方法論記事

骨髄細胞とCAR T細胞間の相互作用のin vitroおよびin vivoの研究

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DOI：

10.3791/68013

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2025年7月25日

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1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

この記事について

サマリー

ヒトCARTと骨髄細胞の間の相互作用を研究するために利用できる異種移植モデルが限られていることを考慮して、CART細胞に対するヒトマクロファージの影響を理解するために、 in vitro および in vivo モデルを確立しました。この発見は、腫瘍微小環境におけるマクロファージの役割を評価し、マクロファージを標的とした免疫療法をテストするために一般化できる可能性があります。

要約

キメラ抗原受容体 T (CART) 細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療において目覚ましい臨床的成功をもたらしました。ただし、ほとんどの患者は1〜2年以内に再発します。免疫抑制性骨髄細胞による T 細胞阻害など、CART 耐性につながるいくつかのメカニズムが特定されています。腫瘍微小環境 (TME) の単球とマクロファージが CART のパフォーマンスと臨床転帰の低下に寄与していることを示す証拠が増えています。ヒトマクロファージとCART細胞の間の相互作用を研究するための前臨床モデルは限られています。ここでは、in vitro とin vivoの両方でCART細胞に対するヒトマクロファージの影響を理解するためのアプローチについて説明します。免疫抑制性マクロファージがCART機能を阻害することを示すために、 in vitro 共培養モデルについて説明します。さらに、ヒトマクロファージと腫瘍細胞をNSGマウスに皮下生移植して、CART細胞や腫瘍細胞とのM2様マクロファージ相互作用を研究する異種移植モデルを報告しています。これらのモデルは、TME におけるマクロファージの役割を評価し、マクロファージを標的としたがん免疫療法をテストするために使用できます。

概要

自家キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、再発または難治性の血液悪性腫瘍の治療において臨床的成功を収めており、CD19またはB細胞成熟抗原(BCMA)を標的とする6つのCART製品の米国FDAの承認につながりました1。CART 細胞療法の優れた初期活性にもかかわらず、ほとんどの患者は治療後最初の 1-2 年以内に再発します2。最適ではないT細胞の適応度、抗原の逃避、CART持続性の低下、および免疫抑制性腫瘍微小環境(TME)2,3によって媒介される阻害など、CART耐性のいくつかのメカニズムが同定されています。単球やマクロファージなどの骨髄細胞は、しばしばTMEの重要な部分を構成し、T細胞を含む他の免疫細胞の主要な阻害剤であることが実証されています4,5。CART細胞の治療効果における骨髄細胞の有害な影響は、前臨床モデルおよび血液腫瘍と固形腫瘍の両方の臨床試験で報告されています3,6。骨髄系阻害は、CART製造プロセスの最初から発生する可能性があり、開始アフェレーシス産物中の単球がex vivo CARTの拡大を阻害することが実証されています7,8。骨髄性介在性CART阻害の証拠が蓄積されていることを考えると、多くの研究は、より良い免疫応答のためにTMEの免疫抑制性マクロファージを標的にして排除するようにCART細胞を操作することを目的としています5。しかし、CART細胞と免疫抑制マクロファージとの相互作用の背後にあるメカニズムはまだ完全には解明されていません。さらに、これらの相互作用の公開されている異種移植モデルは限られています。したがって、ヒトマクロファージとCART細胞の間の相互作用をin vitroモデルとマウスモデルの両方で研究するモデルが緊急に必要とされています。

ここでは、ヒトCD19標的CART(CART19)細胞をCD19+ 腫瘍細胞および ex vivo 分極M2様マクロファージと共培養する方法について説明します。さらに、免疫不全マウスに標的細胞とヒトマクロファージの両方を皮下に生着させた異種移植マウスモデルを報告し、免疫抑制性マクロファージを用いた環境で関心のある免疫療法の評価を可能にします。具体的には、免疫抑制性マクロファージの有無にかかわらず、in vitroでCART抗原特異的増殖を解析し、トランスウェルプレートと直接共培養プレートの両方でT細胞増殖の有意な阻害を示しました。私たちの異種移植モデルでは、NSGマウスに腫瘍細胞とヒトマクロファージを皮下生着させ、治療スクリーニングのためにマトリゲルに懸濁しました。この動物モデルは、 ex vivo で分化した免疫抑制性ヒトマクロファージがNSGマウスの腫瘍進行を促進できることをうまく示しました。このプロトコルに従うことで、低分子医薬品、生物学的製剤、その他の細胞ベースの治療法を含む、免疫抑制性マクロファージ標的治療薬の有効性をテストできます。ただし、ヒトTMEの研究に免疫不全マウスを使用することには限界があるため、提案されたモデルは概念実証研究に最適です。

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プロトコル

以下のプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会 (IRB)、施設バイオセーフティ委員会 (IBC)、および施設動物管理および使用委員会のプロトコル A00001767 に基づく比較医学部門のガイドラインに従っています。

1. in vitro 研究のためのヒト古典的単球の調製

  1. 前述のように、健康な献血者から末梢血単核球 (PBMC) を分離します9















  8. figure-protocol-1









  19. figure-protocol-2




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結果

このプロトコルの目的は、相互作用の複雑な性質とダイナミクス、および限られた既存の異種移植モデルのために、ヒト免疫抑制マクロファージとCART細胞の間の相互作用を研究するための in vitro および in vivo モデルの両方を確立することです。プロトコルに従って、単離されたヒト古典的単球を分化させてM2様表現型を獲得し、機能的に免疫抑制性になります。

単離されたヒト古典的単球の純度を確認するには、染色サンプルをフローサイトメーターで実行し、ヒトCD14 + CD16-集団のゲーティングによって分析します(図3A-B)。単球単離が成功すると、生細胞親集団から少なくとも 90% の CD14+CD16- 集団が得られます。分化したM2様マクロファージの表現型を分類して確認するために、M0マクロファージとM2様マクロファージを比較すると、CD163低

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ディスカッション

CART 細胞療法は、血液悪性腫瘍患者のサブセットの治療において多くの臨床的成功を示していますが、ほとんどの患者は CART 注入後 1-2 年以内に再発します1,2。さまざまな潜在的なCART耐性メカニズムが同定されており、免疫抑制性骨髄細胞がTME免疫抑制およびその後のCART失敗に重要な役割を果たすことがわかっています3,4,5,6,7,8。研究により、免疫抑制性マクロファージを標的とし、全体的な抗腫瘍効果を改善するように CART 細胞が操作されています<...

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開示事項

SSKは、ノバルティス(メイヨークリニック、ペンシルベニア大学、ノバルティスの間の契約を通じて)、マスタングバイオ(メイヨークリニックを通じて)、およびセンデロ(メイヨークリニックを通じて)にライセンス供与されたCAR免疫療法分野の特許の発明者です。RLSとSSKは、CAR免疫療法の分野における特許の発明者であり、Humanigenに(Mayo Clinicを通じて)ライセンス供与されています。KY、RLS、TH、BK、ES、およびSSKは、Immixにライセンス供与されているCAR免疫療法分野の特許の発明者です。SSKは、Kite、Gilead、Juno、BMS、Novartis、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis/Viracta、LifEngine Animal Health Laboratories Inc.、Incyte、Lentigenから研究資金を受けています。SSKは、Kite/Gilead、Humanigen、Juno/BMS、Capstan Bio、Novartisとの諮問会議に参加しています。SSKは、HumanigenとCarismaのデータ安全および監視委員会の委員を務めてきました。SSKは、Torque、Calibr、Novartis、Capstan Bio、Carisma、Humanigenのコンサルタントを務めてきました。

謝辞

この研究は、メイヨークリニック総合がんセンター(SSK)、メイヨークリニック個別化医療センター(SSK)、メイヨークリニック再生バイオ医薬品センター(SSK)、国立衛生研究所助成金R37CA266344-01(SSK)、および国防総省助成金CA201127(SSK)を通じて部分的に資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5mLシリンジフィッシャーサイエンティフィック329461
1.5 mLマイクロ遠心チューブエッペンドルフ1415-2508 
15 mLコニカルチューブコーニングライフサイエンス352097
24ウェルトランスウェルプレート(0.4 & μ;m)コーニングライフサイエンス3397
50 mLコニカルチューブコーニングライフサイエンス352098
APC/Cy7 結合抗ヒト CD206バイオレジェンド321119フロー抗体
APC結合抗ヒトCD14バイオレジェンド325607フロー抗体
APC結合抗ヒトCD3バイオレジェンド344811フロー抗体
autoMACSすすぎソリューションミルテニー・バイオテック130-091-222古典的単球単離バッファー 
基底膜マトリックスコーニングライフサイエンスCLS356237可溶化基底膜マトリックス
細胞培養培地10%ヒトAB血清1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンX-VIVO中の15無血清造血細胞培地
古典的単球単離キット、ヒトミルテニー・バイオテック130-117-337
CytoFLEXシステム B5-R3-V5ベックマン・コールターC04652フローサイトメーター
D-ルシフェリンゴールドバイオテクノロジーラック-1G
D-PBS(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)ギブコ14190250 
眼軟膏サーモフィッシャー19-090-832
FACSバッファPBS中の2%FBS1%アジ化ナトリウム
ウシ胎児血清コーニングライフサイエンス35-011-CV
平底96ウェルプレートコーニングライフサイエンスCLS3997
熱不活化プールヒトAB血清 革新的な研究4931
ヒトTruStain FcX(Fc受容体遮断液)バイオレジェンド422301
イソフルラン液体  ピラマルファーマリミテッド66794-017-10
IVIS Spectrum In Vivoイメージングシステムパーキンエルマー124262
JeKo-1細胞株培地10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン、RPMI-1640 培地中
ライブ/デッド固定可能なアクアデッドセル染色キット、405 nm励起用インビトロゲンL34966
LSカラムミルテニー・バイオテック130-042-401負のビーズ選択
リンパ球菌幹細胞技術07811密度勾配媒体
MACS BSAストックソリューションミルテニー・バイオテック130-091-376古典的単球単離バッファー 
AF546 と結合したマウス抗ヒトCD206抗体;サンタクルーズバイオテクノロジーSC-376232
頷く。cg-prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスジャクソン研究所 5557
PE結合抗ヒトCD16バイオレジェンド302007フロー抗体
ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(100x)、液体ギブコ10378-016
PerCP結合抗ヒトCD163バイオレジェンド333625フロー抗体
AF647 と結合したウサギ抗ヒトiNOS抗体;プロテインテックCL647-18985
組換えヒトGM-CSF幹細胞技術78015
RPMI-1640 ミディアムギブコ11875093
セプメイト-50 体外診断用幹細胞技術85450密度勾配遠心化によるPBMC単離 
アジ化ナトリウム、5%(w / v)リッカケミカル7144.8-16
組織培養処理48ウェルプレートコーニングライフサイエンス3548
Vi-cell XR細胞生存率分析装置ベックマン・コールターセルカウンター
X-VIVO 15 無血清造血細胞培地ロンザ04-418Q

参考文献

  1. Yun, K., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Who wins the combat, CAR or TCR. Leukemia. 37 (10), 1953-1962 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. New England J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  4. Kiss, M., Caro, A. A., Raes, G., Laoui, D. Systemic Reprogramming of Monocytes in Cancer. Fronti Oncol. 10, (2020).
  5. Rodriguez-Garcia, A., et al. cell-mediated depletion of immunosuppressive tumor-associated macrophages promotes endogenous antitumor immunity and augments adoptive immunotherapy. Nat Commun. 12 (1), (2021).
  6. Kankeu Fonkoua, L. A., Sirpilla, O., Sakemura, R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. CAR T cell therapy and the tumor microenvironment: Current challenges and opportunities. Mol Ther Oncolyt. 25, 69-77 (2022).
  7. Stroncek, D. F., et al. Elutriated lymphocytes for manufacturing chimeric antigen receptor T cells. J Trans Med. 15 (1), (2017).
  8. Stroncek, D. F., et al. Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells. Cytotherapy. 18 (7), 893-901 (2016).
  9. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  10. Ali, L. R., et al. PD-1 blockade and CDK4/6 inhibition augment nonoverlapping features of T cell activation in cancer. J Exp Med. 220 (4), e20220729(2023).
  11. Wang, T., et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of SARS-CoV-2-Infected Cynomolgus Macaque at Early Stage. Front Immunol. 13, 954121(2022).
  12. Ruella, M., et al. Overcoming the immunosuppressive tumor microenvironment of Hodgkin lymphoma using chimeric antigen receptor T cells. Cancer Dis. 7 (10), 1154-1167 (2017).
  13. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunol Res. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Smith, A., et al. A Novel Three-Dimensional Skin Disease Model to Assess Macrophage Function in Diabetes. Tissue Eng Meth. 27 (2), 49-58 (2021).
  16. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  17. Ajith, A., et al. Humanized Mouse Model as a Novel Approach in the Assessment of Human Allogeneic Responses in Organ Transplantation. Front Immunol. 12, 687715(2021).
  18. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Exp Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  19. Hickman, D. L. Minimal Exposure Times for Irreversible Euthanasia with Carbon Dioxide in Mice and Rats. J Am Assoc Lab Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  20. Zhou, R., Mei, L. Neural Development: Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2013).
  21. Gutierrez-Ruiz, O. L., et al. Ectopic expression of DOCK8 regulates lysosome-mediated pancreatic tumor cell invasion. Cell Rep. 42 (9), 113042(2023).
  22. Kirkiles-Smith, N. C., et al. Development of a Humanized Mouse Model to Study the Role of Macrophages in Allograft Injury. Transplantation. 87 (2), 189-197 (2009).
  23. Chuprin, J., et al. Humanized mouse models for immuno-oncology research. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 192-206 (2023).
  24. Yun, K., et al. Intrinsic immunosuppressive features of monocytes suppress CAR-T19 through IL-1 pathway modulation in mantle cell lymphoma. Mol Ther Oncol. 33 (2), 200985(2025).

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in vitro in vivo

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