巣の長期にわたる外部化を回避すると同時に、ヒトにおけるTTの臨床症状をより厳密にモデル化するという点で特に有用である10,12。

虚血が規定の期間確立されたら、精巣へのアクセスを得るために巾着ステッチを除去し、陰嚢の固定ステッチを取り外して動員し、精巣を反時計回りに720°回転させてねじれを解き、精巣をクロミック2-0を使用して連続縫合糸で閉じた陰嚢に戻します。感染を防ぐために、プロカインペニシリン粉末を切開部位に塗布します。精巣を陰嚢に戻す前に、臍帯とそれに付随する血管を評価して、それらがねじれておらず、開存していることを確認する必要があります。クロム縫合糸...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

私たちはここに、手順の撮影と編集に協力してくれた健康科学部の視聴覚部門の責任者であるオジェニラン氏の支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 ccシリンジ該当なし該当なし麻酔用
2-0クロミック縫合糸該当なし該当なし手術用
バード・パーカーナイフハンドル該当なし該当なし手術用
湾曲モスキート動脈鉗子該当なし該当なし手術用
解剖用はさみ該当なし該当なし手術用
GraphPad Prism (バージョン8.0.2)
ケタミン注射Swiss Parenterals LTD グジャラート州インド2321154麻酔薬
パラセタモール注射陝西中宝製薬、中国220637鎮痛剤
ポビドンJAWA International limited ナイジェリア135S防腐洗浄
プロカインペニシリン粉末安徽成石製薬株式会社 中国201906手術用
外科用ブレード該当なし該当なし手術用
外科用手袋鎮江華洋ラテックス製品 中国210325
縫合はさみ該当なし該当なし手術用
歯付き解剖用鉗子該当なし該当なし手術用
キシラジン注射Bioveta チェコ共和国396228A麻酔薬
光学顕微鏡Novel Microscope, 中国該当なし組織病理学的評価用
デジタルカメラHayear, 中国該当なし組織病理学的評価用
TNF-αキットElabscience, 米国E-EL-H0109アッセイ用
Thermo Fischerキット（caspase 3発現用抗マウスカスパーゼ3モノクローナル抗体）Thermo Fischer Scientific Inc., 米国該当なし免疫組織化学（caspase 3）用

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