関節の生体内画像診断は、白血球の移動挙動や炎症関節内の分子動態を明らかにする貴重な技術です。ここでは、タイプIIコラーゲン誘発性関節炎(CIA)のマウスモデルを用いた関節のin vivo画像診断の詳細なプロトコルを提示します。
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この記事について
サマリー
要約
白血球は骨髄由来の血液媒介細胞で、炎症を媒介するために組織内に移動しなければなりません。したがって、この移動を制御することは、炎症を軽減するための新たな治療戦略の開発にとって重要なポイントとなります。従来のエンドポイント研究では、 生体内での白血球の移動行動を完全に解明することはできませんでした。しかし、近年の画像技術の進歩により、生きた動物における免疫細胞移動に関する前例のない洞察が得られ、免疫細胞輸送の分子制御の理解が大きく深まりました。
ここでは、マウスタイプIIコラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルを用いた関節の in vivo 画像診断の詳細なプロトコルを提示します。マウスには完全なフロイント佐剤で乳化されたタイプIIコラーゲンで免疫され、関節炎の進行は臨床スコアリングと足の厚さ測定で監視されます。関節炎の最盛期には、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスで共焦点顕微鏡を用いて生 体内 で観察し、野生型マウスでは蛍光標識抗体と高分子量デクトレンを静脈注射して血管染色を行っています。関節の慎重な外科的露出、アガロースの塗布、脚の適切な位置調整により、通常数時間続く安定した長期画像撮影が可能です。このアプローチにより、炎症を起こした関節内の白血球停止、這い歩き、経内皮移動のリアルタイム解析が可能になります。
このプロトコルは、関節炎やその他の炎症性疾患における白血球輸送を調査する研究グループにとって有益です。また、免疫細胞移動を標的とした治療の前臨床評価のプラットフォームとしても機能する可能性があります。
概要
白血球は骨髄由来の血液媒介細胞であるため、炎症を引き起こすために組織に入り込む必要があります。この過程の制御は、炎症を緩和するための新たな治療法が開発される重要なポイントです。一般的に、白血球が炎症組織に流入するのは毛細血管静脈後で起こり、血管壁による自由流動白血球の捕捉から始まる癒着カスケードに続きます。さらに、この過程の後には、白血球が血管壁に沿って流れの方向に転がり、内皮に白血球が停止し、癒着から解放され、血管表面のあらゆる方向に這い回って、組織内の特定の位置への経内皮移動(TEM)受容部位を特定することになります1,3。
これらの異なる段階は、セレクチン(転がり)、インテグリン(停止、這い回り)、化学誘引剤(CA)(停止、場合によっては這い回り、TEM)などの分子信号の組み合わせによって調節されます3。CAは7つの膜を貫通するGタンパク質結合化学誘引受容体(CAR)を介して白血球を活性化し、インテグレイン親和性をアップレギュレーションして停止させ、TEMを誘導することで接着カスケードに重要な役割を果たします。しかし、TEMの正確なメカニズムはまだ完全には解明されていません。従来のエンドポイント研究や in vitro 実験では、CA-CARシグナル伝達が 生体内で白血球の移動行動をどのように動的に調節するかについての洞察が得られていません。
近年の画像技術の進歩により、生きた動物における免疫細胞移動に関する前例のない洞察が得られ、免疫細胞輸送の分子制御に関する理解を大きく深めました 4,5,6。 例えば、この技術は熱肝損傷7やレーザー皮膚損傷8などの組織炎症部位への好中球輸送の分子制御を明らかにしました。したがって、我々は関節炎部位への好中球輸送を制御する分子メカニズムの調査に応用しました。ここで述べた生体内関節画像診断により、補体成分C5a受容体1(C5aR1)が好中球の関節内皮への接着を開始し、関節内の炎症を引き起こす上で重要であることが明らかになりました。C5aR1はインテグリン依存性好中球の停止と拡散を促進し、その後ロイコトリエンB4受容体を介したTEMとCCケモカイン受容体1(CCR1)による這い進みが続きました。CXCケモカイン受容体2(CXCR2)は炎症関節における好中球TEMの後期段階で役割を果たしました。さらに、in vivo関節画像診断では、関節内のタイプIII過敏反応における新たなパラダイムが明らかになりました。ここでC5aは炎症の開始因子として機能し、組織に常駐する細胞は現在のタイプIII過敏反応のパラダイムにおいて炎症により重要な役割を果たしています10,11。
さらに、関節の in vivo イメージングを応用し、関節内のC5aの分子動態を研究しました。野生型マウスではC5aが関節組織に負荷をかけられ、血管腔内に迅速に輸送されたが、C5aR2欠損マウスではC5aは滑膜組織内に完全に留まった。これらのデータは、C5aR2が関節内皮に発現し、C5aaを血管腔内に運搬させることを示しており、これはC5aR1依存性好中球の接着に必要であることを示しています。13。
関節の生体内画像診断は炎症性関節炎のすべてのモデルに適用可能であり、通常数時間の長期観察が可能ですが、使用する顕微鏡によっては深部組織(>1 mm)の可視化が制限される場合があります。この技術を総合すると、白血球の移動行動や炎症関節内の分子動態を調査する強力なツールとなります。このプロトコルは、炎症を起こした関節の過程を研究する研究グループを支援するために、生体内関節画像診断のプロトコルを共有しています。
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プロトコル
すべての動物実験は、セントマリアナ大学医学部の施設動物ケア・利用委員会(承認番号)によって承認されました。TG240926-2およびTG250801-2)は、機関および国家のガイドラインに従って実施されました。
1. 関節炎のマウスモデルの製作
注:関節炎の動物モデルは、疾患の病因理解や新療法の開発に貴重なツールを提供してきました14。関節炎のマウスモデルにはそれぞれ独自の利点と限界がありますが、タイプIIコラーゲン誘発性関節炎(CIA)はリウマチ性関節炎(RA)の病因に関する研究に広く用いられています14。このセクションでは、CIAモデルの関節炎プロトコルについて説明します(器具および器具は 図1に示されています)。
- 牛のタイプIIコラーゲンを0.05 Mの酢酸(最終濃度4 mg/mL)で希釈し、4°Cで一晩振って調製します。
- 乳剤を作るには、コラーゲン希釈(4 mg/mL、0.05 Mの酢酸)と完全なフロイント助剤(CFA)をガラスシリンジ内で1:1の割合で混ぜます。これにより、乳剤中の最終コラーゲン濃度は2 mg/mLとなります。手で約20分間激しく混ぜます。この工程で熱が発生するので、乳剤を入れたガラスシリンジを氷の上で冷やします。準備中に乳剤の濃度を確認するためにビーカーを使ってください。
手記。残ったコラーゲン希釈は-80°Cで保存してください。 これは2回目の予防接種に使うことができます。 - 乳剤を1mLのガラス注射器に移し、26 x 1/2 Gの針を装着し、免疫ができるまで氷で保管します。
- 8週間齢のDBA1/Jマウス(オスまたはメス)にメデトミジン(0.3 mg/kg)、ミダゾラム(4 mg/kg)、ベトルファレ(5 mg/kg)の腹腔内注射で麻酔します。
手記。トランスジェニックマウスはしばしばC57BL6の背景を持っています。チキンコラーゲンは通常、C57BL6マウスのCIAに使われます。しかし、C57BL6マウスにおけるCIAの発生率と重症度はDBA/1Jマウスよりも低いです。C57BL6背景でトランスジェニックマウスを使用する場合、CIAの発生率と重症度を評価するパイロットスタディの実施を検討してください。 - 予防接種の準備として、バリカンを使って尾の周りの毛を剃りましょう。
- 尾部の尾部近く(図2)に、コラーゲン200μgを含む乳剤100μLの体積をゆっくりと注入します(図2)。
- 21日目にステップ1.2から1.6を繰り返し、2回目の予防接種を行います(図2)。
2. 関節炎の臨床スコア評価および足の厚さ測定
注:関節炎の臨床スコアリングと足の厚さ測定は、疾患活動を評価する上で不可欠です。通常、関節炎の臨床スコアリングや足の厚さ測定は、初回予防接種後1〜3日ごとに行われます。
- 関節炎臨床スコア:各マウスの4本の足のスコアの合計を記録します。以下のスコアリングシステムを使用してください:
0 = 正規
1 = 紅斑および片指の腫れ
2 = 2本の指の紅斑と腫れ、または足首関節の紅斑と腫れ
3 = 紅斑および3指以上の腫れ、または2本指と足首関節の腫れ
4 = 紅斑および足首、足、指の重度の腫れ、変形。
手記。腫れた足首関節とは、足の厚さが4mmを超えることを指します。 - 足の厚さ測定:デジタルスライドキャリパーを使って各足の厚さを測定します。各マウスの4本の足の平均的な足の厚さを使いましょう。
3. 関節の 生体内 イメージング
注:関節の in vivo 画像診断により、白血球が関節に移動する様子を観察し、生きたマウスの組織内での挙動を解析できます。細胞の可視化には、特定の細胞内で蛍光タンパク質を発現させるように遺伝子操作されたトランスジェニックマウスや、抗細胞マーカー抗体を静脈注射したマウスが用いられます。使用された供給品は 図3に示されています。
- 関節剤系マウスにはメデトミジン(0.3 mg/kg)、ミダゾラム(4 mg/kg)、ベトルファレ(5 mg/kg)で腹腔内麻酔を行います。
- ネズミの脚はバリカンで剃り、脱毛クリーム(<60秒)を使って残った毛を取り除きます。皮膚の刺激を防ぐために長時間の塗布は避けてください。
- クリームは湿ったガーゼで除去します(図4A)。イメージング領域に望ましくない自己蛍光を防ぐために、すべての毛髪を除去してください。必要に応じて繰り返します。
- 麻酔中は両眼に無菌角膜潤滑剤を塗布し、角膜乾燥や潰瘍を防ぎます。
- 外科用スコープで、マイクロシザーズを使って皮膚に沿って1cmの切開を入れます(図4B)。
手記。このステップは非常に重要です。手術は白血球(特に好中球)のリクルートを引き起こすことがあります。アーティファクトの原因となる損傷は避けてください。関節炎性関節の血管新生により、これらの関節は出血しやすいです。手術を成功させるには複数回の練習セッションが必要になる場合があります。 - 関節炎の関節をプラスチックプレートに位置付けます(図4C)。
手記。組織接着剤を使ってネズミの脚を固定することができます。この研究では、粘土を使ってガラススライドをプラスチックプレートに固定します。 - 画像領域に約1mLの1.5%アガロースとリン酸緩衝生塩水(PBS)を塗ります(図4D)。
手記。組織損傷を防ぐために、アガロースが冷却されていることを確認してください。損傷によって画像領域への白血球の動員が促進される可能性があります。 - 顕微鏡の舞台を整えてください。
手記。長時間の画像撮影中は、温熱パッドを使ってマウスの体温を維持しましょう。 - 共焦点顕微鏡の設定(レーザー出力、ゲイン、オフセット、位置など)を調整します。ここでは、25の水浸対物レンズNA 1.1を使った共焦点顕微鏡でイメージングを行います。レーザー励起を488 nm、561 nm、640 nmに設定し、発光を488.0 nm、561.6 nm、638.5 nmで収集します。
- 顕微鏡のスキャン速度を確認してください。ピクセル解像度512×512、5つの光学断面、4μmのZスタック、15秒のサイクルタイムを用いて、十分な時間をかけて個々の運動セルを解析し、意味のあるデータを得られます。
- 適切な場所が特定されたら、画像取得を開始します。
手記。抗細胞マーカー抗体を使って白血球を標識する場合は、画像検査開始の3分前に抗体を静脈注射してください。血管の可視化には、Qdots、CD31抗体、またはデクトロンを同時に注射してください。例えば、好中球用にLy6G、T細胞用にCD4をマウス1人あたり約2μg、血管染色用に680〜250kデクトレンを約80μg注射します。抗体とデクトランは通常、100μLの無菌PBSに溶解されます。一部の抗体は白血球を減少させる可能性があるため、選択された抗体が白血球数を減少させないか確認してください。 - NIS-Elements画像解析ソフトウェア(バージョン6.20.00)のGeneral Analysis 3(GA3)モジュールを使用して、共焦点顕微鏡で取得したND2ファイル画像を処理します。血管領域の抽出と背景的減算を行います。すべての時間枠の処理が終わったら、画像をビデオとしてエクスポートします。
手記。分析の一環として、粘着細胞や滲出細胞の数を数えます。 - 画像診断終了後は、生存のための回復を認めるか、実験設計によって人道的に安楽死させるかのいずれかです。生存を意図する場合は、手術部位を優しく閉鎖し、施設の動物ケアガイドラインに従って適切な術後ケアを提供します。
注:本研究では、すべての動物が画像検査直後に機関および国のガイドラインに従い人道的に安楽死されました。
4. 統計解析
- 平均±標準誤差(SEM)としてデータを提示します。2群比較には学生のt検定、複数群では一方向ANOVAを用いて統計解析を行い、その後Tukeyの事後検定を行います。p値<0.05を統計的に有意なものと考えます。
注:すべての解析はGraphPad Prismバージョン10を使用して行われました。
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結果
ここでは、生後8週齢のオスDBA/1Jマウスを、0日目と21日目に1:1の比率で牛II型コラーゲンとCFAを含む乳剤で免疫接種しています。関節炎の臨床スコアリングと足の厚さ測定は、0日目から42日目までの1〜3日ごとに行われます。通常、関節炎の発症は28日目頃に観察され、関節炎の臨床スコアと足の厚さは35日目頃にピークに達します(図5A-C)。DBA/1JマウスにおけるCIAの発生率は通常、35日目までに90〜100%を超えます(図5A)15。
対照的に、生後8週齢のオスC57BL6マウスは、鶏タイプIIコラーゲンとCFAを含む乳剤で、0日目と21日目に1:1の比率で免疫接種を受けました。CIAを持つC57BL6マウスの関節炎の発症とピークは、CIA
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ディスカッション
関節の生体内イメージングは、従来のエンドポイント研究とは異なり、生きたマウスにおける動的な生物学的プロセスに関する前例のない洞察を提供します。例えば、この技術により、C5aR1、BLT1、CCR1、CXCR2という4つの異なる化学誘導受容体がどのように協力して関節炎中の炎症関節への好中球の動員を開始するかを理解することができます。10,11。さらに、in vivo画像診断により、C5aR2が組織から血管腔へC5aを輸送する新たな機能的役割が明らかになりました。
しかし、この方法を使う際には考慮すべき重要なステップと制限があり、以下に詳述します。(i) 外科的課題:手術は特に好中球を関節に動員させる白血球を引き起こすことがあります。さらに、関節炎性関節は血管新生により出血しやすいです。損傷や出血によるアーチファクトを最...
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開示事項
Y.M.は中外製薬株式会社から助成金・研究支援を受けました。
謝辞
Y.M.の活動は、日本学術振興会(JSPS)KAKENHI(助成金番号JP22K08531、JP25K02574年)の支援を受けています。日本医療研究開発機構(AMED)[助成金番号25bm1423033];持田医学・製薬研究記念財団、JCR研究推進助成金(JCR FRONTIERおよび三菱財団向け研究助成金)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 29 G x 1/2インチ | 照も | SS-10M2913 | |
| 0.1 M 酢酸 | 富士フイルム | 016-18835 | |
| 1mLのプラスチックシリンジ | ページのトップへ | 19531 | |
| グリース用に1mmのシリンジ | 照も | SS-01T | |
| 18 G x 1 1/2インチ | 照も | NN-1838R | |
| 26 G x 1/2インチ | 照も | NN-2613 | |
| 680〜250 kDaのデキストラン | バイオティウム | 80135 | |
| アガロース | インビトロジェン | 16520-100 | |
| 牛タイプIIコラーゲン | コラーゲン研究センター | K42 | |
| 粘土 | デビカ | 93186 | |
| 完全なフロイントs補佐(CFA) | コンドレックス | 7001 | |
| 共焦点顕微鏡 | ニコン | A1 | |
| カバーガラス | 松波グラスIND.,Ltd | C024401 | |
| デジタルスライドキャリパー | 光俊 | 500-180-30 | |
| ファルコンチューブ(15 mL) | コーニング | NA | |
| ファルコンチューブ(50 mL) | コーニング | NA | |
| FITC結合抗マウスLy6G抗体 | バイオレジェンド | 127606 | |
| 鉗子 | ロボズ | RS-5070 | |
| 鉗子 | ナポックス | MA-48-2 | |
| ガラス製シリンジとコネクター | 翼工業株式会社およびnbsp; | シーズン7P | |
| グリース | 東レイ・ダウ コーニング・シリコーン | NA | |
| ヘアクリッパー | ワール | WA5109 | |
| ヘアクリッパー | ワール | 9966 | |
| 脱毛、クリア、クレイブ、私 | クラシエ | 該当なし | |
| メデトミジン | 明治 | 該当なし | |
| マイクロシザーズ | ロボズ | RS-5610 | |
| マイクロシザーズ | ロボズ | RS-5630 | |
| ミダゾラム | サンドズ | 該当なし | |
| 湿ったガーゼ | 日本製紙クレシア株式会社 | S-200 | |
| NIS-Elements画像解析 2000年6月20日 | ニコン | NA | |
| ファルコンチューブ中のPBS(50 mL) | 島津診断株式会社 | 5913 | |
| PE結合抗マウスCD4抗体 | バイオレジェンド | 100408 | |
| プラスチックプレート | コーニング | 351029 | |
| プリズム 10.3.1 | グラフパッド | NA | |
| スライドグラス | ムトピュアケミカルズ株式会社 | 5115 | |
| 手術用スコープ | オリンポス | VMZ | |
| 組織結合 | 3歳 | 1469SB | |
| Vetorphale | 明治 | 該当なし |
参考文献
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