ここでは、ゼブラフィッシュの低存在量タンパク質の可視化に特に有用な、新たに開発および改変された in vivo システムであるゼブラフィッシュ幼生の蛍光タンパク質タグでタンパク質を標識するプロトコールを紹介します。
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方法論記事
ゼブラフィッシュの低発現タンパク質を可視化するための蛍光標識
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
CRISPR/Cas9を介したノックイン(KI)技術により、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)の蛍光タンパク質のタグ付けが容易になります。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、発生初期段階での透明性により、 in vivo イメージングに適したモデル生物です。ここでは、高効率蛍光遺伝子KIの実施、KI創始者のための迅速なスクリーニング、ゼブラフィッシュ幼生における低存在量タンパク質追跡のための詳細なプロトコールを提供します。これは、その後のゼブラフィッシュにおける生理病理学的研究の重要な基盤となります。現在のプロトコルには、目的遺伝子のsgRNA設計、sgRNA のin vitro 転写、Cas9 mRNA のin vitro 転写、最も効率の高い遺伝子の in vivo sgRNAスクリーニング、ドナープラスミドの設計と構築、ゼブラフィッシュの幼生へのマイクロインジェクション、KIファウンダースクリーニング、ゼブラフィッシュのライブイメージングのための完全なステップが含まれています。重要な手順、トラブルシューティングのヒント、品質管理方法、およびこのプロトコルの利点とアプリケーションが含まれており、説明されています。このプロトコルは、迅速かつ正確な結果を低コストで保証し、複数の試験で検証されています。
概要
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、モデル生物として広く認められており、発生、再生、腫瘍形成、感染、免疫などの科学研究に広く使用されています1,2,3,4,5。ゼブラフィッシュは、メラニン生成を阻害し、ゼブラフィッシュの幼生を比較的長期間透明にする有毒な化合物であるPTU(1-フェニル2-チオ尿素)で処理した場合、in vivoライブイメージングに特に適しています6。また、casper7やcrystal8などの遺伝子組み換え透明ゼブラフィッシュ株も利用可能であり、成魚期までのライブ可視化と系統追跡が可能です。成魚の生体可視化を改善するために色素沈着を克服するこれらの取り組みに加えて、私たちの研究は、蛍光タンパク質のタグ付けをより効率的にし、人工的でないものにするための強力な遺伝子編集戦略の開発にも焦点を当てています。
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プロトコル
すべてのゼブラフィッシュの飼育と実験は、厦門大学の実験動物管理および倫理委員会によって審査および承認され、厦門大学実験動物センターによって定義された良好な動物慣行に厳密に準拠していました。この研究は、動物の使用に関連するすべての倫理規則に準拠していました。
注:すべての成体および幼生のゼブラフィッシュは、厦門大学のゼブラフィッシュ水槽システムで、28.5°Cで13/11時間の明暗サイクルで標準プロトコルに従って維持されました。胚は、制御されたインキュベーター(温度、28±0.5°C;光、13時間光/11時間暗サイクル)の胚緩衝液(表1)に保持しました。すべてのゼブラフィッシュの給餌と一般的なモニタリングは、1日2回(午前9時と午後4時)行われました。本研究で用いた野生型(WT)株はテュービンゲン(Tü)でした。
1. 目的の遺伝子の選び方とガイドRNAの設計
- 目的の遺伝子の情報を知る。データベース(https://zfin.org/)を検索し、遺伝子変異の数がわかっていることを確認します。操作するバリアントを決定し、ゲノム配列、cDNA配列、コーディング配列(CDS)などの標的遺伝子情報をEnsembl(https://www.ensembl.org/)からダウン....
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結果
コネキシンと呼ばれる高分子タンパク質からなるギャップ結合は、接触する細胞間での低分子量代謝物とイオンの交換に不可欠です。上記の蛍光タンパク質標識法を用いて、 コネキシン39.9 (図5A)および コネキシン44.1 (図5B)をそれぞれ標識した。ジャンクションPCRにより、正しいKIが検証されました(図6)。公表されたデータ16と一致して、遺伝性の特異的蛍光が全てのF1 子孫の筋肉で観察され、 コネキシン39.9 のGFP標識が成功したことを示している(図5A)。以前の報告17と一致して、遺伝性の特異的蛍光がすべてのF2 子孫の水晶体で検出され、 コネキシン44.1のmCherryタグ付けが成.......
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ディスカッション
この実験を円滑かつ成功裏に実施するには、いくつかの重要な側面にもっと注意を払う必要があります。ゼブラフィッシュの注射に最適な発生段階は、1細胞期であるべきです。この段階で注入を完了すると、その後の分裂によって産生されるすべての細胞にKIに必要な成分が含まれるようになり、それによってすべての細胞で同時にKIが発生する確率が高まり、KIの全体的な成功率が向上します。周囲温度を下げると、ゼブラフィッシュの胚発生が遅くなります18。しかし、胚を低温に長時間さらすと、死亡率が増加します。したがって、胚を氷やコールドホルダーに直接置いたり、低温で長時間保管したりしてはならないことを強調します。代わりに、比較的低い周囲温度(16°C)を維持して胚の発達をわずかに遅らせ、できるだけ早く行うべき注入に十分な時間を与えます。通常、約100個の胚への注入は30分以内に行うことができます。その後、胚を28.5°Cの恒温インキュベーターに速やかに移し、生存率を最大限に確保する必要があります。
.......
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開示事項
すべての著者は、この論文に競合する利益がないことを宣言しています。
謝辞
この原稿の校正と編集をしてくださったLu Zhou氏(厦門大学)に感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金会(J.H.に助成金82388201、Y.Z.に助成金31801158)、中国国家重点研究開発プログラム(2020YFA0803500からJ.H.)、CAMS Innovation Fund for Medical Sciences(CIFMS)(2019-I2M-5-062からJ.H.)、福建省中央地方科学技術開発特別プログラム(2022L3079からJ.H.)の支援を受けました。 FuXia-Quan Zi-Chuang地区協力プログラム(3502ZCQXT2022003からJH)。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版決定、または原稿の準備に関与していませんでした。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1000 &マイクロ;L ヒント | 任意のブランド | N/A | すべての操作に対応 |
| 1.5 mLチューブ | 任意のブランド | N/A | さまざまな溶液の保存および遠心分離用 |
| 1.5 mLチューブ(RNaseフリー) | 任意のブランド | N/A | RNaseフリー溶液の保管および遠心分離用 |
| 10 & micro;Lのヒント | 任意のブランド | / A | すべての操作10 |
| µLのヒント(RNaseフリー) | 任意のブランド | N / | ARNaseフリーの操作 |
| 1000µL ヒント(RNaseフリー) | 任意のブランド | N / | ARNaseフリーの操作用 |
| 1-フェニル2-チオ尿素(PTU) | シグマ | P7629 | ニン生成を阻害し、幼虫を透明に保つために |
| 200&マイクロ;Lのヒント | ブランド | / A | すべての操作 |
| 200µLチップ(RNaseフリー) | 任意のブランド | N/A | RNaseフリーの操作用 |
| 2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus) | Vazyme | P213-03 | PCR sgRNA効率試験用 |
| 35mmディッシュ | コーニング | 430165 | |
| 6ウェルプレート | N/A | ゼブラフィッシュの個別飼育および一時飼育用 | |
| Acc65I | NEB | R0599S | 酵素消化 |
| 酢酸 | シグマ695092 | TAEバッファー調製用 | |
| 寒天 | Biofroxx | 8211GR500 | LBプレート用 |
| アンピシリン、ナトリウム塩 | サンゴン | A610028 | LBプレート用 |
| CaCl2 | Sigma | C5080 | 胚緩衝液調製用 |
| キャピラリーチューブ | ハーバード装置 | 30-0016 | 注射用針の生成用 |
| 毛細管 | 任意のブランド | ID(内径) = 0.1 mm | 1-nLの液滴を定量化するため |
| CRISPRscan | CRISPRscan | http://www.crisprscan.org/ | sgRNA設計 |
| 用DH5α | TIANGEN | CB101 | 形質転換用 |
| EDTA | Sigma | E6758 | 溶解バッファーおよび TAE バッファー調製用 |
| Ensembl | Ensembl | https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index | 遺伝子情報を探すには |
| エタノール | HUSHI | 64-17-5 | DNA精製・抽出用 |
| エキソヌクレアーゼIII | タカラ | 2170A | LIC |
| ガス式マイクロインジェクター | ワーナー・インスツルメンツ | PLI-100A | マイクロインジェクション用 |
| ゲル電気泳動装置 | WIX | WIX-EP3000 | ゲル用電気泳動 |
| グローブ | 任意のブランド | N/A | すべての操作に対応 |
| グルコース | sgdbio | 10010518 | LBプレート用 |
| グリセロール | サンゴン | A501745 | LBプレート用 |
| gRNA-pMD19-T | 中国ゼブラフィッシュリソースセンター(CZRC) | CZP3 | sgRNAプラスミド含有 sgRNA足場 |
| KCl | シグマ | P5405 | 胚用緩衝液 |
| 塩化リチウム沈殿液 | サーモフィッシャー | AM9480 | sgRNAの沈殿、RNaseフリー |
| 低融点アガロース | サンゴン | A600015 | 4%アガロースゲルの調製用 |
| 硫酸マグネシウム | sgdbio | 20025118 | LBプレート用 |
| メタルバス | 任意のブランド | N/A | 恒温インキュベーション用 |
| メチレンブルー | シグマ | M9140 | 胚緩衝液調製用 |
| マイクロインクションモールド | 自家製 | N/A | マイクロインジェクション中に胚を保持する溝を生成するため |
| マイクロローダー、フェムトチップやその他のガラスマイクロキャピラリーを充填するためのチップ、滅菌、0.5 – 20 & マイクロ;L、100mm、ライトグレー、192個(2ラック&回:96個入り) | エッペンドルフ | 5242956003 | マイクロインジェクション溶液を注射針にロードするには、RNaseフリー |
| のマイクロピペットプーラー | Sutter Instrument | P-97 | 注射用針を生成するため |
| マイクロピペット | エッペンドルフ | N/A | すべての操作に対応できる |
| マイクロ波 | 任意のブランド | N/A | インジェクションプレートとアガロースゲルの鋳造用 |
| MinElute PCR精製キット (50) | QIAGEN | 28004 | PCR産物および消化産物を精製するために、RNase-free |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription Kit | Invitrogen | AM1348 | Cas9 mRNAのIn-vitro転写、RNaseフリー |
| N2 | Any brand | N/A | マイクロインジェクション用 |
| NaCl | Sigma | S5886 | 胚緩衝液および溶解緩衝液調製用 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 胚緩衝液調製用 |
| NaOH | サンゴン | A100173 | TAE緩衝液調製用 |
| ヌクレアーゼフリー水 | サーモフィッシャー | R0581 | RNA関連操作、RNase |
| フリーPciI | NEB | R0655S | 酵素消化 |
| PCR装置 | 銘柄不問 | N/A | PCR増幅 |
| PCRストリップチューブ | 任意のブランド | N/A | PCR |
| 用 PCRチューブ | FEITONGKANG | blp-200 | PCR |
| シャーレ | 任意のブランド | N/A | ゼブラフィッシュの幼生などの飼育に。 |
| フェノールレッド | シグマ | P0290 | マイクロインジェクション用、RNaseフリー |
| ピペットホルダー | ワーナーインスツルメンツ | PLI-PH1 | マイクロインジェクション用 |
| PrimeStar (Premix) | タカラ | DR040A | 分子クローニング用 |
| プロテイナーゼK | メルク | 539480 | ゲノムDNA抽出用 |
| pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin) | 中国ゼブラフィッシュリソースセンター (CZRC) | CZP11 | Cas9プラスミドテンプレート |
| 冷蔵遠心分離機 | 任意のブランド | N/A | RNA関連の遠心分離用 |
| スケール | ザルトリウス | BCE124-1CCN | キャスティング用、注入プレート、アガロースゲル |
| はさみ | 任意のブランド | N/A | 成魚の尾のクリッピング用 |
| SDS | サンゴン | A600485 | 溶解バッファー調製用 |
| 小型ブラシ | 任意のブランド | N/A | マイクロインジェクションプレート上の胚を優しく動かすため |
| 分光光度計 | サーモフィッシャー | NanoDrop 2000 | DNA/RNA濃度測定用 |
| ステージマイクロメーター | 任意のブランド | DIV(分割) = 0.01 mm | 1-nLの液滴を定量化するため |
| ステレオ蛍光顕微鏡 | オリンパス | SZX16 | 遺伝子発現の観察用 |
| 実体顕微鏡 | Motic | SMZ-168 | 観察・マイクロインジェクション用 |
| T7 RiboMAX Express 大規模RNA産生システム | Promega | P1320 | sgRNAの体外転写、RNaseフリー |
| 温度制御インキュベーター | ブランド問わず | N/A | 胚インキュベーション用 |
| TIDE | TIDE https://tide.nki.nl/ | sgRNA効率解析用 | |
| トリカインメタンスルホン酸 | シグマ | A5040 | トリカイン溶液調製用 |
| トリス | サンゴン | A600194 | トリカイン溶液、溶解緩衝液およびTAE緩衝液調製用 |
| トリプトン | OXOID | LP0042 | LBプレート用 |
| ピンセット | 任意のブランド | N/A | 注射針の切断用 |
| XbaI | NEB | R0145S | 酵素用消化 |
| 酵母エキス | OXOID | LP0021 | LBプレート用 |
| ゼブラフィッシュ水族館システム | ESEN | ESEN-AW-S1 | 成魚飼育用 |
| ゼブラフィッシュの交配タンク(仕切り付き) | 任意のブランド | N/A | 魚の交配用 |
| Zeiss LSM 900+Airyscan2 | ZEISS | Zeiss LSM900 | 蛍光標識魚の共焦点イメージングとデータ分析用 |
| ZFINウェブサイト | ZFIN | http://zfin.org/ | 遺伝子情報を探すには |
参考文献
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet....
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