方法論記事

小容量チャンバーでの高分解能呼吸測定

DOI：

10.3791/67442

⸱

2025年7月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oroboros Instruments, 2Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, 3Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, 4Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 5Abliva AB

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、高分解能呼吸測定用の0.5mLチャンバーが、適切な機器によるO2バックグラウンド補正が適用された場合、2.0mLチャンバーと一致する結果を示すことを示しています。必要なサンプルが少ないため、入手可能性が限られている、または呼吸能力が低い研究に有利です。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

呼吸フラックスの調査は、代謝プロセス間の複雑な相互作用を理解する上で決定的です。サンプルの入手可能性が限られており、呼吸数が低い細胞や組織の研究では、少量の実験が恩恵を受ける可能性があります。0.5mLチャンバーが、Oroborosを使用した高分解能呼吸測定で使用されるのと同じサンプル濃度で、2.0mLチャンバーと一致する結果が得られるかどうかを調べました。バックグラウンド O2 フラックスは、空気飽和時の 2.0 mL チャンバーよりも 0.5 mL チャンバーで 4 倍高かったが、再現性があり、正確なバックグラウンド補正が可能でした。最適な撹拌速度は、0.5mLチャンバーで550回転/分(rpm)から750rpmの間でした。生細胞、透過処理細胞、および単離されたミトコンドリアの呼吸フラックスを、14〜20回の滴定で基質-アンカプラー-阻害剤滴定プロトコルを使用して、0.5mLおよび2.0mLチャンバーで並行して測定しました。異なるチャンバータイプのO2フラックスは、検出限界内で同一でした。0.5 mLチャンバーは、2.0 mLチャンバーよりも4倍近く少ないサンプルで済み、サンプル量が限られているか、呼吸能力が低い研究に大きな利点をもたらします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミトコンドリアの呼吸経路を調査することは、さまざまな病気、老化、またはストレスへの反応の根底にある代謝メカニズムに光を当てるための鍵であり、したがって治療介入の潜在的な標的を提供し、診断能力を向上させます1,2,3。高分解能呼吸測定(HRR)により、さまざまなサンプルタイプおよび調製物にわたる酸化的リン酸化(OXPHOS)におけるミトコンドリア経路およびカップリング制御の詳細な分析が可能になります4。実験室の容積は、呼吸測定器の基本的な設計上の特徴です。以前に確立されたチャンバー容量は、オロボロスでは 2.0 mL です。この容量は、装置のバックグラウンドO2フラックスを低くし、撹拌媒体の均質性を確保するように最適化されています。これらは、ミトコンドリア酸素動態と透過性筋線維に必要な低酸素および高酸素条件での呼吸を正確に測定するための重要な品質基準の1つであり、それぞれ5,6,7,8,9。さらに、いくつかのマルチセンサ挿入10は、2.0mLチャンバーのスペースを必要とする(表1)。

本研究では、HRRのチャンバー容量を2.0mLから0.5mLに減らすことの実現可能性を検討しました。より少ない細胞数または組織量を、精度を損なうことなく、より小さなチャンバーでの呼吸測定アッセイに適用できますか?この質問の明確化は、ヒト組織および液体生検、初代細胞、および成長の遅い細胞培養を調査するために重要です1。同様に、チャンバー容積の減少は、ミトコンドリア11の欠陥における呼吸活動が低いサンプルや、脳内の脂肪酸酸化など、本質的に能力が低いミトコンドリア経路の研究において潜在的に有利である12。ただし、O2 逆拡散のアーティファクトが不釣り合いに増加し、体積校正が不正確であるため、チャンバー サイズが小さいと分解能が低下する可能性があります13,14。したがって、2.0 mLで校正された古典容量チャンバー(cV)と比較して、0.5 mLの最小実験容量で校正された小容量チャンバー(sV)でOroborosの機器性能を分析しました。特に、機器のバックグラウンドO2フラックスと最適撹拌速度を分析しました。

基質アンカプラー阻害剤滴定(SUIT)プロトコルは、OXPHOS分析で呼吸数と状態を評価するために使用されます。SUITプロトコルは、呼吸測定アッセイごとに14〜20回の滴定で構成され、数pmol∙s-1∙mL-1から数百pmol∙s-1∙mL-1の範囲の呼吸O2フラックスを伴いました。カップリング制御状態には、アデノシン-5'-二リン酸(ADP)をアデノシン-5'-三リン酸(ATP)にリン酸化できず、プロトンリーク、プロトンスリップ、カチオンサイクル、および電子リークに起因するリーク率L、つまり呼吸の散逸成分が含まれます。OXPHOS容量Pは、ODPの存在下でO2消費(酸化)として測定された電子移動がATP合成(リン酸化)に結合した場合のミトコンドリアの呼吸を説明します。分離状態の電子移動容量Eは、ミトコンドリア基質15の存在下でのプロトノフォアの滴定によって定量化される。残留酸素消費量 rox は、複合体 I および複合体 III 阻害剤ロテノンおよびアンチマイシン A の添加後に測定されます。

sVおよびcVチャンバー内の細胞およびミトコンドリア製剤の呼吸を測定しました。血小板は巨核球の無核細胞質断片であり、容易に入手できるヒトミトコンドリアの供給源です。したがって、血小板は、無傷の原形質膜を持つ生細胞(または細胞粒子)のモデルとして適用されました。血球の呼吸は全身性ミトコンドリア疾患のバイオマーカーとして機能し、代謝活性器官の生体エネルギー適合性と相関します 16,17,18,19 ですが、これらの発見を一般化することはできません 20,21,22。ヒト線維芽細胞は、ミトコンドリア機能不全の細胞モデルとしての応用のために選択されました1,23,24,25。原形質膜の無傷性は細胞の生存率に必要ですが、その選択的透過性により、細胞質ゾルと周囲の培地との間の分子の交換が可能になります。したがって、化学的に透過処理された原形質膜を有する線維芽細胞は、ミトコンドリア機能を評価するために使用され、ミトコンドリア亜集団を分離するために必要な単離ミトコンドリアと比較して、透過処理された細胞の例として研究された26,27。

プロトコル

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ヒト血小板に関する研究では、8 人のボランティアが研究に参加するための書面によるインフォームド コンセントを提供し、スウェーデン倫理審査局によって承認されました (Nr. 2013/181)。男性新生児からの2つのヒト皮膚線維芽細胞株がATCCから購入され、チェコ共和国保健省の倫理的承認に従って使用されました(プロジェクト:AZV MZ CR NU22-07-00474)。マウスを含む手順は、オーストリア動物実験法に従って、実験目的およびその他の科学目的で使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約に準拠して実施されました(Tierversuchsgesetz 2012;指令2010/63 / EU;BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016)。実験動物の数を最小限に抑えるために3Rの原則を適用しました。

1. 体積校正

  1. 小容量チャンバー(s V)またはクラシック容量チャンバー(cV)をオロボロスに取り付けます(図1A、B;表1)。
  2. Oroborosの電源を入れ、 DatLabに接続します。
  3. チャンバーを乾燥させます。
  4. 0.54 mLのH2OをsV(0.50 mLの有効実験量と0.04 mLの毛細管死体積)または2.07 mLのH2OをcV(2.00 mLの有効容量と0.07 mLの毛細管死体積)にピペットで移動します。
    注意: ガラスシリンダーの上部とポリオキシメチレン(POM)チャンバーホルダーの間の液体の損失を避けるために、ピペットチップをガラスチャンバーの壁に触れるほど深く挿入します。
  5. スターラーのスイッチを入れます。
  6. チャンバーを閉じる前に、毛細管管を乾いた状態に保ちながら、ストッパーのOリングを湿らせます。容量校正リングを緩め、液体がストッパーキャピラリーを満たし、キャピラリーの上端にあるレセプタクルに小さな液滴が現れるまで、ストッパーを下向きに挿入します(表1)。
  7. 容量校正リングを締めて位置を固定し、ストッパーを連続して挿入すると校正された容量が得られるようにします。

2. オロボロス一般設定

  1. DatLabソフトウェアを起動します。
  2. 実験温度(37°C)と撹拌回転速度を、チャンバーsVで550 rpm(9.2 Hzまたは回転数/秒)またはチャンバーcVで750 rpm(12.5 Hz)に設定します。データサンプリング間隔を2秒に設定し、機器O2バックグラウンドテストでは80秒(40データポイント)以上、呼吸測定では40秒(20データポイント)で平滑化します。
    注:マグネチックスターラーバー(ポリ二フッ化ビニリデン[PVDF]でコーティングされたAlNiCo; 表1)チャンバー内のスターラーのレベルで3.5mTの電界強度を持つパルス回転磁場によって撹拌されます。
  3. MiR05または後続の実験で使用したのと同じインキュベーション培地で空気校正28 を実行します。
  4. ゼロ酸素校正は時々実行しますが、実験を開始する直前には実行しないでください。
    1. O2-ゼロ粉末を 50 mM リン酸緩衝液 (pH 8.0) に溶解して、sV または cV チャンバーでそれぞれ 2.5 mM または 10 mM の濃度に溶解することにより、新鮮な Na-ジチオナイト原液を調製します。
    2. Na-ジチオナイトを過剰に滴定して、O2濃度0μM14,28で生の信号R0またはゼロ電流[μA]を取得します。

3. 機器によるO2 バックグラウンドテスト

  1. チャンバーs V
    1. 空気校正後、チャンバーを閉じます。O2濃度が空気飽和から約150 μMに低下するまで、酸素信号を約60分間監視します。プロット「O2 スロープ負」に J°1 から J°4 までの 4 つのマークを設定します。
      注:実験を開始する前に、この機器によるO2バックグラウンドテストを毎日実行してください。
    2. オプション:ハミルトンシリンジを使用して、ステップ2.4.1に従って調製したNa-ジチオナイトを滴定して、100μMのO2濃度に達します(図1C)。
      注:別のプロトコルでは、Na-ジチオナイトを滴定注入マイクロポンプ(TIP2k; 補足図1 および 補足図2)を測定するための標準的な方法との比較のために、機器のバックグラウンドO2フラックス28。
  2. チャンバー cV
    1. 空気校正後、チャンバーを閉じ、O2勾配が安定するのを待って、プロット「O2勾配負」28にJ°1マークを設定します。ハミルトンシリンジを使用して、ステップ2.4.1に従って調製したNa-ジチオナイトを滴定します。チャンバーの酸素レジームに一致させるために0.7 μLのステップで、O2濃度を150 μMに下げます。
    2. 別のNa-ジチオナイト滴定ステップ(約7 μL)を追加して、O2濃度を100 μMに下げます(図1D)。
  3. 機器によるO2バックグラウンドデータ解析
    1. DatLab28 で機器の O2 背景勾配を計算します。トップメニューから[流束/勾配]を選択します。
    2. O2 背景補正ウィンドウを開きます。O2 背景のソースとして [アクティブ ファイル] を選択し、線形回帰の計算に使用する J° マークを選択します。O2 背景補正を適用します。

figure-protocol-1
図1:小容量(sV)および古典容量(cV)チャンバーと機器によるO2バックグラウンドテスト。 (A) Chamber sV.(B) チャンバー cV.(C)スロープネガティブおよびJ°1マークの代表的な痕跡、sV(0.5 mL、緑)およびc、V(2.0 mL、青)。(D)対応する酸素濃度とR1マーク。3回の手動Na-ジチオナイト滴定(約0.7 μL、10 mMストック、cV)およびsVチャンバーでの2.5 mMおよび10 mMストックの最終7.0 μL滴定。滴定によるスパイクが解消されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. オロボロスチャンバーへのサンプルの追加

注:サンプルは、部分的な体積置換(本研究では血小板および線維芽細胞)または完全な体積置換(本研究では単離されたミトコンドリア)の2つの方法でチャンバーに追加できます。

  1. 部分的なボリュームの置換
    1. 完全に挿入されたストッパーを取り外します。MiR05からボリュームVをピペットで取り除きます。Voutは、血小板の場合は60〜70 μL、線維芽細胞の場合は80〜150 μLで、ストック細胞懸濁液中の細胞濃度に従って計算されます。
    2. Voutと同等で、同じ容量のVJ.iのストック細胞懸濁液(既知の細胞濃度)をチャンバーにピペットで入れます(図2)。
    3. 実用体積 V( 0.54 mLおよび2.07 mL)で実験細胞濃度を、実効実験体積 V (0.5 mLおよび2.0 mL)よりも大きく計算します。
      注:ストック細胞懸濁液の濃度と実験細胞濃度は、小さな滴定誤差と互換性のあるVJ.i = Voutの容量を得るように計画する必要があります。血小板を用いた実験では、キャピラリーデッドボリュームが0.05 mLのチャンバーsVにプロトタイプのストッパーが使用されました。
  2. ボリュームの完全な交換
    1. チャンバーから培地全体を吸い上げ、sV またはcVチャンバー内の実験サンプル濃度でそれぞれ少なくとも0.54 mLまたは2.07 mLの単離ミトコンドリアストック溶液と交換します。
    2. チャンバーを閉じ、ストッパーレセプタクルから余分なミトコンドリア原液を吸い取ります。
      注:完全な容量置換では、ハミルトンシリンジでストッパーキャピラリーを介して密閉チャンバーに滴定することによって発生する可能性のあるミトコンドリア濃度の変動が排除されます。後者の方法は、濃縮ストック懸濁液で調製された小径のサンプル(例えば、単離されたミトコンドリア)に適用できます。ただし、ハミルトンシリンジの長さ51 mmの針(内径0.41 mm)に加えられるせん断力によって、壊れやすい細胞を原形質膜の潜在的な損傷にさらします。これは、ストッパーを取り外し、部分的または完全な容量交換によってサンプルをチャンバーにピペッティングすることで回避できます。3種類のミトコンドリア製剤が研究されました。サンプル調製は、 補足ファイル11、26、29、30に記載されています。
  3. 生細胞:ヒト血小板
    1. 血小板を含むクライオバイアルを37°Cのウォーターバスに挿入し、氷がほとんど残らないまで内容物を解凍します。
    2. クライオバイアルを開き、1 mLの予熱培地(DPBS + 10 mM EGTA、37°C)を滴下してゆっくりと加えます。
    3. 血小板を穏やかに混合し、総量10 mLの予熱培地(DPBS + 10 mM EGTA、37°C)の50 mL遠心分離管に移します。スイングアウトローター(加速度6、ブレーキ2)を使用して、室温(RT)で1000 g で10分間遠心分離します。
    4. 血小板を0.25 mLのDPBS + 10 mM EGTA(RT)に再懸濁し、157・106 から 210 ·106 x・mL-1を0.5mLチャンバーで、164・106 から 220 ·106 x・mL-1を2.0mLチャンバーに入れます(基本ユニットxの詳細については31を参照)。
      注:1台のオロボロスは、それぞれ位置AとBにsV とcV チャンバーを装備し、それぞれ位置BとAにsV とcVチャン バーを装備した別のオロボロと並行して使用されました。
  4. 透過処理細胞:ヒト線維芽細胞
    1. 公称細胞濃度0.75・106 x・mL-1を両方のチャンバータイプで計算し、実際の濃度を計算します(ステップ4.1.3)。
      注:異なるオロボロス機器を並行して使用し、それぞれにsV またはcV チャンバーのいずれかが装備されていました。
  5. 単離ミトコンドリア:マウス心臓
    1. 15 μLのミトコンドリア懸濁液を5985 μLのミトコンドリア呼吸培地(MiR05)に加えると、0.013〜0.026 mg∙mL-1の範囲のストックミトコンドリアタンパク質濃度が得られます。
    2. ミトコンドリア懸濁液を完全な容量交換によってオロボロスチャンバーに追加します。
      注:1台のオロボロは、それぞれ位置AとBにsV およびcV チャンバーを装備し、それぞれ位置BとAにsV およびcV チャンバーを装備した別のオロボロと並行して使用されました。

figure-protocol-2
図2:部分的な体積置換による細胞懸濁液の添加。 (a)0.5 mLチャンバーsvおよび(b)2.0 mLチャンバーcvへの添加。(1) 機器のバックグラウンド O2 フラックス JO2° を測定するための、呼吸媒体 V と充填されたストッパー キャピラリー Vstc の体積を備えた密閉チャンバー。(2) ストッパーを取り外し、Vstc をチャンバーに排出し、総体積 V'= V+Vstc になります。(3) 媒体の部分除去 Vout = -V J.i.ボリューム V''= V'+V出力がチャンバー内に残ります。(4)呼吸器ストックセル懸濁液の体積V J.iを含むサブサンプルをチャンバーにピペッティングし、希釈細胞懸濁液の総体積V# = V + V stcをもたらします。(5) 実験体積 V 中の体積比 O2 磁束 JV、O2 を測定するための、充填されたストッパー キャピラリー (デッド ボリューム Vstc) を備えた密閉チャンバー。この図は、HRR41のセル数と正規化の図2Aから変更されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. SUITプロトコル

  1. 補足表1にリストされている化学物質のストック溶液をハミルトンマイクロシリンジでチャンバーに滴定し、滴定量を調整して、sVチャンバーとcVチャンバーで同じ実験濃度を得る(図6、8、10の図の凡例を参照)。
  2. プロトコル SUIT-003_D018 32,33 を選択します (本研究の血小板の場合)。
  3. プロトコル SUIT-001_D004 4,15,34,35 および SUIT-002_D007 4,15,35,36 を選択します (本研究の線維芽細胞の場合)。
  4. プロトコル SUIT-002_D005 4,15,35,37 を選択します (本研究の単離ミトコンドリア用)。

6. SUITデータ分析

  1. DatLabで、選択したプロットのセクションを定義するための マーク を設定します。
  2. トップメニューの[ 流束/勾配 ]を選択します。 [流束/勾配 ]ウィンドウを開きます。SUITプロトコルの各滴定による懸濁サンプルの希釈のための 滴定量補正 を適用します。
  3. トップメニューから [マーク] を選択します。マーク 統計を 開いて、残酸素消費量(rox)を差し引いてベースラインで補正されたマークされたデータポイントの中央値を表示します。
  4. スプレッドシートを使用して、逆回帰分析25,28により、sVチャンバーとcVチャンバーで得られたペアの結果間の切片と傾きを計算します。
  5. ソフトウェア jamovi 2.3.1338 を使用して、s、V および cV チャンバー内の rox 状態 (最小 O2 フラックス) の呼吸数を、対応のあるスチューデントの t 検定によって比較します。
    注:Oroboros装置の2つのチャンバーは機能的に独立しているため(温度とDatLabの記録間隔を除く)、異なる装置を使用するのと同様に、各チャンバーでの測定を個別に検討できます。最終結果は、変動性に関する情報とともに、複数のチャンバーの中央値または平均値として報告される場合があります。

結果

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酸素センサー(POS)の生信号R1 [μA]は、で確認されているように、「開いた」チャンバー内の空気の気相と平衡状態にある水相の体積とは無関係であると予想されます。 補足表 2.しかし、密閉された部屋では、楽器の背景O2空気飽和に近いフラックス J°1[PMOL・秒-1∙ミリル-1]は音量によって異なります V (補足表 2).The O2センサーの消費量[PMOL・S-1]は、ゼロ補正された生信号R1-R0 [μA]として測定された電子流から予測でき、電荷数は4 e-/O2そしてファラデー定数 F = 96 485.33 C∙mol-1.1 μA は電子流 (e-)10.36 pmol∙s-1.電荷数で割ると、O2流れる15,39 2.591 pmol∙s の-1・μA-1. R1-R0の記録された中央値は、0.5mLおよび2.0mLチャンバーでそれぞれ2.09μAおよび1.98μAでした(補足表 2;R0 = 0.006 ± 0.007 μA(秒単位)V R0 = 0.004 ± 0.003 μA (cV チャンバー)、理論的にはOに相当します。25.41 pmol∙sの消費率-1および5.13 pmol∙s-1.The O2センサーの流量は、空気飽和(J°R1)を5.41pmol・s-1/0.5 mL = 10.82 pmol∙s-1∙ミリル-1および5.13 pmol∙s-1/2.0 mL = 2.56 pmol∙s-1∙ミリル-1秒でV および cV それぞれ。2.0 mL チャンバーと 0.5 mL チャンバーに同じタイプのポーラログラフ酸素センサーを使用すると、体積比バックグラウンド O2フラックス - 現在のR1-R0(J°R1) - 理論的にはチャンバー容積に反比例して 4 倍に増加します。 J°空気 (空気飽和時、後方拡散がゼロの場合、比較 テーブル 2 そして 補足表 3)は、O2実験バックグラウンドテストの線形回帰からの空気飽和度濃度 (図 3). J°空気 理論的に期待される値に近づいた J°R1 両方のチャンバー(テーブル 2).ザ J°空気 / J°R1比率は0.85±0.04、0.92±0.12でしたV および cV チャンバーは、それぞれ、2.0 mL チャンバーでの 52 回の独立した一連の測定と一致しており、この比率は 0.95 ± 0.12 でした (補足表 4). J°空気 は、0.5 mL チャンバーでは 2.0 mL チャンバーよりも 3.9 倍高かった。ネットO2バックディフュージョン J°50、50 μM O で計算2実験的バックグラウンドテストの線形回帰から、0.5mLチャンバー(テーブル 2).機器の背景Oの変動性2フラックスは2つの異なるチャンバー容積でほぼ同じで、標準偏差(SD)は0.5と0.3 pmol∙sでした-1∙ミリル-1対して J°空気 0.9 および 0.8 pmol∙s-1∙ミリル-1 対して J°50秒でV および cV チャンバー、それぞれ(テーブル 2).より高い楽器の背景にもかかわらず、O20.5mLチャンバー内の傾斜、バックグラウンドOの依存性2フラックスオン cO2両方のチャンバータイプ(図3D).これにより、残差の値が低くなります <±1 pmol∙s-1∙ミリル-1両方のチャンバー(補足表 5)、オロボロスの検出限界に合わせて28.

チャンバーを「オープン」構成で、350 rpm (5.8 Hz) から 950 rpm (15.8 Hz) の間で POS の校正生信号 R1 に対する撹拌速度の影響を 100 rpm (1.7 Hz) のステップで定量化しました。この構成では、媒体に溶解したO2は気相と平衡状態にあります。したがって、撹拌速度の関数としての生信号(マイクロアンペア[μA])の変化は、cO2の真の差を反映していません。酸素センサーは、チャンバー容積とは無関係に、デフォルト速度の750 rpmでR1からのわずかな偏差で撹拌速度の変化に反応しました(図4)。「オープン」構成では、信号の安定化後の各ステップのSDとして定義されるO2スロープのノイズは、両方のチャンバータイプで850 rpmで最も低く、撹拌速度がいずれかの方向にこの値から逸脱すると増加しました(図5A)。550 rpm未満では、O2スロープの騒音は±4 pmol∙s-1∙mL-1のしきい値を超え、最小の実際の撹拌速度を定義しました。技術的な制限により、上限には達せず、最大実際の撹拌速度は 950 rpm でした (図 5A)。この範囲内で、R1からのO2シグナルの偏差は<2.5%でした。チャンバーを閉じても、騒音と撹拌速度の関係は変化しませんでした(図5B)。指数時定数τは、0.5mLチャンバーで550rpmで2.53±0.05秒、750rpmで2.50±0.05秒でした(補足図3)。

血小板に適用される SUIT-003_D018 プロトコルには、最大 14 の滴定ステップが含まれます。これは、細胞生存率の指標として、生細胞、ce、および原形質膜透過性の結合制御を研究するように設計されています32。2種類のチャンバーで測定された酸素流量(図6)は、すべての呼吸状態で密接に一致しました(図7)。機能的低酸素症を回避したり、実験的な O2 濃度を定義された範囲に制限したりするには、断続的な再酸素化が必要です。再酸素化は、腐敗の滴定後にチャンバーを「開いた」位置に開くことによって実行されました。チャンバーを閉じると、O2フラックスは2.0mLチャンバーで4分以内に安定しましたが、安定化して新しいマークを設定するまでに0.5mLチャンバーで約10分が必要でした(図6および補足図4)。O2フラックスが低いときのロックス状態での再酸素化は、安定化に必要な時間中のO2濃度の低下を回避します。ロテノン阻害roxは、sVおよびcVチャンバー内の98±17および94±17μM O2(平均±SD)でそれぞれ0.9±0.6および2.0±0.6 pmol∙s-1∙mL-1でした。 Roxは、再酸素化時に0.9±0.9および0.9±0.4 pmol∙s-1∙mL-13.1増加し、sVチャンバーおよびcVチャンバーでそれぞれ159 ± 8および147 ±11 μM O2に増加しました。血小板で観察されたロックスの酸素依存性は、ヒト線維芽細胞および臍帯静脈内皮細胞の結果と一致します40。

透過処理線維芽細胞におけるOXPHOS分析には、最大17および20の滴定ステップを持つ2つのSUITプロトコルを使用しました(SUIT-001およびSUIT-002、それぞれ35;図8);したがって、SUIT-002の終了時に、希釈はsVチャンバーとcVチャンバーでそれぞれ最大14%と10.5%に達したため、滴定量補正は特に重要です。0.5 mL チャンバーと 2.0 mL チャンバーでそれぞれ 0.35・106 x および 1.44・106 x の線維芽細胞数は、0.75・106 x∙mL-1 の同じ細胞濃度をもたらしました。SUIT-001 と SUIT-002 の組み合わせは 20 の呼吸状態に対応し、そのすべてが 2 チャンバー タイプで密接に相関していました (SUIT-001 では r2= 0.950、SUIT-002 では r2= 0.959)。どちらのプロトコルでも、複合体IVは比較的高い散乱を持っていました(図9)。SUIT-001では、ルーチン状態(平均±SD)で18.7 ± 7.0 pmol∙s-1・mL-1の低体積比O2フラックスから開始し、プロトコルのCIVリンクセクションまでO2濃度を56 μMまで低下させることができました(図8A;8Ama)。ただし、SUIT-002では、アンカプラー滴定の前に再酸素化が行われ、O2濃度が100 μMから180 μMに増加しました(図8B、6Gp)。再酸素化後のフラックスの安定化に長い時間が必要であることを考えると、アンカプラ滴定中の再酸素化は避けるべきです。

短縮されたSUITプロトコルを単離されたミトコンドリアに適用しました(図10)。ミトコンドリアタンパク質濃度は呼吸測定アッセイ後に測定されたため、チャンバー内の正確なサンプル濃度を事前に定義することは不可能でした。体積比呼吸フラックスは、ミトコンドリア濃度の関数として変化します。したがって、データは体積特異的およびタンパク質質量特異的フラックスとして提示されました(図11)。どちらの表現も、0.5 mL チャンバーと 2.0 mL チャンバーで得られた測定値の間に密接な相関関係があることを示しています(図 11)。

アンチマイシン A による複合体 III の阻害後に測定された残留酸素消費量 rox は、非常に低い呼吸数での機器性能の指標として使用できます。すべての実験シリーズにおいて、roxは0.5mLチャンバーと2.0mLチャンバーの間で同等でした(血小板:t(5)= -0.34、p = 0.74;線維芽細胞:SUIT-001:t(10)= 20.00、p = 0.06;SUIT-002: t(10) = 11.00、p = 0.96;単離されたミトコンドリア:t(4)= -1.18、p = 0.27)。データの散乱は、図12に示すように、±1 pmol∙s-1∙mL-1 13,28の機器の不確かさに大きく対応しています。元のファイルは、Zenodoリポジトリ(10.5281/zenodo.11634408)でオープンアクセスできます。 

figure-results-1
図3:sV(0.5 mL、緑と黒)およびcVチャンバー(2.0 mL、青)の機器バックグラウンドO2フラックス。 O2濃度の範囲は、空気飽和度(約180 μM)から約50 μMまでです。オープンシンボル:Na-ジチオン酸塩なしで得られたO2濃度。固体記号:Na-ジチオン酸塩の手動滴定によって制御されるO2濃度。黒い円:0.5 mLチャンバー内のTIP2kを使用したNa-ジチオナイトの滴定によって制御されたO2濃度(N = 8)。機器バックグラウンドテストの結果は、生細胞を使用する前の(A)シリーズ1(sV:N = 2;cV:N = 2)からプールされました。(B)透過処理細胞(pce)を使用する前のシリーズ2(sV:N = 38; cV:N = 50)。(C)単離ミトコンドリア(imt)を使用する前のシリーズ3(sV:N = 10; cV:N = 10)。(D)パネルA-Cからの重ね合わせデータ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図4:0.5 mLチャンバー(緑)および2.0 mLチャンバー(青)の空気飽和(「オープン」チャンバー)でのPOS信号に対する撹拌回転速度の影響。 750 rpmでのR0補正空気校正信号R1-R0 [μA]に対する応答[%](sV: N = 4; cV: N = 4)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図5:撹拌回転速度の関数としてのO2傾斜のノイズ。 (A)「オープン」チャンバーの標準偏差として表されるノイズ。(B)密閉チャンバー(0.5 mL、緑、2.0 mL、青)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図6:0.5mLチャンバー内の凍結保存されたヒト血小板のO2消費量。 O2 フラックス [pmol∙s-1∙mL-1] を細胞濃度 157∙106 x∙mL-1 で割ったものとして計算された、O 2 濃度 [μM] (青い線) および細胞あたりの O2 流量 [amol∙s-1∙x-1] の代表的な痕跡 [amol∙s-1∙x-1] は、O2 フラックス [pmol∙s-1∙mL-1] を細胞濃度 157∙10 で割った値で計算されます (赤い線、機器のバックグラウンド O2 フラックスで補正、滴定によるスパイクは除去されました)。O2 濃度は、断続的な再酸素化(空気、「オープン」チャンバー、青い色合い)によって50μM以上に維持されました。呼吸状態のシーケンス(滴定と速度、プロトコルSUIT-003_D018):ce1、生細胞の日常的な呼吸R。ce1P、外部基質としてのピルビン酸5 mM。ce2Omy10 (パネル A)、5 nM ステップでの Omy 滴定。漏れ呼吸 L.ce3U0.3(パネルA)およびce3U0.1(パネルB)、それぞれ0.3および0.1μMの最適なCCCP濃度へのアンカップラー滴定。ET容量E。ce3Glc、グルコース 11 mM;Eはアンカプラーによって徐々に阻害されます。ce4腐敗、ロテノン 0.5 μM 阻害 CI;残留酸素消費量ROX。ce5S、コハク酸 10 mM;原形質膜透過性細胞のEを刺激する。1Dig15(パネルA)および1Dig10(パネルB)、5 μg・mL-1ステップでジギトニン滴定をそれぞれ15 μg・mL-1の最適濃度にし、原形質膜を完全に透過処理します。コハク酸経路ET容量SE。1c、シトクロムc 10 μM;ミトコンドリア外膜完全性の試験2Ama、抗マイシン A 2.5 μM 阻害 CIII;ロックス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図7:0.5mLおよび2.0mLチャンバーで測定された凍結保存されたヒト血小板の呼吸の相関関係。 Rox補正されたO2流量は、プロトコルSUIT-003_D018で評価されました(図6)。N = 6です。(A)オリゴマイシンOmyと。(B) オミーなし。すべてのデータから計算された逆最小二乗回帰と決定係数 r2 の平均傾斜figure-results-6と切片のfigure-results-7。黒い破線はアイデンティティの線を表します。赤い線は、計算された回帰線を表します。グルコース添加後の状態でのO2の流れは除外されました(図6を参照)。オリゴマイシンを含むプロトコルと使用しないプロトコルは、データポイントの重複を避けるためにパネルAとBで分離されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-8
図8:0.5mLチャンバー内の線維芽細胞のO2消費量。 C O2 (青い線 [μM]) および O2 フローの代表的なトレース (青い線 [μM]) と O2 フラックス [pmol∙s-1∙mL-1] を細胞濃度 (0.75·106 x∙mL-1) で割ったものとして計算され、機器のバックグラウンド O2 フラックスで補正されました (赤い線、滴定によるスパイクは排除されました)。O2濃度は、断続的な再酸素化(空気、「オープン」チャンバー、青い色合い)によって50μM以上に維持されました。呼吸状態の順序(滴定と速度)。(A) プロトコル SUIT-001_D004: ce1、日常呼吸 R。+Dig、ジギトニン10μg・mL-1(ce〜pce)、残留内因性呼吸レン。午後 1 時、ピルビン酸 5 mM およびリンゴ酸 2 mM;N経路漏れ呼吸NL.2D、ADP 2.5 mM;N経路OXPHOS容量NP。2c、シトクロムc 10μM;ミトコンドリア外膜完全性の試験3U1.5、最適なCCCP濃度1.5μMへのアンカップラー滴定;NADHにリンクされたET容量NE。4G、グルタミン酸10 mM;N(PGM)Eです。5S、コハク酸10 mM;NS経路ET容量NSE。6腐敗、ロテノン0.5μM;コハク酸経路ET容量SE。7Gp、グリセロリン酸10 mM;SGpE。8Ama、アンチマイシンA 2.5μM;ロックス。9AsTm、アスコルビン酸 2 mM および TMPD 0.5 mM;CIV刺激用の基質;酸素を枯渇させることなく酸化還元平衡を可能にするために、チャンバーを20分間開いたままにした4。チャンバーを閉じた後のO2フラックスオフスケール(205 amol・s-1・x-1)。10Azd、アジ化物100 mM;酸素依存性化学的背景フラックスCHB(B) プロトコル SUIT-002_D007: ce1、R。+掘る、レン。+D、刺激レン。+M.1、リンゴ酸 0.1 mM および 1Oct、オクタノイルカルニチン 0.5 mM;F経路OXPHOS容量FP = J(1Oct)-J(+M.1)。2M2、リンゴ酸2 mMはアナプレロティックN経路をサポートします。F(N)Pです。3Pおよび4G、FNPへの漸進的活性化。5S、FNSP。6Gp、FNSGpP。7U1.5、FNSGpE。8腐敗、SGpE。9アマ、ロックス。10AsTm O2フラックスオフスケール207 amol・s-1・x-1。11アズド、chb。一般に、複合体IV活性は、密接に一致したO2濃度での速度、J(AsTm)-J(Azd)の差です。詳細については、図 6 を参照してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-9
図9:0.5mLおよび2.0mLチャンバー内の透過処理線維芽細胞の呼吸の相関。(A)SUIT-001_D004および(B)SUIT-002_D007(N = 6)におけるRox補正されたO2フロー。すべてのデータから計算された逆最小二乗回帰と決定係数r2の平均傾きfigure-results-10と切片figure-results-11。黒い破線はアイデンティティの線を表します。赤い線は、計算された回帰線を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-12
図10:0.5mL(緑)および2.0mL(青)チャンバーにおける単離マウス心臓ミトコンドリアのO2消費量。(A)ミトコンドリアタンパク質濃度0.023 mg∙mL-1での質量特異的O2フラックス(機器のバックグラウンドO2フラックスで補正され、滴定によるスパイクは排除されました)および(B)O2濃度[μM]の代表的な痕跡。プロトコル SUIT-002_D005 に従った呼吸状態のシーケンス (滴定と速度): imt、残存内因性呼吸 ren。+D、ADP 2.5 mM;刺激的なレン。 +M.1、リンゴ酸 0.1 mM および 1Oct、オクタノイルカルニチン 0.5 mM;F経路OXPHOS容量FP = J(1Oct)-J(+M.1)。1c、シトクロムc 10μM;ミトコンドリア外膜完全性の試験2M2、高リンゴ酸 2 mM アナプレロティック N 経路をサポートします。F(N)Pです。 3P、ピルビン酸5 mM;FNP.4G、グルタミン酸10 mM;FNP.5S、コハク酸10 mM;FNSP.6Gp、グリセロリン酸10 mM;FNSGpP。7U0.5、最適なCCCP濃度0.5μMへのアンカップラー滴定;FNSGpE.8腐敗、ロテノン0.5μM阻害CI;SGpE。9Ama、抗マイシンA 2.5μM阻害CIII;残留酸素消費量ROX。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-13
図11:0.5mLおよび2.0mLチャンバーで測定された単離マウス心臓ミトコンドリアの呼吸の相関関係。 図10に示すプロトコルのO2フラックス(N = 4)。(A)体積比O2フラックス。(B)Rox補正されたO2フラックスをミトコンドリアタンパク質濃度(0.013〜0.026 mg・mL-1)で割ったもの。すべてのデータから計算された逆最小二乗回帰と決定係数r2の平均傾きfigure-results-14と切片figure-results-15。黒い破線はアイデンティティの線を表します。赤い線は、計算された回帰線を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-16
図12:0.5mLおよび2.0mLチャンバー内の残留酸素消費 量rox 。 抗マイシンAの添加後に測定された体積あたりのフラックスは、生細胞(ce、正方形)、透過処理細胞(pce、円)、および単離されたミトコンドリア(imt、三角形)での実験から組み合わせたものです。平均傾き figure-results-17 と逆最小二乗回帰の切片 figure-results-18破線:アイデンティティの線。赤い線:計算された回帰線。シャドウ:楽器の解像度範囲。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

モジュールsVcV
実験室容積 V0.5ミリリットル2.0ミリリットル
ガラスシリンダーの内径12.0ミリメートル16.0ミリメートル
ガラスシリンダーの外径24.0ミリメートル24.0ミリメートル
ガラス壁の厚さ6.0ミリメートル4.0ミリメートル
PVDFコーティングされたスターラーバー11.5 x 6.2ミリメートル15.0 x 6.0 ミリメートル
ストッパーキャピラリー径1.00ミリメートル1.30ミリメートル
ストッパー毛細管断面積0.79ミリメートル21.33ミリメートル2
ストッパーキャピラリー長50.64ミリメートル48.86ミリメートル
ストッパーキャピラリー容積39.8 μL64.9 μL
ストッパーキャピラリーデッドボリュームVstc(小さなドロップを含む)0.04ミリリットル0.07ミリリットル
ボリュームキャリブレーション用のボリューム V'0.54ミリリットル2.07ミリリットル

ある液滴は、チャンバー cV では 5 μL、チャンバー sV では 0 μL に近い必要があります。
表1:ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)ストッパーを備えた小容量(sV)およびクラシックボリューム(cV)モジュールの寸法。

J°air / [pmol∙s-1∙mL-1]J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
実験室容積 V0.5ミリリットル2.0ミリリットル0.5ミリリットル2.0ミリリットル
意味する9.222.37-3.17-1.17
中央値9.252.36-3.08-1.04
標準偏差0.490.340.930.83
最低限8.201.79-5.11-3.72
最大10.413.42-0.820.67

表2:空気飽和度に外挿されたJ°airと50μMO2濃度で計算されたJ°50。シリーズ 2 (pce) および 3 (imt) および TIP2k 滴定前の機器バックグラウンド テストのプールされたデータ (0.5 mL: N = 48;ヒント2k:N = 8;2.0 mL:N = 60)。

補足ファイル1:サンプル調製。 マウス心臓から単離したヒト血小板,ヒト線維芽細胞およびミトコンドリア このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:TIP2kを使用した機器O2 バックグラウンドテスト。 TIP2kを使用して0.5mLチャンバー内でNa-ジチオナイト(2.5 mM)を滴定するために実施したテストの代表的な痕跡。培地:MiR05、温度:37°C、撹拌速度:750rpm。滴定によるスパイクが解消されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:O2濃度の関数としての機器のバックグラウンドO2フラックスJ°1。シリーズ 2(pce、円)および 3(imt、三角形)のチャンバー sV(0.5 mL、緑、N = 48)およびチャンバー cV(2.0 mL、青、N = 60)、および 0.5 mL チャンバー(黒い円、N = 8)での TIP2k 滴定前。赤い線:中央値±SD。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:撹拌回転速度の関数としての指数時定数 τ 。 37°Cでの0.5mLチャンバーの個々の τ 値(N = 2)。0.5mLチャンバーでは、 τ は550 rpmで2.53±0.05秒、750 rpmで2.50±0.05秒、850 rpmで2.47±0.04秒でした。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:2.0mLチャンバー内の凍結保存されたヒト血小板のO2 消費量。 オリゴマイシン滴定(Omy)を含むプロトコルSUIT-003_D018の代表的な痕跡。フラックス[pmol∙s-1∙mL-1]を機器のバックグラウンドO2 フラックスで補正し、細胞濃度(164∙10、6x ∙mL-1)で除算しました。滴定によるスパイクが解消されました。 cO2 は、断続的な再酸素化(空気、「オープン」チャンバー、青い色合い)によって60μM以上に保たれました。呼吸状態のシーケンス(滴定と速度): ce1、生細胞の日常呼吸 R 。 ce1P、外部基質としてのピルビン酸。 ce2Omy10、5 nMステップでのOmy滴定;漏れ呼吸 L. ce3U2.0、2 μMの最適濃度へのアンカップラー滴定;ET容量 E。 ce3Glc、グルコース11 mM; E はアンカプラーによって徐々に阻害されます。 ce4Rot、ロテノン0.5μM阻害CI;残留酸素消費量 ROX。 ce5S、コハク酸10 mM;原形質膜透過性細胞の E を刺激する。 1Dig20、完全な原形質膜透過処理のための20μg・mL-1の最適濃度へのジギトニン滴定。コハク酸経路ET容量 SE。 1c、シトクロム c 10μM;ミトコンドリア外膜完全性の試験 2Ama、抗マイシンA 2.5μM阻害CIII; ロックス。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表1:基質阻害剤アンカプラ滴定(SUIT)プロトコルで使用される化学物質。 sVおよびcVチャンバーの略語と原液濃度。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 2:0.5 mL チャンバーと 2.0 mL チャンバーにおける R1-R0 と J°1 の比較。シリーズ 2 (pce) および 3 (imt) および TIP2k 滴定前の機器バックグラウンド テストのプールされたデータ (0.5 mL: N = 48;ヒント2k:N = 8;2.0 mL:N = 60)。データは、海面で得られたシリーズ1(ce)のデータを除き、平均気圧94.9 kPa(インスブルック、オーストリア)で実施された実験シリーズ2(pce)および3(imt)のみから平均化されました。0.5 mL チャンバーと 2.0 mL チャンバーでは、同じタイプで異なる個別 POS が使用されました。したがって、sVチャンバーとcVチャンバーを比較する際には、センサー間のばらつきを考慮する必要があります。2.0 mLチャンバーで実験的に得られたJ°1 = 2.26 ± 0.41 pmol∙s-1∙mL-1は計算値にほぼ対応していましたが、0.5 mLチャンバーで実験的J°1 = 8.48 ± 0.53 pmol∙s-1∙mL-1は予想よりも低かった。これは、次の観察によって説明されました。チャンバーを閉じた後、0.5 mLチャンバー内のバックグラウンドO2フラックスが高いほど、同等の時間間隔で設定されたJ°1のマークでO2濃度が低下します(図1)。J°1での酸素濃度は、0.5mLおよび2.0mLチャンバー内の空気飽和度をそれぞれ平均4.06%および1.72%下回った(補足図2、補足表2)。低いcO2では、センサーによるO2消費量の減少とO2の逆拡散により、実験的に決定されたJ°1が減少します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表3:キャリブレーション(R1)と J°1 が得られた酸素濃度[μM]とその差%。 シリーズ 2 (pce) および 3 (imt) および TIP2k 滴定前の機器バックグラウンド テストのプールされたデータ (0.5 mL: N = 48;ヒント2k: N = 8;2.0 mL: N = 60)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表4:2.0mLチャンバーで測定および予想されるJ°1。O2kシリーズA(チタンストッパー13付き)、V = 2.0 mL(37°C、O2溶解度係数0.92のNaCl溶液;N = 52)です。nO2/Qe = 106/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙μC-1 = 2.591 pmol∙s-1∙μA-1。O2 の後方拡散は cO2,1 で無視できるという仮定に基づいており、これは cO2,1 ~ cO2* でのみ当てはまります。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表5:機器O2バックグラウンドテストごとに計算された線形回帰残差(絶対値[pmol O2∙s-1∙mL-1])。シリーズ2(pce)および3(imt)およびTIP2k滴定前の機器バックグラウンドテストのプールデータ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

呼吸測定に利用できるサンプルの量は、例えば、生検、初代細胞、または細胞数が少ないゆっくりと増殖する細胞培養の研究において、しばしば制限されます1。さらに、呼吸活動は、ミトコンドリア損傷11、または脂肪酸酸化などの低容量のミトコンドリア経路を調査する場合に抑制されます12。このような場合、呼吸測定チャンバーの容積が小さいと、O2フラックスの分解能に利点があります。ただし、機器のバックグラウンドO2フラックスは、チャンバー容積が小さいほど増加し、確実に測定されず、O2濃度の関数として適切に補正されていない場合に誤差を誘発します。機器によるO2バックグラウンドテストとバックグラウンド補正の再現性は、チャンバー容量が少ない場合に特に重要です。理論的(J°R1)と実験的(J°air)O2フラックスのほぼ同じ値は、POSの陰極反応で4 e-/O2を使用したポーラログラフィー測定の精度の証拠を提供します。J°R1とJ°airの差は、sVチャンバーとcVチャンバーでそれぞれ0.43±0.22±0.31 pmol∙s-1∙mL-1であり、測定の精度は2.0mLチャンバーの検出限界(±1 pmol∙s-1∙mL-1)内にあることを示しています28.2.0 mL チャンバーと 0.5 mL チャンバーに同じタイプのポーラログラフ酸素センサーを使用した場合、体積比バックグラウンド O2 フラックスはチャンバー容積に反比例して 4 倍に増加し、変動性は 2 つのチャンバー容積でほぼ同じで、SD は J°air で 0.5 および 0.3 pmol∙s-1∙mL-1、sV および cV の J°50 で 0.9 および 0.8 pmol∙s-1∙mL-1 でしたチャンバー、それぞれ(表2)。少なくとも、小容量チャンバーが設計された呼吸活動では、小さなバックグラウンド効果でも重要になります(補足表 3;補足図2)。したがって、適切な補正を適用するには、機器のバックグラウンドO2フラックス(図1)の定期的な評価が必要です28。

均質なシステムを維持し、安定した酸素シグナルを保証するには、培地を高度かつ一定に撹拌する必要があります。2.0mLチャンバーでは750rpmの撹拌速度が確立されていますが、0.5mLチャンバーでは最適な速度は不明でした。ガラスチャンバーとスターラーバーの形状が異なるため(表2)、最適な攪拌速度を個別に評価する必要があります。酸素センサーは、チャンバー容積に関係なく、550 rpm から 950 rpm の間の撹拌速度の変化に反応し、750 rpm での O2 信号 R1 からのわずかな偏差がありました。チャンバーsVについて評価された指数時定数τは、同じ撹拌速度13で2.0mLチャンバーについて報告されたτと一致していました。これらの結果は、撹拌が両方のチャンバー形状で等しく効果的であり、デフォルトの撹拌速度である 750 rpm(2.0 mL チャンバー)を 0.5 mL チャンバーに適用できることを示唆しています。「オープン」チャンバー構成と「クローズド」チャンバー構成の両方で、0.5 mLチャンバーの方がS/N比が高く、0.5 mLチャンバーの利点としてより高い精度が示唆されました(図5)、個々のPOSのばらつきの影響を排除することはできません。撹拌速度を 750 rpm から 550 rpm に下げても騒音は増加しなかったため、0.5 mL チャンバー内で撹拌速度を 550 rpm に下げると、信号対雑音比を損なうことなくせん断応力を最小限に抑えることができます。

適切なバックグラウンド補正を適用した場合、3つの実験モデルで0.5mLチャンバーと2.0mLチャンバーでほぼ同じO2消費率が測定されました。直径2μmの小さな血小板42、生きた透過処理された線維芽細胞、および単離されたミトコンドリアで得られた結果は、幅広い細胞型およびミトコンドリア製剤の0.5mLおよび2.0mLチャンバーで一貫した呼吸数が得られることが期待できることを示唆しています。ただし、透過性筋線維は本研究ではテストされていません。ロックスの正確な測定には、酸素レベル40 の制御と高い機器分解能が必要です1。roxの体積特異的O2フラックスは、検出限界と同じくらい低い場合があります。実験で使用する細胞数が少ない場合、または一般的に少量のサンプルを使用する場合、再酸素化は必要ありません。ただし、必要に応じて、O2 フラックスの安定化に必要な期間中の O2 濃度の急激な低下を避けるために、O2 フラックスの低い呼吸状態で再酸素化を実行することをお勧めします。再酸素化後のO2フラックスの安定化は、0.5mLチャンバーでより時間がかかります。

品質管理への貢献として、部分的な容量交換中に懸濁液中のサンプルの希釈に特に注意を払う必要があります。完全に挿入されたストッパーを取り外した後、チャンバー内の呼吸媒体の総体積V'は、実験体積Vおよびストッパー毛細管体積Vstcによって与えられます(表2)。したがって、ストック容量V J.iは、Vよりも大きい実際の容量V'で希釈され、0.5 mLチャンバーと2.0 mLチャンバーで希釈係数V/V'はそれぞれ0.5/0.54 = 0.926および2.0/2.07 = 0.966になります(図2)。血小板を用いた実験では、希釈係数 0.909 に相当する 0.05 mL の毛細管死体積を持つプロトタイプのストッパーをチャンバー sV に使用しました。

0.5 mLでは、同じサンプル濃度(体積あたりの量)で2.0 mLチャンバーよりも4倍近く少ない量の生細胞、透過処理細胞、および単離されたミトコンドリアが必要であり、細胞数またはタンパク質量を正規化した呼吸O2消費量の定量的に同等の結果が得られます。これは、Chamber sV が利用可能なサンプルの量が限られている研究にとって貴重なツールであることを示しています。一方、チャンバーsV に同量のサンプルを適用すると、体積比O2フラックスが増加し、呼吸活動が低い場合の測定の不確実性が減少します。

本研究における酸素レジームは、空気飽和度の O2 範囲を 30 μM に制限しました。この範囲を超える酸素レベルでの適用性は、組織の正常酸素または低酸素状態でのミトコンドリア機能43 と高酸素状態での透過処理組織を調査するためにさらなる評価が必要です9。Oroboros NADHおよびQモジュールのいくつかのマルチセンサー構成。pH、NO、TPP+電極10,44 - チャンバーs V には収容できず、2.0 mL チャンバーが必要です。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ELはオロボロス・インスツルメンツの従業員です。EGは、Oroboros Instrumentsの創設者兼CEOです。

LFGSは、プロジェクト中にOroboros Instrumentsに採用されました。EÅFとEEは、スウェーデンのルンドにあるAbliva ABの従業員であり、Oroboros Instrumentsと商業契約を結んでいます。

LRは利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

単離されたミトコンドリアのデータを収集してくれたManuela Passrugger氏、撹拌回転速度のテストに関する技術サポートを提供してくれたPatrizia Guerth氏、撹拌機テストからの時定数の分析を提供してくれたMateus Gringsに感謝します。ガラスチャンバー、ストッパー、磁場強度の技術データに関する情報を提供してくれたパートナーであるWGT Elektronik GmbH &; Co KG(オーストリア、コルサス)に感謝します。ルイザ・HDカルドーゾ、アレハンドラ・ロメロ・マルティネス、オンドレイ・ソボトカ、アルバ・ティモン・ゴメス、ハイメ・ウィリスのコメントに感謝します。この研究は、助成金契約番号 859770、NextGen-O2k プロジェクトに基づく欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーション プログラムによって部分的に資金提供されました。短期科学ミッション(LFGS、LR)の財政的支援によるMitoEAGLE CA15203 COSTアクションへの貢献。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Anaconda3Anaconda Software Distributionhttps://www.anaconda.com/software
ADPMerck, Germany117105
Antibiotics-antimycotics 100xBiosera, FranceXC-A4110CAUTION H317 アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性がある
Antimycin ASigma-Aldrich, USAA8674注意 H300 飲み込むと致命的、H400 短期 (急性) 水生ハザード 
アスコルビン酸シグマアルドリッチ、米国A7631
ATPシグマアルドリッチ、米国 A 2383
BSA 脂肪酸フリーシグマ・アルドリッチ、米国A 6003ウシ血清アルブミン
CaCO3グマ・アルドリッチ、米国C 4830
CCCPシグマ・アルドリッチ、米国C2759シアン化カルボニル m-クロロフェニル ヒドラゾン 注意 H301 + H311 + H331 飲み込んだり、皮膚に接触したり、
Countess 自動セルカウンター サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国AMQAX100
シトクロム cシグマアルドリッチ、米国C7752
DatLab Oroboros Instruments、オーストリアバージョン 7.4データ収集および分析用ソフトウェア
DatLab Oroboros Instruments、オーストリアバージョン 8.1データ収集および分析用ソフトウェア
DC タンパク質アッセイBio-Rad、米国5000112タンパク質アッセイキット。注意 H314 重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こす
ジトニンシグマ アルドリッチ、米国D5628注意 H301 飲み込むと有毒
ジチオスレイトールシグマ アルドリッチ、米国D 0632注意 H318 重度の眼の損傷を引き起こす
DMEMPan Biotech、ドイツP04-05551ダルベッコ'の改造されたイーグル」s medium
DMSOSigma-Aldrich、米国D2650ジメチルスルホキシド
DPBSLonza Bioscience、スイスLONBE17-512Fカルシウムフリー ダルベッコ's リン酸緩衝生理食塩水
EGTAシグマ・アルドリッチ、米国E 4378
FBSサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国A5256701ウシ胎児血清
コースシグマ・アルドリッチ、米国 G7528
タミン酸 Sigma-Aldrich、米国G1626
グリセロリン酸Santa Cruz Biotechnologysc-215789
Heraeus Multifuge 3s LargeThermo Fisher Scientific、米国HM3S遠心分離機
Hettich Rotina 380R Andreas Hettich GmbH & Co. KG、ドイツ1701遠心分離機
イミダゾールハネウェル フルーカ、オーストリア56750注意 H302 飲み込むと有害、H314 重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こします、H360D 胎児に損傷を与える可能性があります
。jamovi プロジェクトバージョン 2.3.13ソフトウェア
K+-MESSigma-Aldrich、米国M 8250
Leucosep tube Greiner Bio-One GmbH、オーストリアZ642843-300EAポリエチレンバリア付き遠心分離管
ゴ酸 Sigma-Aldrich、米国M1000CAUTION H319 重度の眼刺激を引き起こします。
マンニトールシグマ アルドリッチ、米国M 4125
MgCl2 Scharlau、スペインMA 0036
MiR05-KitOroboros Instruments、オーストリア60101-01ミトコンドリア呼吸培地
キサー Swelab Instruments、スウェーデン440Sロッキングテーブル
Mr. Frosty 冷凍容器Thermo Fisher Scientific、米国5100-0001冷凍容器
OroborosOroboros Instruments、オーストリアNextGen-O2k と O2k は、オロボロス
オロボロスチャンバー cVOroboros Instruments、オーストリア23100-01クラシック容量チャンバー
Oroboros Chamber sVOroboros Instruments、オーストリア33100-01小容量チャンバー
Oroboros TIP2k-ModuleOroboros Instruments、オーストリア11100-03滴定注入マイクロポンプ
O2-Zero 粉末Oroboros Instruments、オーストリア26600-02&nbsp;Na-ジチオナイト注意 H251 自己発熱: 発火する可能性がある、H302 飲み込むと有害、H319 深刻な眼の炎症を引き起こす
オクタノイルカルニチンバイオトレンド - APExBIO テクノロジー、ドイツB6371
オリゴマイシンシグマ アルドリッチ、米国O4876
ホスホクレアチンシグマ アルドリッチ、米国P 7936
ピルビン酸シグマ アルドリッチ、米国P2256注意 H317 アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性がある
ロテノンシグマ・アルドリッチ、米国R8875注意 H300 飲み込むと致命的
皮膚線維芽細胞株  ATCC、米国
アジ化ナトリウムSigma-Aldrich、米国S2002注意 H300 + H310 + H330 飲み込んだり、皮膚に接触したり、吸入したりすると致命的です
ブチリシン ASigma-Aldrich、米国P 5380H318 - 重篤な眼の損傷を引き起こす、H334 - 吸入するとアレルギーや喘息の症状、または呼吸困難を引き起こす可能性があります
ハク酸塩Sigma-Aldrich, USAS2378
スクロースシグマ - アルドリッチ、米国S 7903
Swelab アルファ血球カウンター  Boule Diagnostics AB、スウェーデン 1420041
タウリン シグマ・アルドリッチ、米国T 0625
Tecan Infinite TM F200テカン、スイス分光光度計
TMPDシグマ・アルドリッチ、米国T3134N、N、N'、N'-テトラメチル-p-フェニレンジアミン二塩酸塩 注意 H315 皮膚刺激を引き起こし、H319 深刻な眼刺激を引き起こす
トリプシンシグマ・アルドリッチ、米国T4799注意 H334 吸入するとアレルギーや喘息の症状、または呼吸困難を引き起こす可能性があります
VacuetteGreiner Bio-One GmbH、オーストリア15452520
シ吸入したりすると有毒です デグルグルリンミ ス 注意 コ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zdrazilova, L., Hansikova, H., Gnaiger, E. Comparable respiratory activity in attached and suspended human fibroblasts. PLoS ONE. 17 (3), e0264496(2022).
  2. Schöpf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nat Commun. 11 (1), 1487(2020).
  3. Meszaros, A. T., et al. The predictive value of graft viability and bioenergetics testing towards the outcome in liver transplantation. Transplant International. 37, 12380(2024).
  4. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).
  5. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
  6. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci. 97 (20), 11080-11085 (2000).
  7. Gnaiger, E. Oxygen Conformance of Cellular Respiration. Hypoxia. Advances in Experimental Medicine and Biology. Roach, R. C., Wagner, P. D., Hackett, P. H. , Springer. Springer, Boston, MA. (2003).
  8. Harrison, D. K., Fasching, M., Fontana-Ayoub, M., Gnaiger, E. Cytochrome redox states and respiratory control in mouse and beef heart mitochondria at steady-state levels of hypoxia. J Appl Physiol. 119 (10), 1210-1218 (2015).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  10. Komlódi, T., Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Moore, A. L., Rich, P. R., Gnaiger, E. Coupling and pathway control of coenzyme Q redox state and respiration in isolated mitochondria. Bioenerg Commun. 2021.3, (2021).
  11. Suomalainen, A., Nunnari, J. Mitochondria at the crossroads of health and disease. Cell. 187 (11), 2601-2627 (2024).
  12. Cardoso, L. H. D., et al. Fatty acid β-oxidation in brain mitochondria: Insights from high-resolution respirometry in mouse, rat and Drosophila brain, ischemia and aging models. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871, 167544(2025).
  13. Gnaiger, E. Bioenergetics at low oxygen: dependence of respiration and phosphorylation on oxygen and adenosine diphosphate supply. Respir Physiol. 128 (3), 277-297 (2001).
  14. Gnaiger, E. Polarographic Oxygen Sensors, the Oxygraph and High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function. Mitochondrial dysfunction in drug-induced toxicity. Dykens, J. A., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 327-352 (2008).
  15. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. An Introduction to OXPHOS analysis. Bioenerg Commun. 2020.2, (2020).
  16. Diaz, E. C., Adams, S. H., Weber, J. L., Cotter, M., Børsheim, E. Elevated LDL-C, high blood pressure, and low peak VO₂ associate with platelet mitochondria function in children-The Arkansas Active Kids Study. Front Mol Biosci. 10, 1136975(2023).
  17. Ehinger, J. K., Morota, S., Hansson, M. J., Paul, G., Elmér, E. Mitochondrial dysfunction in blood cells from amyotrophic lateral sclerosis patients. J Neurol. 262 (6), 1493-1503 (2015).
  18. Heimler, S., et al. Platelet bioenergetics are associated with resting metabolic rate and exercise capacity in older adult women. Bioenerg Commun. 2022.2, (2022).
  19. Palacka, P., et al. Platelet mitochondrial bioenergetics reprogramming in patients with urothelial carcinoma. Int J Mol Sci. 23 (1), 388(2021).
  20. Fischer, C., et al. Mitochondrial respiration in response to iron deficiency anemia: Comparison of peripheral blood mononuclear cells and liver. Metabolites. 12 (3), 270(2022).
  21. JedIicka, J., et al. Impact of aging on mitochondrial respiration in various organs. Physiol Res. 71 (Suppl. 2), S227-S236 (2022).
  22. Westerlund, E., et al. Correlation of mitochondrial respiration in platelets, peripheral blood mononuclear cells and muscle fibers. Heliyon. 10 (5), e26745(2024).
  23. Hütter, E., Renner, K., Pfister, G., Stöckl, P., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Senescence-associated changes in respiration and oxidative phosphorylation in primary human fibroblasts. Biochem J. 380 (3), 919-928 (2004).
  24. Yépez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), e0199938(2018).
  25. Gnaiger, E. Bioenergetic cluster analysis - mitochondrial respiratory control in human fibroblasts. MitoFit Preprints. 2021.8, (2021).
  26. Palmer, J., Tandler, B., Hoppel, C. Biochemical properties of subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria isolated from rat cardiac muscle. J Biol Chem. 252, 8731-8739 (1977).
  27. Lai, N. M., Kummitha, C., Rosca, M. G., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. L. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol. 225 (2), e13182(2019).
  28. Baglivo, E., Cardoso, L. H., Cecatto, C., Gnaiger, E. Statistical analysis of instrumental reproducibility as internal quality control in high-resolution respirometry. Bioenerg Commun. 2022.8, (2022).
  29. Mela, L., Seitz, S. Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue. Methods Enzymol. 55, 39-46 (1979).
  30. Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Gnaiger, E. Magnesium Green for fluorometric measurement of ATP production does not interfere with mitochondrial respiration. Bioenerg Commun. 2021.1, (2021).
  31. Gnaiger, E. The elementary unit — count and numbers in the International System of Units. BEC preprints. , (2025).
  32. Vernerova, A., et al. Mitochondrial respiration of platelets: Comparison of isolation methods. Biomedicines. 9 (12), 1859(2021).
  33. Oroboros Instruments SUIT-003 O2 ce-pce D018. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018 (2024).
  34. Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004 (2024).
  35. Timón-Gómez, A., et al. Bioenergetic profiles and respiratory control in mitochondrial physiology: Precision analysis of oxidative phosphorylation. Exp Physiol. , 1-33 (2025).
  36. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 ce-pce D007. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007 (2024).
  37. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005 (2024).
  38. The Jamovi Project jamovi (Version 2.3.13). , https://www.jamovi.org/ (2024).
  39. Gnaiger, E. Preface: A biologist´s view. Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Gnaiger, E., Forstner, H. , Berlin, Heidelberg, New York. Springer. V-VII (1983).
  40. Hütter, E., Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol Biol Rep. 29 (1/2), 83-87 (2002).
  41. Oroboros Instruments Cell count and normalization in HRR. , https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR (2020).
  42. Williams, O., Sergent, S. R. Histology Platelets. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2022).
  43. Donnelly, C., et al. The ABC of hypoxia - what is the norm. Bioenerg Commun. 2022.12.V2, (2022).
  44. Aguirre, E., Rodríguez-Juárez, F., Bellelli, A., Gnaiger, E., Cadenas, S. Kinetic model of the inhibition of respiration by endogenous nitric oxide in intact cells. Biochim Biophys Acta. 1797 (5), 557-565 (2010).

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