アシネトバクター・バウマニーにおける蛍光を用いたT6SS活性検出法の確立と比較

Summary

ここでは、臨床株のハイスループット解析に適した細菌T6SSの活性を効率的かつ正確に評価するための、蛍光標識(特にルシフェラーゼ)に基づく定量的検出法を提案します。

Abstract

VI型分泌システム(T6SS)は、グラム陰性菌、特に アシネトバクター・バウマニー などの病原性種における細胞間相互作用を媒介する重要なメカニズムです。これまでの研究では、 A. baumannii ATCC 17978株の大きなプラスミドpAB3が、コアT6SS遺伝子の発現を阻害するTetR様タンパク質をコードしていることが示されています。これに対し、WT^R- 株はpAB3を欠いており、T6SSエフェクタータンパク質Hcpを安定して発現・分泌することができ、 大腸菌を死滅させる能力を示します。T6SSのコア遺伝子の一つである tssM 遺伝子は、その活性に必須です。その削除は、T6SSの不活性化に直接つながります。しかし、キリングアッセイなどの従来のT6SS活性検出法は、スループットが低く、感度が不十分であるという課題があります。これらの制限に対処するために、蛍光標識に基づく定量的検出法を開発しました。

T6SS活性検出を改善するために、3つの蛍光標識法を開発しました:(1)ルシフェラーゼ標識に基づく定量的検出法は、高い特異性、感度、再現性を特徴とするため、ハイスループット分析に適しています。(2)緑色蛍光タンパク質(GFP)標識に基づく検出法は、環境干渉を受けやすいにもかかわらず、ハイスループットの利点を提供します。(3)フローサイトメトリー検出は、細菌の生存率を定量的に評価できますが、運用が複雑で高価です。包括的な比較の結果、ルシフェラーゼベースの標識法は、最も正確で、感度が高く、ユーザーフレンドリーであることが証明されました。 A. baumanniiの20の臨床分離株に適用した場合、この方法はT6SS活性を迅速かつ正確に評価することが確認されました。

Introduction

VI型分泌システム(T6SS)は、グラム陰性菌の重要なタンパク質分泌システムであり、細菌の競合、真核生物の宿主に対する拮抗作用、および宿主免疫応答の調節に広く関与しています^1,2。T6SSは、毒性のあるエフェクタータンパク質を隣接する細菌や真核細胞に注入することで、複雑な環境で細菌が競争上の優位性を維持するのを助けます。近年、T6SSは細菌の適応性、病原性、および微生物相互作用に重要な役割を果たしているため、特に多剤耐性病原体において研究のホットスポットとなっています。その機能は、新しい抗菌戦略の開発のための潜在的な標的を提供します^3,4,5。

アシネトバクター・バウマニー(Ab)は、病院に広く分布しているグラム陰性日和見病原体です。その高い薬剤耐性と強力な適応性により、世界中で重要な院内病原体となっています^6,7,8。A. baumanniiが複雑な微生物環境で生存するためには、複数の分泌系に依存しており、その中でT6SSは他の微生物との競合や宿主との相互作用において重要な役割を果たしています。高度に保存されたT6SS遺伝子クラスターと明確に定義された機能により、A. baumanniiはT6SSメカニズムを研究するための理想的なモデルとなっています。さらに、A. baumanniiのT6SSのユニークな構造は、T6SSの多様性と機能をさらに明らかにするための独特の視点を提供します。

A. baumanniiのT6SS遺伝子クラスターには、12のコアタンパク質遺伝子(tssA-tssMなど、tssJを欠く)と、機能が不明ないくつかの遺伝子(tagX、tagN、tagFなど)が含まれています^2、9、10。その中でも、T6SSの重要な成分であるヘモリシン共調節タンパク質(Hcp)は、その分泌が機能的なT6SSの特徴と考えられています。研究によると、A. baumanniiの大きなプラスミドpAB3は、TetR様制御タンパク質をコードすることによりT6SSの発現を阻害することが示されています。対照的に、pAB3を失った株(WT^R−など)は、Hcpを安定して発現および分泌することができ、顕著なT6SS活性を示す¹¹。tssM遺伝子はT6SSのコア遺伝子の1つであり、その欠失はT6SSの不活性化に直接つながります。

しかし、従来のT6SS活性検出法(キリングアッセイなど)には、低スループット、再現性の低さ、感度の不足などの制限があり、T6SS⁵の詳細な研究と広範な適用を厳しく制限しています。そのため、効率的で正確なT6SS活性検出法の開発は、現在の研究において緊急の必要性となっています。本研究は、蛍光標識に基づくT6SS活性検出法を確立・比較し、従来の手法の欠点を克服することを目的としています。蛍光標識技術により、T6SS活性のリアルタイムかつ定量的なモニタリングを実現し、細菌相互作用の研究においてより正確で信頼性の高いツールを提供しています。この研究は、蛍光標識法の有効性を検証し、異なる蛍光標識法の長所と短所を比較することにより、将来の研究に新たな視点と方法論的サポートを提供しました。T6SS研究に新たな技術的手段を提供するだけでなく、細菌との相互作用の複雑なメカニズムを理解し、新たな抗菌治療戦略を開発するための科学的基盤を築きます。

Protocol

1. 菌株とプラスミドの供給源

1. A. baumannii標準株ATCC 17978、大腸菌(pZY01)、および吉林大学第一病院臨床医学科から分離されたA. baumanniiの臨床株を使用してください。
2. 実験室で改変保存していたプラスミドpZY01-GFP(カナマイシン耐性遺伝子を保有し、 A. baumanniiで安定発現可能)と市販のプラスミドpGEN-luxCDABE(アンピシリン耐性遺伝子を保有)を使用してください。
3. 50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.4)、15 mM(NH₄)₂SO₄、2 mM MgSO₄、0.2%(w / v)コハク酸ナトリウムを唯一の炭素源として、および0.01%(w / v)酵母抽出物¹²を含有するLuria-Bertani(LB)培地または最小培地でA.baumanniiおよびE.coliを培養します。必要に応じて、次の濃度で抗生物質を追加します:大腸菌:アンピシリン(100μg / mL)およびカナマイシン(50μg / mL)。A. baumannii:ストレプトマイシン(100μg/mL)。
   注: 大腸菌 (pZY01)および 大腸菌 (pZY01-GFP)はカナマイシン耐性を示します。 大腸菌 (pZY01)は蛍光マーカーを持っていないため、以下のテキストでは 大腸菌 と呼ぶことができます。

2. 実験前の細菌株の調製

1. 実験の2日前に-80°Cの冷凍庫から細菌株を取り出します。細菌株を、対応する抗生物質を含むLB寒天プレートに接種します。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
   注:実験開始時にすべての細胞がプラスミドを保持していることを確認してください。
2. 実験の1日前に、各細菌株の2つの独立した単一コロニーを選択します。各コロニーを別々に、5 mLのLB液体培地を含む2つの個別のチューブに接種します。培養物を37°Cで一晩インキュベートし、200rpmで振とうします。これらのカルチャを後続の実験に使用します。
   注:細菌の増殖速度に基づいてインキュベーション時間を最適化し、十分な量の細菌バイオマスが得られるようにします。

3. 大腸菌 (GFP)/ 大腸菌 (ルシフェラーゼ)株の調製

1. 変換
   1. 50 ngのプラスミドDNA(pZY01-GFPまたはpGEN-luxCDABE、NanoDropでA260/A280で定量)を100 μLの 大腸菌 DH5αコンピテントセルにそれぞれ加え、穏やかに混合します。
   2. 氷上で30分間インキュベートし、42°Cで60秒間ヒートショックを行い、直ちに氷上に30秒間置きます。
   3. 抗生物質を含まないLBブロス700μLを加え、180rpmで2時間振とうしながら37°Cでインキュベートします。
2. めっき・培養
   1. 420 × g で2分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを100 μLの抗生物質フリーLBブロスに再懸濁します。
   2. pZY01(GFP)形質転換産物を、50 μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天プレートに広げます。
   3. pGEN-luxCDABE形質転換産物を、100 μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天プレートに広げます。37°Cで一晩インキュベートします。
3. ポジティブクローンの検証
   1. 1つのコロニーを選び、翌日にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)テンプレートとしてDNAを抽出します。PCR増幅を行い、アガロースゲル電気泳動による検証を行います。
   2. 陽性株を確認し、 大腸菌 (GFP)および 大腸菌 (ルシフェラーゼ)として標識します。
      注:効率的な形質転換のためには、コンピテントセルの品質が高いことを確認してください。シングルコロニー分離との干渉を防ぐために、めっき中に過剰な細菌液を避けてください。

4. ウェスタンブロッティング

1. サンプル調製
   1. 細菌培養物を回収し、遠心分離機(1500 × g、10分、4°C)して、細胞ペレットと上清を分離します。
   2. 細胞ペレットと上清の両方に適切な量のローディングバッファーを添加します。100°Cの金属浴で10分間煮沸します。遠心分離(1500 g、10分、4°C)し、上清をタンパク質サンプルとして回収します。
   3. ビシンコニン酸(BCA)またはブラッドフォード法を使用してタンパク質濃度を測定し、同じ濃度に調整します。
2. ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)
   1. 適切な濃度のSDS-PAGEゲルを調製します(例:12%分離ゲル、5%スタッキングゲル)¹³。
   2. 20 μgのタンパク質サンプルを、1〜2 μLの染色済みタンパク質マーカーとともにゲルウェルにロードします。ブロモフェノールブルーインジケーターがゲルの底に達するまで、100〜120Vで電気泳動を行います。
      注:ランニングバッファー:トリス25 mM、グリシン192 mM、SDS 0.1%(w / v)、蒸留水1 L。
3. 転写(ウェスタンブロッティング)
   1. ガラスプレートからゲルを取り出し、転写バッファーに浸します。ポリフッ化ビニリデン(PVDF)またはニトロセルロース(NC)メンブレンを調製し、メタノールでPVDFメンブレンを活性化し、トランスファーバッファーに浸します。
      注:転写バッファー:25 mM Tris、192 mM Glycine、20% Methanol
   2. 転写装置を「サンドイッチ」構造(濾紙 - ゲル - 膜 - 濾紙)で組み立てます。100 Vで60〜90分間移送します(タンパク質の分子量に基づいて時間を調整します。宿主細胞タンパク質(HCP)の分子量は約17 kDa)です。
      注意: トランスファータンクを氷水に入れ、アイスパックを追加して低温を維持します。転送時間が長い場合は、アイスパックを途中で交換してください。
4. ブロッキング
   1. 移した後、メンブレンを5%脱脂乳ブロッキング溶液に入れます。室温(RT)でシェーカーで1時間または4°Cで一晩ブロックします。
5. 一次抗体のインキュベーション
   1. 0.1% Tween 20(TBST)緩衝液を含むトリス緩衝生理食塩水(TBS)でメンブレンを3回、毎回5分間洗浄します。希釈した一次抗体(マウス抗Hcp抗体、1:1000希釈、マウス抗イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(ICDH)抗体、1:1000希釈)とメンブレンを4°Cで一晩または室温で2時間インキュベートします。
6. 二次抗体インキュベーション
   1. TBSTバッファーでメンブレンを3回、各5分間洗浄します。希釈した二次抗体(西洋ワサビペルオキシダーゼ[HRP]標識抗マウスIgG、希釈率1:3000)でメンブレンを室温で2時間インキュベートします。
7. 検出
   1. TBSTバッファーでメンブレンを3回、各5分間洗浄します。ECL化学発光基質を調製し、メンブレンに均一に塗布します。
   2. 化学発光イメージングシステムを用いてシグナルを検出し、画像を捕捉します(HCPタンパク質の分子量は約17 kDa、ICDHは A. baumanniiの予想分子量約45 kDaの細胞質代謝酵素です)。
      注:ICDHは、細胞ペレット画分(無傷の細菌を含む)でのみ検出でき、上清画分(分泌タンパク質を含む)では検出されない重要な品質管理マーカーであり、サンプル調製中に細胞溶解が発生しなかったことを示しています。Hcp分泌(17 kDa)は、T6SS活性株の上清でのみ見えるはずです。

5. LB寒天培地を用いた96ウェルプレートの調製

1. オートクレーブ処理した抗生物質を含まないLB寒天培地を、あらかじめ加温した状態で、ウェルあたり50 μLの滅菌96ウェルプレートにすばやく加えます。プレートをRTに少なくとも1時間置いて、媒体が完全に固まるようにします。
2. GFP蛍光の検出には、底部が透明な黒壁のプレートを使用してください。
3. ルシフェラーゼ蛍光の検出には、耐光性96ウェルプレートを使用して、クロスウェル蛍光干渉を回避します。
   注:培地を添加する際に気泡を発生させないようにして、ゲルの厚さを均一にし、最適な細菌との接触と増殖を促進します。

6. A. baumannii 殺害アッセイ

1. 標準的な殺傷アッセイ
   1. WT^R- およびΔtssM 変異株を37°Cで一晩培養し、LB培地に100 μg/mLストレプトマイシンを添加し、50 μg/mLカナマイシンを含むLB培地で同じ条件下で別々に大 腸菌 を増殖させます。
   2. 細菌培養物を滅菌PBSで2回洗浄し、新鮮な抗生物質を含まないLB培地に再懸濁します。標準化のために_OD600 を1.0に調整します。
   3. WT、^R- 、およびΔtssM 変異株を 大腸菌 と1:1の比率で混合します。
   4. 混合細菌懸濁液の10 μLを抗生物質を含まないLB寒天プレートにスポットし、37°Cで6時間インキュベートします。
   5. 細菌の斑点をこすり落とし、1mLのPBSに再懸濁します。10倍段階希釈を5回行います。
   6. 希釈した細菌懸濁液10 μLをカナマイシンを含むLBプレート上にスポットし、37°Cで一晩インキュベートします。
   7. コロニーカウントにより、WT^R- およびΔtssM 変異株のT6SS依存性抗菌活性を解析します。
      注:実験エラーを避けるために、細菌懸濁液の完全混合を確認してください。データの信頼性を確保するために、各サンプルに対して少なくとも 3 回の独立した反復を実行します。
2. ルシフェラーゼ標識を用いたT6SS活性の定量的検出
   1. 大腸菌(ルシフェラーゼ)、WT^R-、ΔtssM変異体、およびその他の株(ATCC 17978、大腸菌、Ab#40、Ab#170、Ab#180など)のOD600を1.0に標準化します。抗生物質を含まないLB寒天培地を含む96ウェルプレートに5 μLの細菌懸濁液を加えます。暗所で自然乾燥させた後、ルシフェラーゼベースの生物発光を測定し、大腸菌(ルシフェラーゼ)の発光特異性を確認します。
   2. 大腸菌(ルシフェラーゼ)の5倍段階希釈を行います。希釈した細菌懸濁液の10 μLを、LB寒天培地と空の96ウェルプレート(どちらも耐光性)を入れた96ウェルプレートにスポットします。ルシフェラーゼベースの生物発光を測定して、ルシフェラーゼベースの検出法の感度を評価し、LB寒天が発光シグナルに干渉するかどうかを確認します。
   3. 大腸菌(ルシフェラーゼ)をWT^R-、ΔtssM変異体、および20の臨床株(OD₆₀₀は1.0に標準化)と1:1の比率で混合します。10倍に希釈し、5 μLを96ウェルプレートに加え、3回のテクニカルリピートを設定します。
   4. 暗所で風乾した後、生物発光を測定します。暗所で37°Cで4-6時間インキュベートした後、再度生物発光を測定します(発光波長:562nm)。
   5. 共培養前後の生物発光値を比較することにより、T6SS依存性抗菌活性を定量的に評価します。
      注:実験エラーを避けるために、細菌懸濁液の完全混合を確認してください。データの信頼性を確保するために、各サンプルに対して少なくとも 3 回の独立した反復を実行します。スチューデントのt検定を統計分析に使用します。
3. GFP標識を用いたT6SS活性の検出
   1. ルシフェラーゼ標識実験(励起波長:480 nm、発光波長:509 nm)と同じ手順で行ってください。
   2. 大腸菌(GFP)とWT、^R-、およびΔtssM変異体(OD₆₀₀は1.0に標準化)を1:1の比率で混合します。抗生物質を含まないLB寒天プレートに10 μLをスポットします。RTで風乾した後、多機能イメージングシステムのGFP蛍光チャンネル(Alex488プログラム、励起:488 nm、発光:509 nm)を使用して画像をキャプチャします。
   3. 暗所で37°Cで4〜6時間インキュベートした後、再度画像を撮影してください。細菌スポットの蛍光強度の変化に基づいてT6SS活性を評価します。
      注意: 蛍光信号との干渉を避けるために、すべての手順を暗闇で実行してください。実験ミスを避けるために、細菌懸濁液の徹底的な混合を確保してください。データの信頼性を確保するために、各サンプルに対して少なくとも 3 回の独立した反復を実行します。
4. フローサイトメトリー検出
   1. WT^R- と 大腸菌 (GFP)およびΔtssM 変異体と 大腸菌 (GFP)を1:1の比率で混合します。混合細菌懸濁液を適量取り、滅菌PBSまたは1×緩衝液を使用して適切な濃度(通常は_OD600000 〜0.1〜0.5)に希釈します。
      注:1×緩衝液はフローサイトメトリー染色緩衝液(1×)を指し、成分には以下が含まれます:1×PBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、pH 7.4)、2-5%(v / v)熱不活化FBS(または代替として1%BSA)、2 mM EDTA。
   2. 希釈した混合細菌懸濁液を300 x g で2分間遠心分離し、上清を廃棄します。ペレットを1 mLの滅菌PBSまたは1×緩衝液に再懸濁し、穏やかに混合します。再懸濁溶液を35 μmセルストレーナーでろ過して凝集体を除去し、単一セル懸濁液を確保します。
   3. フローサイトメーターの電源を入れ、レーザーを予熱し、装置を校正します。
      1. 検出パラメータを設定します:488nmレーザーを使用してGFPを励起します。検出チャンネル:FL1(通常、GFP蛍光検出用の530/30 nmフィルター)。前方散乱光(FSC)と側方散乱(SSC)のパラメータを設定して、細菌細胞を区別します。
      2. 標識されていない 大腸菌 をネガティブコントロールとして使用し、電圧とゲインを調整し、GFP陰性集団が蛍光シグナルのベースラインにあることを確認します。
   4. ろ過したサンプルを穏やかに混合し、100 μLをフローサイトメトリーチューブに移します。
      1. 次の装置設定を使用してサンプルを分析します:FSC-Hしきい値を19,000に設定してデブリを除外し、ゲイン値を100(FSC)、110(SSC)、および80(FITC)にします。
      2. ゲーティングでは、最初に FSC-A 対 SSC-A の散布図で破片と非ターゲット信号を除外し、次に FITC チャネルでポピュレーション解析を行います。各サンプルのターゲット母集団(FSC/SSC特性で定義)から最低10,000のイベントを取得します。
   5. フローサイトメトリーソフトウェア(FlowJo、BD FACSDivaなど)を使用してデータを解析します。
      1. FSCとSSCの散布図をプロットして、ターゲットの細菌集団をゲートします。FL1蛍光ヒストグラムをプロットして、GFP陽性集団とGFP陰性集団を区別します。
      2. GFP陽性細胞の割合と平均蛍光強度(MFI)を計算します。
   6. 残りの混合細菌懸濁液を300gで2分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを10 μLの滅菌水に再懸濁し、抗生物質を含まないLB寒天プレートにスポットします。
   7. 暗所で37°Cで5時間インキュベートした後、細菌の斑点をこすり落とし、1×PBSの500μLに再懸濁します。再懸濁溶液100μLを取って適切に希釈し、ステップ6.4.4〜6.4.5を繰り返してフローサイトメトリー検出を行います。
   8. 共培養前後のGFP陽性細胞の割合と蛍光強度を比較します。大腸菌(GFP)に対するWT^、R-、およびΔtssM変異体の殺傷効果を評価します。
      注:細胞凝集が検出結果に影響を与えないように、単一細胞懸濁液を確保してください。検出前に装置をキャリブレーションして、蛍光シグナルの精度と再現性を確保します。実験中は、GFP蛍光の消光を防ぐために、サンプルを強い光にさらさないでください。データの信頼性を確保するために、サンプルごとに少なくとも 3 回の反復を実行します。

Results

T6SS活性を検出する従来の方法では、通常、抗生物質を含まないLB寒天プレート上で捕食者と標的株を共培養し、その後、細菌の斑点を掻き取り、再懸濁し、段階希釈を行います。次に、希釈された細菌懸濁液を選択的な寒天プレート上にスポットします。翌日のプレート上の標的株のコロニーをカウントすることにより、T6SS活性を定性的に評価することができます。しかし、この方法には、煩雑な手順、手作業によるコロニーカウントへの依存、定量分析の難しさなどの制限があります。これらの欠点に対処するために、この研究では、蛍光ベースの定量検出法を革新的に導入します。具体的には、標的株( 大腸菌など)を蛍光タンパク質(GFPまたはルシフェラーゼ)で標識し、捕食者と標的株を1:1の比率で混合した後、希釈しました。共培養前後で、混合細菌懸濁液の蛍光値を測定し、 図1に示すように、蛍光値の変化に基づいてT6SS活性を定量的に評価しました。従来の方法と比較して、この蛍光ベースの検出アプローチには、操作の簡素化、定量結果、高い再現性などの利点があります。

Discussion

VI型分泌システム(T6SS)は、主にエフェクタータンパク質の分泌によって機能を実現する複雑なマルチタンパク質機構です。これらのエフェクタータンパク質は、他の細菌種を殺傷または阻害することにより細菌間の競争を媒介し、それによって宿主細菌に微生物群集における競争上の優位性を提供する¹⁵。競争におけるその役割を超えて、研究は、T6SSが細菌のコロニー形成、環境適応、バイオフィルム形成、接着修飾、および免疫回避を含むさまざまな細胞プロセスに関与していることを示している¹⁶。注目すべきは、T6SS機能の調節は多層的であり、転写、転写後、および翻訳後レベルでの複雑なメカニズムが関与していることである¹⁷。

T6SS研究の分野では、 Acinetobacter calcoaceticus と Acinetobacter baumannii が、そのユ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10%, 15% SDS-PAGE ゲル調製キット	Epizyme	PG112-20
°C冷凍庫	ハイアール	HYCD-290
37 °Cインキュベーター	Bluepard 181254254
4 °C冷蔵庫	ハイアール	HYC390-80
°C冷凍庫	ハイアール	DW-86L726G(726L)
96ウェルプレート	JET	TCP010096
寒天
過硫酸アンモニウム(APS)	Thermo	7727-54-0
生物学的安全キャビネット	ESCO	AC2-4S1
電子天び	Sartorius AG	BSA124S-CW
電気泳動装置	BIO-RAD	POWER
フレーク製氷機	GRANT	XB70
フローサイトメーター	BECKMAN COULTER	AW38143
フローサイトメトリー染色バッファー	タンパク質テック	PF00018
ゲルイメージングシステム	BIO-RAD	Gel Doc 2000
Glycine	Zike	ZK-L2577
高速遠心分離機	Eppendorf	5405IN106358
HRP標識ウサギ/マウス二次抗体	Proteintech	SA00001-2
LB Broth	Solarbio	L8291
低温高速遠心分離機	Thermo	17R
メタノール	サーモ	R40121
マイクロUV-Vis分光光度計	サーモ	ナノドロップワン
マイクロ遠心分離機	allsheng	Mini-6k
マイクロプレートリーダー	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDSサンプルバッファー	サーモ	NP0007
リン酸緩衝液(PBS)	Zike	ZK-L1649
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610374
SDS Sample Loading Buffer	Beyotime	poo15L
スキムミルク 粉乳	サーモ	LP0033B
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	Zike	zk6885
サーモスタットウォーターバス	JingHong	DK-420S
トランスファー装置	Bio-Rad	PowerPac HC
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Zike	ZK-L2557
縦型電気泳動装置	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra