方法論記事

ゼブラフィッシュの低発現タンパク質を可視化するための蛍光標識

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DOI：

10.3791/67616

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2025年1月24日

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1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

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この記事について

サマリー

ここでは、ゼブラフィッシュの低存在量タンパク質の可視化に特に有用な、新たに開発および改変された in vivo システムであるゼブラフィッシュ幼生の蛍光タンパク質タグでタンパク質を標識するプロトコールを紹介します。

要約

CRISPR/Cas9を介したノックイン(KI)技術により、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)の蛍光タンパク質のタグ付けが容易になります。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、発生初期段階での透明性により、 in vivo イメージングに適したモデル生物です。ここでは、高効率蛍光遺伝子KIの実施、KI創始者のための迅速なスクリーニング、ゼブラフィッシュ幼生における低存在量タンパク質追跡のための詳細なプロトコールを提供します。これは、その後のゼブラフィッシュにおける生理病理学的研究の重要な基盤となります。現在のプロトコルには、目的遺伝子のsgRNA設計、sgRNA のin vitro 転写、Cas9 mRNA のin vitro 転写、最も効率の高い遺伝子の in vivo sgRNAスクリーニング、ドナープラスミドの設計と構築、ゼブラフィッシュの幼生へのマイクロインジェクション、KIファウンダースクリーニング、ゼブラフィッシュのライブイメージングのための完全なステップが含まれています。重要な手順、トラブルシューティングのヒント、品質管理方法、およびこのプロトコルの利点とアプリケーションが含まれており、説明されています。このプロトコルは、迅速かつ正確な結果を低コストで保証し、複数の試験で検証されています。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、モデル生物として広く認められており、発生、再生、腫瘍形成、感染、免疫などの科学研究に広く使用されています1,2,3,4,5。ゼブラフィッシュは、メラニン生成を阻害し、ゼブラフィッシュの幼生を比較的長期間透明にする有毒な化合物であるPTU(1-フェニル2-チオ尿素)で処理した場合、in vivoライブイメージングに特に適しています6。また、casper7やcrystal8などの遺伝子組み換え透明ゼブラフィッシュ株も利用可能であり、成魚期までのライブ可視化と系統追跡が可能です。成魚の生体可視化を改善するために色素沈着を克服するこれらの取り組みに加えて、私たちの研究は、蛍光タンパク質のタグ付けをより効率的にし、人工的でないものにするための強力な遺伝子編集戦略の開発にも焦点を当てています。

CRISPR/Cas9を介したマイクロホモロジーを介した末端接合(MMEJ)ベースのKI技術は、その比較的高いKI効率9,10,11,12により、ゼブラフィッシュを含む複数の生物の遺伝子改変に広く適用されています。in vivoイメージングを成功させるには、2つの課題に対処する必要があります。1つは、組換えのプロセスによってもたらされるインデルまたは傷跡です。もう1つは、一部の標的遺伝子が低レベルで内因的に発現しているため、共発現した蛍光タグのシグナルが弱くなり、in vivoでの検出に失敗することです。効率的かつ正確なタンパク質標識と内因性遺伝子発現レベルの干渉の最小化を目指して、最近の研究では、蛍光シグナル増幅「VH」標識法と洗練された生殖細胞スクリーニングワークフロー13を組み合わせた最適化された戦略が報告されました。これは、低発現遺伝子の蛍光標識により適しており、ドナー骨格を最適化し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と蛍光検証を組み合わせることにより、以前の方法よりも効率的です時間と労力を最小限に抑えて生殖細胞系スクリーニングを実装すること。ここでは、胚調製とゼブラフィッシュの飼育、sgRNAの設計、sgRNAのin vitro転写、Cas9 mRNAのin vitro転写、ゼブラフィッシュ胚マイクロインジェクション、最高効率のsgRNAのin vivoスクリーニング、ドナープラスミドの設計と構築、KIゼブラフィッシュのジェノタイピング、KI生殖細胞系スクリーニング、KIゼブラフィッシュのイメージングと表現型解析のステップなど、報告された方法の詳細なステップバイステップのプロトコルを紹介します。このオールインワンプロトコルは、最先端の蛍光標識法を提供し、さまざまな科学分野でゼブラフィッシュを使用した研究を促進し、さまざまな学問的背景を持つ読者に利益をもたらすことは間違いありません。

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プロトコル

すべてのゼブラフィッシュの飼育と実験は、厦門大学の実験動物管理および倫理委員会によって審査および承認され、厦門大学実験動物センターによって定義された良好な動物慣行に厳密に準拠していました。この研究は、動物の使用に関連するすべての倫理規則に準拠していました。

注:すべての成体および幼生のゼブラフィッシュは、厦門大学のゼブラフィッシュ水槽システムで、28.5°Cで13/11時間の明暗サイクルで標準プロトコルに従って維持されました。胚は、制御されたインキュベーター(温度、28±0.5°C;光、13時間光/11時間暗サイクル)の胚緩衝液(表1)に保持しました。すべてのゼブラフィッシュの給餌と一般的なモニタリングは、1日2回(午前9時と午後4時)行われました。本研究で用いた野生型(WT)株はテュービンゲン(Tü)でした。

1. 目的の遺伝子の選び方とガイドRNAの設計

  1. 目的の遺伝子の情報を知る。データベース(https://zfin.org/)を検索し、遺伝子変異の数がわかっていることを確認します。操作するバリアントを決定し、ゲノム配列、cDNA配列、コーディング配列(CDS)などの標的遺伝子情報をEnsembl(https://www.ensembl.org/)からダウンロードします。シーケンス内のエクソン、イントロン、UTRをマークし、開始コドン、および停止コドンをマークします。
  2. 標的遺伝子の終止コドン(TAA、TAG、またはTGA)の上流にあるCDSを200 bp以下でsgRNA標的領域として選択します。
    注:DNAシーケンシングにより、この領域に一塩基多型(SNP)がないことを確認することをお勧めします。
  3. CRISPRscanのウェブサイト(https://www.crisprscan.org/)を使用して、選択した標的領域内の候補sgRNAを設計し、sgRNAの効率を予測します。
    1. DNA配列をデザインフレームに入力します。
    2. 種、オフターゲットの最大ミスマッチ、エンドヌクレアーゼ、プロモーターなど、対応する情報を選択します。この場合、 ゼブラフィッシュ- ダニオレリオ、ミスマッチなし、Cas9-NGG、 およびin vitro T7プロモーターを選択します。
    3. 「Get sgRNAs」をクリックして、いくつかのsgRNAを取得します。in vivo スクリーニングで、CRISPRscan スコアが高く、オフターゲットスコアが低い 5-7 個の sgRNA を選択します。
  4. 約500 bpの産物を持つsgRNA標的部位に隣接するPCRプライマーを設計し、その後のPCR増幅、酵素消化試験、およびシーケンシングを行い、sgRNA/Cas9マイクロインジェクション後のノックアウト効率を確認します。アップストリームとダウンストリームの領域で約 20 bp のシーケンスを選択し、その GC 含有量が約 50% で、Tm 値が 50 〜 55°C の範囲であることを確認します。
    注:組み合わせる必要がある場合は、2つのアップストリームプライマーと2つのダウンストリームプライマーを設計します。

2. sgRNAの調製

注:一般的なsgRNAスキャフォールド配列(図1)は、プラスミドにクローニングされています(材料表)。

  1. PCRは、 表2 および 表3にそれぞれ示されたプライマーおよびPCRミックスを使用して、T7プロモーター-sgRNAコンジュゲート配列を増幅します。 表4のPCRプログラムを実行します。ランゲル電気泳動(アガロースゲル、TAEバッファー中の1.2%アガロース;TAEバッファ [表1];200ボルト;約5分)2μLのPCR産物を使用して、製品が正しいことを確認します(MWは約150 bpです)。
  2. 精製キット(Table of Materials)またはその他の市販のキットを使用して、製造元の指示に従ってPCR産物を精製します。
    注:今後は、RNaseフリーの試薬と材料を使用し、RNase汚染を避けるために特別な注意を払って手順を実施する必要があります(ディスカッションを参照)。
    1. 結合バッファーをPCR産物に5:1の容量比で加え、混合します。2 mLの収集チューブに入れたカラムに混合物を塗布します。17,900 × g で25°Cで1分間遠心分離します。 フロースルーを廃棄し、カラムを同じ収集チューブに戻します。
    2. 750 μLの洗浄バッファーをカラムに加え、17,900 × g で25°Cで1分間遠心分離します。 フロースルーを廃棄し、カラムを同じ収集チューブに戻します。17,900 × g で25°Cで2分間遠心分離します。 カラムを清潔な 1.5 mL チューブに入れます。
    3. 20 μL のヌクレアーゼフリー水をカラムに加え、17,900 × g で 25 °C で 2 分間遠心分離して DNA を溶出し、分光光度計を使用して濃度を測定します。
  3. 表の材料表のT7 RNA産生システムまたは同等のキットを使用して、精製されたDNAの250 ngをin vitroで転写します。RNaseフリーの操作と条件が必要です。
    1. 表3に従ってPCRチューブ(RNaseフリー)で反応液を調製し、穏やかに混合します。37°Cの金属浴中で2時間インキュベートします。
    2. DNase I (RNase-free) 0.5 μL を加え、穏やかに混合します。金属浴中で37°Cで15〜20分間インキュベートします。
    3. エタノール沈殿物
      1. 各反応にRNaseフリーの水を加えて最終容量を20 μLにし、サンプルを1.5 mLチューブに移します。
      2. 100%エタノール(2.5V、RNaseフリー)50μLを加えてよく混合し、氷上に10分間置いてから、21,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
      3. 上清を捨て、ペレットを500 μLの75%エタノール(RNaseフリー)で洗浄し、21,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
      4. 上清を捨て、ペレットを金属浴で45°Cで乾燥させ、40μLのRNaseフリー水で溶解します。
        注:KIの場合、sgRNAはLiCl沈殿する必要がありますが(下記参照)、KOの場合は必要ありません。
    4. アガロースゲル(アガロースゲル:TAEバッファー中の1.2%アガロース;TAEバッファ [表1];200ボルト;約5分)RNAの1〜2μLで品質を推定し、次に分光光度計を使用して濃度を測定します。
      注:sgRNAは、さらなる使用のために-20°Cまたは-80°Cで保存することができます。

3. Cas9 mRNAの調製

  1. 製造元の指示に従って、XbaIを使用してCas9プラスミド(材料表)の酵素消化を1.5時間以上行ってください(反応ミックスについては 、表3を参照)。ゲル電気泳動による試験(アガロースゲル:TAEバッファー中の1.2%アガロース;TAEバッファ [表1];200ボルト;約10分)を1μLで使用して、消化が完全であることを確認します。
  2. sgRNA PCR産物と同じ方法で製品を精製します(ステップ2.2.1-2.2.3)。これからは、RNaseフリーの材料と操作が必要になります。
  3. Cas9 mRNAのin vitro転写には、T3転写キット(Table of Materials)または同等のキットを使用してください。
    1. 表3に従ってRNaseフリーPCRチューブで反応液を調製し、穏やかに混合します。37°Cで2.5時間以上インキュベートします。
    2. RNaseフリーのTurbo DNaseを1 μL加え、37°Cで15-20分間インキュベートします。
    3. LiClの沈殿物
      1. サンプルを1.5mLチューブに移し、LiCl 30 μL(1.5 V)を加えて穏やかに混合します。
      2. 混合物を-20°Cで約30分間置いた後、21,000 × g で4°Cで30分間遠心分離します。
      3. 上清を捨て、ペレットを500μLの75%エタノール(RNaseフリー)で洗浄し、21,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
      4. 上清を捨て、ペレットを45°Cで乾燥させ、40μLのRNaseフリー水に溶解します。
  4. 分光光度計を使用してCas9 mRNAの濃度を測定します。アガロースゲル(アガロースゲル:TAEバッファー中の1.2%アガロース;TAEバッファ [表1];200ボルト;約10分)で1〜2μLのRNAを摂取し、濃度と品質を確認します。
    注:OD 260/280は2.0以上で、濃度は1000 ng/μL前後またはそれ以上である必要があります。

4. マイクロインジェクションの準備

  1. ゼブラフィッシュの準備:マイクロインジェクションの前夜、健康なメスのゼブラフィッシュ1匹と健康なオスのゼブラフィッシュ2匹を交配水槽に入れ、仕切りを使ってオスとメスを分離し、交配の準備をします。
  2. 4%アガロース、溶解バッファー、および胚バッファー(pH 8.0)を調製します(表1)。
  3. マイクロインジェクション用のキャピラリーガラス針を準備します(材料の表)。
  4. マイクロインジェクションプレートを調製する:溶かした4%アガロース35mLを10cmのシャーレに注ぎ、プラスチック型を静かに置き、くさび形のトラフを作成します。型を軽くたたいて気泡を避けてください。固まったら、二重蒸留水(ddw)を加え、プレートを4°Cに置いて後で使用します。

5. マイクロインジェクションによるsgRNA効率試験

  1. マイクロインジェクションの日には、 表5 に記載されているマイクロインジェクションミックスをRNaseフリー環境下の氷上で調製します。
  2. RNaseフリーのピペットチップを使用して、マイクロインジェクション溶液を針にロードします(材料表)。気泡の持ち込みには十分ご注意ください。
  3. マイクロインジェクターに取り付けられたマイクロマニピュレーターにロードされた針を置きます。先のとがったピンセットで顕微鏡下で注射針の先端を切断し、針の先端をそっとつまんで折る。次に、ニードルが一貫して 1 nL の液滴を排出するまで注入圧力を調整し、ステージマイクロメーターとキャピラリーを使用して定量化します。
  4. 仕切りを取り外し、魚が約6分間繁殖するのを待ちます。1細胞期の胚を収集し、胚バッファーを含むペトリ皿に移します。
    1. 光学顕微鏡で胚の健康状態を調べ、未受精卵や破片を取り除きます。20個の健康な胚を未注入のコントロールとして、別のペトリ皿とラベルに置きました。
  5. 室温(RT)に温めたマイクロインジェクションプレートの溝に、健康な1細胞期の胚を小さなブラシで移し、優しく整列させます。余分なバッファーを削除します。
  6. その後のすべての操作は、実体顕微鏡下で行います。針先を使用して、動物の棒が針に向くように胚の位置をゆっくりと調整します。1 nLの混合溶液を動物極に注入します。
  7. 1つのsgRNAに対して、約100個の胚の注入で十分です。注入後、胚バッファーを入れた6ウェルプレートに胚を穏やかにすすぎます。ディッシュを28.5°Cの恒温インキュベーターに入れます。受精後約10時間(hpf)で、実体顕微鏡で胚の発生を調べ、死んだ胚を取り出します。
  8. 24 hpf で、ジェノタイピングのために 1.5 mL チューブに胚を採取します(sgRNA あたり 3 本、チューブあたり 5 個の胚)。余分な水をピペットで慎重に捨て、プロテイナーゼKを含む溶解バッファー100 μL(最終濃度0.5 mg/mL)を各チューブに加え、56°Cで1時間、次いで95°Cで15分間インキュベートします。
  9. エタノール200μL(2V)を加えてよく混合し、室温で19,000 × g で10分間遠心分離します。
  10. 上清を捨て、ペレットを500μLの70%エタノールで洗浄し、19,000 × g で室温で3分間遠心分離します。
  11. 上清を捨て、ペレットをRTで乾燥させ、50μLのddwで溶解します。次に、1 μLの抽出物を使用して、PCR用の反応ミックスを調製します(表3)(PCRプライマーについては、ステップ1.4を参照)。
  12. アガロースゲル(アガロースゲル:TAEバッファー中の1.2%アガロース;TAEバッファ [表1];200ボルト;約10分)2μLのPCR産物でPCRが成功したことを確認し、その後、酵素消化(表3)を行ってsgRNAの効率を決定します。酵素消化ミックスを穏やかに混合します。メーカーが推奨する時間、温度でインキュベートします。
  13. 消化産物用のアガロースゲルを実行します(アガロースゲル:TAEバッファー中の1.2%アガロース;TAEバッファ [表1];200ボルト;約10分)未消化のPCR産物をコントロールとして、消化が起こるかどうかを確認します。
    注:Cas9切断部位はPAMの約3 bp上流にあるため、制限酵素認識部位はPAMの6 bp上流をカバーするのに最適です。sgRNAの効率が高ければ、切断や誤修復によってインデルが生じるため、制限酵素が切断部位を認識できなくなってしまう可能性が高くなります。sgRNAが非効率的で、制限酵素認識部位が無傷であれば、酵素消化は正常に起こります。アガロースゲル電気泳動により、酵素消化が起こったかどうかを区別できます。
  14. 適切な制限酵素認識部位がない場合は、PCR産物のシーケンシングを行い、TIDEによるsgRNAの効率解析(https://tide.nki.nl/)。PCRを行い、コントロールとしてWTゲノムDNAの配列を決定することを忘れないでください。
    1. ウェブサイトを開き、「 TIDEを開始」をクリックします。 ガイド配列の下のフレームにsgRNAのガイド配列を入力します。
    2. [Control Sample Chromatogram (.ab1 or .scf)]の下の[Browse]をクリックして WT コントロールのシーケンシング結果を入力し、[Test Sample Chromatogram （.ab1 or .scf]の下の[Browse]をクリックして編集したサンプルのシーケンシング結果を入力したりします。
    3. [Update View] をクリックします。ウェブサイトには、2つのシーケンス間の差のパーセンテージが表示されます。割合が大きいほど、sgRNAの効率が高いことを示します。ノックアウト効率が80%を超えるsgRNAは、その後のKI手順に適しています。

6. 蛍光タンパク質標識のためのドナープラスミド構築

  1. 図2のように、最初にプラスミドにクローニングされ、次にさらに魚のゲノムに挿入される配列を設計します:予測されたCas9切断部位の上流の25 bp配列を左相同性アームとして設計し、予測されたCas9切断部位の下流の25 bp配列を右相同性アームとして設計します。sgRNA標的部位と終止コドンとの間にCDSをドナーに導入し、内因性遺伝子の完全性を維持します。
    注:補体CDSの5'( 図2の要素4)は、sgRNA/Cas9複合体による組換えゲノムの二次切断を避けるために、同義変異する必要があります。
  2. ドナープラスミドの構築には、エキソヌクレアーゼIII(材料表)を使用したライゲーション非依存性クローニング(LIC)14を使用します。ギブソンアセンブリなどの他の方法も実現可能です。クローニングプライマーを図2に示します。要素 "1", "2", "3", "4" はプライマーによって運ばれます。
    1. Design Primer F1は、ベクトル、要素「1」、および要素「2」の一部との重なり合うシーケンスで構成されています。
    2. デザインプライマーR2は、要素「1」、要素「2」、および要素「3」の一部で構成されています。
    3. デザインプライマーF2は、sgRNA標的部位に続くCDSの要素「3」、「4」、および5'配列で構成されています。
    4. 遺伝子のCDSの3'配列とベクターとのオーバーラップ配列で構成されるDesign Primer R1。
    5. ゼブラフィッシュのcDNAをテンプレートとして使用し、プライマーを使用してPCRを行います。
      注:プライマー間またはプライマーとベクター間の推奨オーバーラップは15〜20 bpです。これらのプライマーは標的遺伝子特異的であり、 cx39.9 および cx44.1 のプライマーの例を 表2に示します。この設計は、前述のように成功裏に適用されました13。詳細なプラスミドマップは 、補足ファイル1 および 補足ファイル2に記載されています。 cx39.9 および cx44.1 の設計DNAおよびタンパク質配列は、 補足ファイル3に記載されています。
    6. sgRNA PCR産物と同じ方法でPCR産物を精製します(ステップ2.2.1-2.2.3)。
  3. ドナーベクター(図3 および 表6)を適切な制限酵素で消化します。この例では、酵素はPciIとAcc65I(Table of Materials)です。製造元の指示に従って行ってください(表3)。消化したドナーベクターをsgRNA PCR産物と同じ方法で精製します(ステップ2.2.1-2.2.3)。
  4. 精製されたPCRフラグメントと消化されたドナーベクターをDNAゲル電気泳動(DNAゲル:TAEバッファー中の1.2%アガロース;TAEバッファ [表1];200ボルト;約10分)。 表3に従ってLICの反応混合物を調製します。
    注:反応のすべてのチューブと成分は氷の上に置く必要があり、反応とすべての操作は氷上で実行する必要があります。1 μL の Exo III (20 単位) を反応液に最後の成分として加え、すぐにピペットで上下させてすべての成分をよく混合します。PCRフラグメントを含まない反応ミックスを1つ、消化されたベクターの自己アニーリングの可能性を示すためのコントロールとして含めることを忘れないでください。
  5. すぐに反応混合物を氷の上に置き、60分間インキュベートします。
  6. 0.5 M EDTA(pH 8.0)を1 μL加えて反応を停止させ、ピペットで上下させてよく混合した後、60°Cで5分間インキュベートした後、氷上で5分間インキュベートします。
  7. LIC製品を使用してDH5αなどのコンピテントセルを形質転換し、LBプレート(材料の表 と 表1)で適切な抗生物質(この場合はアンピシリン)で細菌を16時間増殖させます。
  8. PCRフラグメント含有プレート上のコロニー数とコントロールプレート上のコロニー数との間に桁違いがあることを確認してください。LICプレートから単一のコロニーを取り出し、酵素消化分析とDNAシーケンシングを行います。
  9. sgRNA PCR産物と同じ方法で、精製キットを使用して正しいドナープラスミドを抽出し、精製します(ステップ2.2.1-2.2.3)。最終濃度が300 ng/μLを超えていることを確認してください。

7. ゼブラフィッシュ胚の遺伝子KIのためのマイクロインジェクション

  1. 表7に従ってマイクロインジェクション溶液を調製することを除いて、上述した全てのマイクロインジェクション操作を行う。

8. 蛍光タンパク質標識子孫のスクリーニングと同定

  1. マイクロインジェクションの12〜48時間後に実体蛍光顕微鏡で蛍光を観察します。
  2. 新たに確立されたスクリーニング方法を適用する 13.明らかな蛍光が観察された場合は、蛍光性の幼虫を選び出して飼育します。微量の蛍光のみが観察される場合、または蛍光が観察されない場合は、注入したすべての幼虫を飼育します。
  3. 生後1ヶ月で、ゼブラフィッシュに0.02%トリカインを注射して麻酔します(表1)。ゼブラフィッシュごとに、尾びれの小片をラベル付きPCRチューブに集め、対応する麻酔をかけたゼブラフィッシュを、同じラベルのUV滅菌ろ過水(pH 7.2)が入った6ウェルプレートの1つのウェルに保管します。
  4. アルカリ溶解法( 表1の溶解バッファー)15 をゲノムDNA抽出に使用し、続いて5'ジャンクションPCRを使用します。左ホモロジーアームの上流にフォワードプライマーを設計し、インサートにリバースプライマーを設計します(図4)。PCR産物のサイズは約500bpです。プライマーの例については、 表2を参照してください。
    注:蛍光ゼブラフィッシュの場合、このPCRを使用してKIの精度を検証するため、PCR産物をシーケンシングします。蛍光のないゼブラフィッシュの場合、このPCRを使用してKIが発生するかどうかを確認します。PCR陽性の魚を選び、F0として成魚に育てます。
  5. スクリーニングしたF0をWTと交配させて得られたF1胚のGFP発現パターンを調べ、ジャンクションPCRによって遺伝子型決定します。
    注:標的挿入がF1 で起こる場合(完全であるかどうかにかかわらず)、対応するF0 は遺伝性のF0として定義され、そのPCR産物が配列決定される。挿入が正確な場合、対応する F0 は目的の F0 として定義されます。
  6. 目的のF0 が得られたら、イメージング用の子孫を使用して、標的タンパク質を観察および追跡します。

9. イメージングとデータ処理

  1. 画像化する発達段階を決定します。事前に魚を準備してください。希釈した1-フェニル2-チオ尿素(PTU;0.003%、 材料表)を魚に加え、必要に応じて色素を除去します。
    注:PTUは、24 hpf後に適用すると効果が低くなります。この例では、PTUを24 hpfより前に胚緩衝液に加え、ゼブラフィッシュの幼生がイメージングのために処理された48 hpfまで緩衝液に保持しました。
  2. 溶かした4%アガロース(表1)を2 mL 35 mmのディッシュに加え、固めるために脇に置いておきます。魚を0.02%トリカインを含む胚緩衝液に移します(表1)。
  3. 溶かした4%アガロース200μLをddw1 mLに希釈します。アガロースが冷えている間に、1mLピペットを使用して麻酔をかけた魚を希釈したアガロースに移します。ステップ9.2で調製した固化した4%アガロースゲルを含む皿に、魚をマウントするアガロースを静かに混合し、移します。
  4. 関心のある部分が上にくるように魚を配置します。
  5. アップライト型共焦点蛍光顕微鏡を使用して、製造元の指示(材料表)に従ってイメージングおよびデータ処理を行います。

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結果

コネキシンと呼ばれる高分子タンパク質からなるギャップ結合は、接触する細胞間での低分子量代謝物とイオンの交換に不可欠です。上記の蛍光タンパク質標識法を用いて、 コネキシン39.9 (図5A)および コネキシン44.1 (図5B)をそれぞれ標識した。ジャンクションPCRにより、正しいKIが検証されました(図6)。公表されたデータ16と一致して、遺伝性の特異的蛍光が全てのF1 子孫の筋肉で観察され、 コネキシン39.9 のGFP標識が成功したことを示している(図5A)。以前の報告17と一致して、遺伝性の特異的蛍光がすべてのF2 子孫の水晶体で検出され、 コネキシン44.1のmCherryタグ付けが成...

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ディスカッション

この実験を円滑かつ成功裏に実施するには、いくつかの重要な側面にもっと注意を払う必要があります。ゼブラフィッシュの注射に最適な発生段階は、1細胞期であるべきです。この段階で注入を完了すると、その後の分裂によって産生されるすべての細胞にKIに必要な成分が含まれるようになり、それによってすべての細胞で同時にKIが発生する確率が高まり、KIの全体的な成功率が向上します。周囲温度を下げると、ゼブラフィッシュの胚発生が遅くなります18。しかし、胚を低温に長時間さらすと、死亡率が増加します。したがって、胚を氷やコールドホルダーに直接置いたり、低温で長時間保管したりしてはならないことを強調します。代わりに、比較的低い周囲温度(16°C)を維持して胚の発達をわずかに遅らせ、できるだけ早く行うべき注入に十分な時間を与えます。通常、約100個の胚への注入は30分以内に行うことができます。その後、胚を28.5°Cの恒温インキュベーターに速やかに移し、生存率を最大限に確保する必要があります。

...

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開示事項

すべての著者は、この論文に競合する利益がないことを宣言しています。

謝辞

この原稿の校正と編集をしてくださったLu Zhou氏(厦門大学)に感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金会(J.H.に助成金82388201、Y.Z.に助成金31801158)、中国国家重点研究開発プログラム(2020YFA0803500からJ.H.)、CAMS Innovation Fund for Medical Sciences(CIFMS)(2019-I2M-5-062からJ.H.)、福建省中央地方科学技術開発特別プログラム(2022L3079からJ.H.)の支援を受けました。 FuXia-Quan Zi-Chuang地区協力プログラム(3502ZCQXT2022003からJH)。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1000 &マイクロ;L ヒント任意のブランドN/Aすべての操作に対応
1.5 mLチューブ任意のブランドN/Aさまざまな溶液の保存および遠心分離用
1.5 mLチューブ(RNaseフリー)任意のブランドN/ARNaseフリー溶液の保管および遠心分離用
10 & micro;Lのヒント任意のブランド/ Aすべての操作10
µLのヒント(RNaseフリー)任意のブランドN /ARNaseフリーの操作
1000µL ヒント(RNaseフリー)任意のブランドN /ARNaseフリーの操作用
1-フェニル2-チオ尿素(PTU)シグマP7629ニン生成を阻害し、幼虫を透明に保つために
200&マイクロ;Lのヒントブランド/ Aすべての操作
200µLチップ(RNaseフリー)任意のブランドN/ARNaseフリーの操作用
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03PCR sgRNA効率試験用
35mmディッシュコーニング430165
6ウェルプレートN/Aゼブラフィッシュの個別飼育および一時飼育用
Acc65INEBR0599S酵素消化
酢酸シグマ695092TAEバッファー調製用
寒天Biofroxx8211GR500LBプレート用
アンピシリン、ナトリウム塩サンゴンA610028LBプレート用
CaCl2SigmaC5080胚緩衝液調製用
キャピラリーチューブハーバード装置30-0016注射用針の生成用
毛細管任意のブランドID(内径) = 0.1 mm1-nLの液滴を定量化するため
CRISPRscanCRISPRscan http://www.crisprscan.org/sgRNA設計
用DH5αTIANGENCB101形質転換用
EDTASigmaE6758溶解バッファーおよび TAE バッファー調製用
EnsemblEnsembl https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index遺伝子情報を探すには
エタノールHUSHI64-17-5DNA精製・抽出用
エキソヌクレアーゼIIIタカラ2170ALIC
ガス式マイクロインジェクターワーナー・インスツルメンツPLI-100Aマイクロインジェクション用
ゲル電気泳動装置WIXWIX-EP3000ゲル用電気泳動
グローブ任意のブランドN/Aすべての操作に対応
グルコースsgdbio10010518LBプレート用
グリセロールサンゴンA501745LBプレート用
gRNA-pMD19-T中国ゼブラフィッシュリソースセンター(CZRC)CZP3sgRNAプラスミド含有 sgRNA足場
KClシグマP5405胚用緩衝液
塩化リチウム沈殿液サーモフィッシャーAM9480sgRNAの沈殿、RNaseフリー
低融点アガロースサンゴンA6000154%アガロースゲルの調製用
硫酸マグネシウムsgdbio20025118LBプレート用
メタルバス任意のブランドN/A恒温インキュベーション用
メチレンブルーシグマM9140胚緩衝液調製用
マイクロインクションモールド自家製N/Aマイクロインジェクション中に胚を保持する溝を生成するため
マイクロローダー、フェムトチップやその他のガラスマイクロキャピラリーを充填するためのチップ、滅菌、0.5 – 20 & マイクロ;L、100mm、ライトグレー、192個(2ラック&回:96個入り)エッペンドルフ5242956003マイクロインジェクション溶液を注射針にロードするには、RNaseフリー
のマイクロピペットプーラーSutter InstrumentP-97注射用針を生成するため
マイクロピペットエッペンドルフN/Aすべての操作に対応できる
マイクロ波任意のブランドN/Aインジェクションプレートとアガロースゲルの鋳造用
MinElute PCR精製キット (50)QIAGEN28004PCR産物および消化産物を精製するために、RNase-free
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription KitInvitrogenAM1348Cas9 mRNAのIn-vitro転写、RNaseフリー
N2Any brandN/Aマイクロインジェクション用
NaClSigmaS5886胚緩衝液および溶解緩衝液調製用
NaHCO3SigmaS5761胚緩衝液調製用
NaOHサンゴンA100173TAE緩衝液調製用
ヌクレアーゼフリー水サーモフィッシャーR0581RNA関連操作、RNase
フリーPciINEBR0655S酵素消化
PCR装置銘柄不問N/APCR増幅
PCRストリップチューブ任意のブランドN/APCR
用 PCRチューブFEITONGKANGblp-200PCR
シャーレ任意のブランドN/Aゼブラフィッシュの幼生などの飼育に。
フェノールレッドシグマP0290マイクロインジェクション用、RNaseフリー
ピペットホルダーワーナーインスツルメンツPLI-PH1マイクロインジェクション用
PrimeStar (Premix)タカラDR040A分子クローニング用
プロテイナーゼKメルク539480ゲノムDNA抽出用
pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)中国ゼブラフィッシュリソースセンター (CZRC)CZP11Cas9プラスミドテンプレート
冷蔵遠心分離機任意のブランドN/ARNA関連の遠心分離用
スケールザルトリウスBCE124-1CCNキャスティング用、注入プレート、アガロースゲル
はさみ任意のブランドN/A成魚の尾のクリッピング用
SDSサンゴンA600485溶解バッファー調製用
小型ブラシ任意のブランドN/Aマイクロインジェクションプレート上の胚を優しく動かすため
分光光度計サーモフィッシャーNanoDrop 2000DNA/RNA濃度測定用
ステージマイクロメーター任意のブランドDIV(分割) = 0.01 mm1-nLの液滴を定量化するため
ステレオ蛍光顕微鏡オリンパスSZX16遺伝子発現の観察用
実体顕微鏡MoticSMZ-168観察・マイクロインジェクション用
T7 RiboMAX Express 大規模RNA産生システムPromegaP1320sgRNAの体外転写、RNaseフリー
温度制御インキュベーターブランド問わずN/A胚インキュベーション用
TIDETIDE https://tide.nki.nl/sgRNA効率解析用 
トリカインメタンスルホン酸シグマA5040トリカイン溶液調製用
トリスサンゴンA600194トリカイン溶液、溶解緩衝液およびTAE緩衝液調製用
トリプトンOXOIDLP0042LBプレート用
ピンセット任意のブランドN/A注射針の切断用
XbaINEBR0145S酵素用消化
酵母エキスOXOIDLP0021LBプレート用
ゼブラフィッシュ水族館システムESENESEN-AW-S1成魚飼育用
ゼブラフィッシュの交配タンク(仕切り付き)任意のブランドN/A魚の交配用
Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSZeiss LSM900蛍光標識魚の共焦点イメージングとデータ分析用
ZFINウェブサイトZFINhttp://zfin.org/遺伝子情報を探すには
N メラ任意のN のイメージング用 用 用

参考文献

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