非遺伝的光刺激によるCa2+ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

サマリー

光を使って心臓の細胞や組織を制御することで、非接触で刺激を受けることができるため、細胞の自然な状態や機能を保つことができるため、基礎研究や治療への応用に有用なアプローチとなっています。

要約

in vitro 心臓微生理学的モデルは、科学研究、医薬品開発、医療応用において高い信頼性を発揮します。科学界では広く受け入れられていますが、これらのシステムは非侵襲的な刺激技術がないため、寿命にはまだ限界があります。フォトトランスデューサーは、効率的な刺激方法を提供し、刺激プロセスにおける侵襲性を最小限に抑えながら、高い時間的および空間的分解能を備えたワイヤレスアプローチを提供します。この論文では、 in vitro 心臓微生理学的モデルの活性を刺激および検出するための完全光学的方法を紹介します。具体的には、3Dバイオリアクター懸濁培養で作製したヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)を播種することにより、人工的な層流異方性組織を作製しました。刺激には両親媒性アゾベンゼン誘導体である光変換器(Ziapin2)を使用し、システムの応答を監視するためにCa²⁺ 色素(X-Rhod 1)を使用しました。この結果は、Ziapin2が、組織の完全性、生存率、または挙動を損なうことなく、採用されたシステムにおけるCa2⁺ 応答を光調節できることを示しています。さらに、光ベースの刺激アプローチは、現在のゴールドスタンダードである電気刺激と比較して同様の解像度を提供することを示しました。全体として、このプロトコルは、心臓研究におけるZiapin2および材料ベースの光刺激の応用に有望な展望を開きます。

概要

生きた細胞や組織を刺激するための光の使用は、生物医学研究における重要なゲームチェンジャーとして浮上しており、正確な時間的および空間的分解能1,2,3,4,5,6を備えたタッチレス刺激機能を提供します。細胞を光に感受性にするために使用される主要な技術の1つは、光感受性イオンチャネルまたはポンプ^7,8を発現するように細胞を遺伝子改変することを含む光遺伝学である。このアプローチは、生体組織内の細胞の調節において印象的な効果を示しています。しかし、ウイルス遺伝子導入に依存しているため、研究や臨床応用での広範な採用が妨げられています。

この制限を克服するために、有機材料および無機材料は、非遺伝的な材料ベースの光媒介刺激技術を開発するための光感受性トランスデューサとして使用されてきた^9,10。有機ナノ構造光トランスデューサー11,12,13,14,15は、ニューロン、心筋細胞、骨格筋細胞など、さまざまなアプリケーションにわたって細胞応答を誘発することにおいて、最近顕著な成功を収めています。

ここでは、アゾベンゼン誘導体であるZiapin2^16,17,18を、人工層状心臓組織におけるCa²⁺の増殖を調査するために提案します。分子の両親媒性構造は、細胞原形質膜の正確な標的化を可能にし、一方、アゾベンゼンコアは光誘起異性化を可能にし、その立体配座変化をもたらす16,17,18。心細胞では、このトランスからシスへの異性化は、細胞膜の厚さを変化させ、活動電位を生成する一連の効果を誘発し、それが次に興奮収縮プロセス19,20,21を引き起こす。

さらに、心臓組織²²の異方性成長のための工学的プラットフォームの製造プロセスを説明し、その活性を光学的にトリガーおよびモニタリングするために使用される実験セットアップを詳述し、特に組織^23,24内の^Ca2+ダイナミクスを獲得することに焦点を当てる。最後に、取得した信号を、参照標準と考えられている電気刺激によって得られた信号と比較します。全体として、このプロトコルは、特に人工組織の文脈で、心臓細胞の挙動の理解を深めるための新しい光応答型トランスデューサーの応用を強調しています。

プロトコル

使用したヒト多能性幹細胞 (hiPSC) 培養液は、CAGrtTA::TetO-Cas9をAAVS1遺伝子座に導入して作製した、ドキシサイクリン (Dox) 誘導性CRISPR/Cas9系を持つ野生型ヒト男性iPS細胞株です (Addgene: #73500)。この研究は、Boston Children's Hospital Institutional Review Boardによって承認されたプロトコルに従って実施されました。インフォームドコンセントは、研究に参加する前に患者から得られました。hiPSC由来心筋細胞(hiPSC-CM)の作製は、前述の通りに誘導された^25,26。このプロトコルについては、次のセクションで簡単に説明します。

1. ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞の作製と作製

1. T75フラスコで培養したhiPSCをPBSで1回洗浄します。キレート剤Verseneと10〜15分間インキュベートして細胞を剥離し、10μM ROCK阻害剤Y-27632を添加したE8培地100 mL中の5,000万IPSC/容器の密度で非イオン性界面活性剤の1%溶液で前処理したバイオリアクター容器に播種します。
2. 次のバイオリアクターパラメータを設定します:攪拌60 rpm、温度37°C、pH 7、および3標準L / hでのオーバーレイガス(O₂ およびCO₂)。
3. 培養で1日後、胚様体(EB)の直径が100〜300μmに達したことを確認し、7μMのCHIR99021を含む塩基性RPMI培地(RPMI 1640培地にB27マイナスインスリンを添加したRPMI 1640培地)で細胞を24時間処理し、その後、さらに24時間培地をRPMIに変更します。5 μM IWR-1-endo を含む塩基性 RPMI 培地をさらに 48 時間追加して、心臓系譜への分化プロセスを開始します。48 時間後、メディアを基本 RPMI に戻します。
4. 分化の7日目に、1:1,000(v / v)ヒトインスリンを添加した基本的なRPMI培地で細胞を培養します。酸素消費量が30%を超える場合は、2日ごとまたは毎日50%の媒体交換でメディアをリフレッシュしてください。
5. 15日目に、HBSS、コラゲナーゼII(200ユニット/ mL)、HEPES(10 mM)、ROCK阻害剤Y-27632(10 μM)、 およびN-ベンジル-p-トルエンスルホンアミド(BTS、30 μM)を含むコラゲナーゼII溶液を使用して、バイオリアクター細胞を3時間酵素的に解離します。これを行うには、まず、分化したhiPSC-CM EBs 2xを予熱したHBSSで洗浄し、Collagenase II溶液(200 μlのEBs / 12 mlのCollagenase II溶液)で37°C、5% CO₂ で、完全なEB解離から単一細胞が現れるまでインキュベートします。
6. 同量のブロッキングバッファー(RPMI-1640、B27およびDNase IIを含まない、RPMI-1640のmLあたり6 μLのDNase II)をシングルセル懸濁液に添加して、解離反応を停止します。分化したhiPSC−CMをカウントし、遠心分離(200 × g、5分)し、細胞をイソプロパノール中で-80°Cで24時間凍結し、播種が行われるまで液体窒素タンクに移すことで、ダウンストリームアプリケーションの準備をします。

2. 工学的層状組織作製

1. 厚さ1mmの傷や紫外線に強い透明なアクリルシートに、白と青の2層の実験用テープを接着します。CO₂レーザー彫刻機を使用して、アクリルシートを円形(直径20 mm、12 MWに適合)にカットし、チップパターン(3 x 7.5 mmの正方形、チップごとに3つ)を、ベクターグラフィックスソフトウェア(CorelDrawなど)で設計したテープにカットします。アクリル切断パラメータ:100パワー、20スピード、1,000PPI。テープカットパラメータ:8つのパワー、6つのスピード、および1,000PPI。ピンセットを使用して最も内側の線の内側のテープの2つの層をはがし、チップを純粋な漂白剤に30〜1時間浸して切断による太い線と暗い斑点を取り除き、鋭い線を残し、ビーカーでチップを一晩または少なくとも3時間脱イオン(DI)水で洗い流します。
   注:2時間以上漂白剤を塗ると、側壁の接着剤がエッチングされ、ゼラチンが適切に付着するのを防ぎます。
2. チップを10分間超音波処理し、ライン溝の特徴(25μmの隆起幅、4μmの溝幅、および5μmの溝の深さ)を有するポリジメチルシロキサン(PDMS、Sylgard 184)スタンプをきれいな70%エタノールで30分間超音波処理します。チップとスタンプをフードの下のきれいな場所に移し、空気の流れで1~2時間乾燥させます。
3. ブタの皮から採取したゼラチン1g(ゲル強度~175gブルーム、タイプA)を50mLチューブに秤量します。5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、ゼラチンがすぐに溶解するように十分に混合します。チューブを65°Cのウォーターバスに30分間入れて、溶解プロセスを完了します。同様に、微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)1 gを別の50 mLチューブに秤量します。PBS12.5 mLを加え、十分に混合し、チューブを37°Cのウォーターバスに30分間入れて、MTGが完全に溶解することを確認します。
4. ゼラチンチューブを15分間超音波処理し、使用前に65°Cの水浴に戻します。キャップを少し緩めた状態でMTGチューブをデシケーターに入れ、バキュームをゆっくりとオンにします。真空下でMTG溶液から気泡が除去されるのを観察します。脱気後、MTGチューブを37°Cのウォーターバスに戻します。
   注意: プロセスを監視し、激しい沸騰を避けるために真空度を調整します。
5. グリッドシートをきれいなパラフィルムで覆い、チップをグリッドに置き、スタンプを近くに置いて使用できるようにします。5 mLのゼラチン溶液に5 mLのMTGを加え、泡を避けるために慎重にピペッティングします。次に、ゼラチンをチップにすばやくピペットで固定し、チップ領域を覆うのに十分な量(各約0.5mL)を使用します。次に、ラインパターンのPDMS²² (ライン幅25μm、高さ5μm、間隔4μm)スタンプを上に置き、200gの重りを適用して、ゼラチンが組織の縦軸と平行にパターン化されていることを確認します。すべてのチップが成形されたら、環境の乱れを避けるためにガラス瓶で覆い、一晩で架橋します。
   注:混合溶液ゼラチン-MTGを5分以内に使用してください。そうしないと、ゼラチンの架橋状態が高くなるため、ターゲットパターンが変化します。
6. チップとPDMSスタンプサンドイッチをPBSで満たされた新しいP150皿に移し、ゼラチンを30分から1時間水和させて、PDMSスタンプとチップの分離を促進します。チップの周りの余分な成形されていないゼラチンを取り除き、きれいなチップをPBSで満たされた新しいP150ディッシュに移します。PDMSスタンプを70%エタノールで保存します。
7. チップをエタノールに10分間ボンネットの下に浸して滅菌します。
   注:エタノールで10分を超えないようにしてください、長時間の曝露はゼラチンを変形させる可能性があります。
8. チップをPBSに移し、10分間浸し、3回すすぎます。培養培地中で20 μg/mLのフィブロネクチンと1:100に希釈した基底膜マトリックスを混合して、コーティング溶液を調製します(ウェルあたり約0.5 mL)。インキュベーター内でチップを37°Cおよび5%CO₂ で2時間、または4°Cで一晩コーティングします。
9. Y-27632 (10 μM) を含むRPMI培地で細胞 (8 × 10⁵ hiPSC-CMs^{per cm 2}) を解凍して播種し、24時間後にY-27632を含まないRPMIと交換します。
10. 細胞播種から3日後、ピンセットで白いテープをはがします。

3. 光変換器の合成と応用

注:Ziapin2は、以前に発表された手順^16,18に従って合成され、培養培地中のhiPSC−CMに直接投与された。

1. 25 μMのZiapin2を細胞培養物に加え、37°Cおよび5%CO₂ で7分間インキュベートします。
2. 余分な分子をやさしく洗い流し、新鮮な培養培地ですすいでください。

4. 生存率アッセイ

注:Alamar Blueは、細胞に浸透し、細胞の生存率を監視するための酸化還元インジケーターとして機能するレサズリンベースのアッセイです。レサズリンは生理学的緩衝液に溶解し、培養中の細胞に直接添加される深い青色の溶液が得られます。活発な代謝を持つ生細胞は、レサズリンをピンク色の蛍光性であるレソフリンに還元します。

1. 培養培地中の20 μg/mLフィブロネクチンと1:100に希釈した基底膜マトリックスでコーティングした96ウェルプレート内のプレート細胞。振とうして混合し、ウェル容量の10%に相当する量でアラマーブルーを各ウェルに無菌で加えます。
2. Alamar Blueで培養物を4時間インキュベートします。
3. 前述のように、光変換器とビヒクル(DMSO)で細胞を治療します。光ファイバー(シアン、470nm)を介して光刺激(1Hzパルス光を1分間)に加え、Ziapin2の内在化と光曝露がhiPSC-CMの生存率に及ぼす影響を評価します。
4. プレートリーダーで励起560 nm、蛍光590 nmで蛍光を読み取ります。

5. 人工心臓組織層流異方性の評価

注:このプロトコルは、免疫染色、共焦点顕微鏡法、および核分析²⁷を使用して、工学的層状心臓組織の異方性を評価するための体系的なアプローチを概説しています。

1. 基材をPBSで数回洗浄した後、0.05%(v/v)Triton X-100を含む4%(v/v)パラホルムアルデヒドをPBSに10分間固定します。
2. サンプルを5%(w / v)ウシ血清アルブミン(BSA)とPBSで30分間インキュベートすることにより、非特異的結合をブロックします。
3. サンプルをHoechst(1:500)と室温で1時間インキュベートします。
4. 顕微鏡スライドに埋込む前に、退色防止剤を使用してPBSで洗浄してください。スライドを一晩乾燥させ、イメージングするまで4°Cで保存します。
5. スピニングディスク共焦点顕微鏡を20倍の倍率で使用してサンプルを画像化します。FiJiプラグインであるOrientationJ Measure²⁸を使用して、セルの向きを決定します。

6. 光学マッピング記録

注:光学マッピングは、ゼラチン成形組織チップ上に播種したhiPSC-CM上で5日間の培養後に行いました。

1. このプロトコルに従うには、光学マッピング装置が、高速度カメラを備えた改造タンデムレンズ顕微鏡と励起光源である200mW水銀ランプで構成されていることを確認してください。指定されたCa²⁺ イメージングカメラの前にダイクロイックミラーを配置して、調製物が励起光にさらされていることを確認し、サンプルから放出される蛍光を収集します。
2. 2 μM X-Rhod 1を培養培地に添加してサンプルをインキュベートし、37°Cで30分間インキュベートします。
   注:色素の光退色を避けるために、画像取得中にのみサンプルを光にさらしてください。
3. セクション3で前述したように、光トラスデューサーをインキュベートします。
4. 新鮮な培養培地で洗浄し、チップをB27マイナスインスリンを添加したフェノールレッドフリーRPMI 1640培地に移します。
5. ティッシュチップを温度制御された皿に入れ、生理学的温度(37°C)で記録を開始し、2.5フレーム/秒のフレームレートで画像を取得します。
6. 光ペーシングの場合、LED光源(465/25 nm)を使用して組織の一端に光学点刺激を適用し、Ziapin2刺激を可能にします。組織から1mm離れた場所に配置された時間的に調整された光ファイバーを介して、0.5Hzまたは1Hzの周波数で組織のペースを調整します。電気ペーシングの場合は、長方形組織の最も遠位端の中央に配置されたバイポーラプラチナ電極を使用して点刺激を適用します。この配置により、Ca²⁺ 波の伝播は、長方形の短辺に対応する組織の幅の中点から発生するようになります。刺激は、0.5 Hzの周波数、振幅10 V、パルス幅100 msで適用する必要があります。
7. 録音後、3 x 3 ピクセル サイズの空間フィルターを適用して、信号対雑音比を改善します。
8. 各パルスの各ピクセルでのCa²⁺ 波伝導速度を決定し、x方向とy方向の両方に沿った変化率を計算します。これを行うには、これらの方向のCa²⁺ 信号強度の空間勾配を測定し、それを信号の伝搬の時間遅延に関連付けます。これらの指向性変化率を組み合わせることで、波が細胞フィールドを横切って両方の次元でどれだけ速く伝わるかを定量化します。

7. データのエクスポートと取り扱い

1. 参照されたソフトウェアでデータを抽出して分析します。
2. 3 x 3 ピクセルの空間フィルターを適用して、信号対雑音比を改善します。
3. Ca²⁺ トランジェント(CaT)トレースを、手動で選択した特定の関心領域(ROI)の平均として抽出します。
4. 50 x 50ピクセル(≈ 25 mm²)の中央関心領域(ROI)でCaTパラメータを測定します。
5. CaT ごとに、CaT 振幅、立ち上がり時間 (t_ピーク)、最大減衰勾配の時間 (Max Decay Slope)、および過渡減衰が 90% になるまでの時間 (Decay Time₉₀) を解析します。

8. 統計分析

1. 正規性検定などの適切な統計的検定を使用して分布の正規性を評価し、パラメトリックな方法とノンパラメトリックな方法のどちらを適用すべきかを判断します。
2. 連続データまたはカテゴリデータについて、スチューデントのt検定またはマン・ホイットニーのU検定を使用して、2つの条件間の統計的有意性をそれぞれ評価します。2つ以上のグループを比較する場合は、データの仮定に応じて一元配置分散分析またはKruskal-Wallis検定を使用し、その後に適切な事後検定を使用して有意なペアワイズ差を特定します。

結果

レーザーパターニング、ゼラチン成形、および細胞播種技術の組み合わせを使用して、人工層状心臓組織を作製するための多段階プロセスが開発され、実装されました。もともとはMcCainら²² とLeeら²⁴によって確立されたこの技術は、彼らのプロトコルに従って、人工的な層状微小組織を構築するために再実装されました。このプロセスでは、構造誘導のための精密なレーザーベースのパターニング、足場材料としてのゼラチン、生体模倣組織環境を作り出すための制御された細胞播種が統合されています。(図1)。

紙基板の成膜には、厚さ1mmのアクリル基板に白と青の2層のラボ用ラベリングテープを接着することで、後続のステップのための堅牢なベースを提供し、製造プロセス中の正確な視覚化と操作を可能にしました(図1A)。レーザーパターニングを採用して、基板上に目的のチップ形状を実現し、最適化されたパラメータによ...

ディスカッション

このアプローチは、心臓研究を前進させるための堅牢なプラットフォームを提供し、心臓組織の複雑なダイナミクスに関する洞察を提供し、新しい治療戦略につながる可能性のある長期的な in vitro 心臓機構研究の新たな可能性を開きます。この方法論を成功させるためには、人間の心臓の 生体内 条件を忠実に模倣した微生理学的環境を再現することが重要です。したがって、適切な電気伝導と収縮機能に不可欠な心臓構造の自然な異方性を再現するために、組織の設計と整列に細心の注意を払う必要があります。チップパターンの精密なレーザーカット、漂白剤処理のタイミング、ゼラチン溶液の粘度制御など、均一な組織型を作るためには重要な要素が必要です。さらに、フィブロネクチンとGelTrex(低成長因子の基底膜マトリックス)でチップを正確にコーティングすることは、細胞の付着を成功させ、その後の組織形成に不可欠です。

さらに、フォトアクチュエーター(すなわち、Ziapin2^16,18

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
alamarBlue 細胞生存率試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	DAL1025	細胞生存率アッセイ
B-27 サプリメント、インスリンを差し引いた	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1895601	細胞培養用
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A9056-50G	細胞染色用
BrainVision Analyzer ソフトウェア	Brain Products	https://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/	データのエクスポートと取り扱い
BTS	Sigma	203895-5MG
CHIR99021	Stem Cell Technologies	72054
クリアスクラッチおよびUV耐性アクリルシート、12インチ x 12インチ x 0.01インチ	McMaster Carr	4076N11	組織チップ製造
コラゲナーゼII型	ワージントン	CLS-2 / LS004176
DNase II	VWR	89346-540
エッセンシャル 8 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィ	A1517001	細胞培養用
フィブロネクチン	VWR	47743-654
ブタ皮ゲル強度 175 タイプA	シグマ-アルドリッチ	G2625-100G	組織チップ製造
ゲルトレックス LDEVフリー、hESC認定、低成長因子 基底膜マトリックス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1413302	コーティング
HBSS	サーモフィッシャー	14175-095
HEPES (1 m)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630080
ヘキスト 33342	ライフテクノロジー	H1399	細胞染色用
インスリン溶液 ヒト	Sigma Aldrich	I9278-5ML
IWR-1-endo	幹細胞技術	72564
パラフォルマデヒド 16% 水溶液 (PFA)	VWR	100503-917	細胞染色用
PBS、滅菌、500 mL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010049	組織チップ製造
リン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010049
プルロン酸F-127(DMSO中の20%溶液)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P3000MP	非イオン性界面活性剤
ROCK阻害剤 Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	サーモフィッシャーサイエンティフィック	61870127	細胞培養用
RPMI 1640 ミディアム、フェノールレッドなし	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11835030	オプティカルマッピング
Versene Solution	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15040066	キレート剤
VWR 汎用ラボラトリー ラベリングテープ	VWR	89098-058	ティッシュチップ製造
X-Rhod-1 AM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	X14210	オプティカルマッピング